白蚁属于昆虫纲的蜚蠊目，是主要的社会性昆虫之一^[1]。白蚁广泛分布于热带和亚热带地区，几乎遍布地球陆地表面积的一半以上，在全球物质循环尤其是碳循环代谢中发挥重要作用^[2-3]。白蚁肠道有多种共生微生物，包括细菌、古菌、真菌和原生动物如鞭毛虫，通常根据后肠是否有鞭毛虫将白蚁分为低等白蚁和高等白蚁两大类^[4-5]。目前总共有3 000多种白蚁，在分类学上将其分为7个科，其中低等白蚁含有6个科，分别为原白蚁科(Termopsidae)、草白蚁科(Hodotermitidae)、木白蚁科(Kalotermitidae)、澳白蚁科(Mastotermitidae)、鼻白蚁科(Rhinotermitidae)和齿白蚁科(Serritermitidae)，合计约占白蚁种类的25%；高等白蚁只有一个科为白蚁科(Termitidae)，占白蚁种类的75%^[2-3]。培菌白蚁(fungus-growing termites)是属于白蚁科(Termitidae)大白蚁亚科(Macrotermitinae)的一类白蚁，因为与鸡枞菌属(Termitomyces)真菌共生而得名^[6-7]。培菌白蚁通过白蚁自身、肠道微生物和外部共生真菌的协同作用，具有更高效地消化降解食物的能力，因而引起研究者们的广泛兴趣。培菌白蚁取食木质碎屑，经过肠道的初步消化排出形成菌圃(fungus comb)，菌圃上生长小白球真菌。菌圃和生长的真菌都可为白蚁提供丰富的营养物质^[8]。白蚁取食菌圃和小白球真菌后排出粪便^[9]。关于白蚁肠道微生物多样性已有比较多的研究^[10-14]，但是菌圃和白蚁粪便微生物多样性的报道较少^[15-16]，尚无粪便微生物多样性的分析。为了了解培菌白蚁菌圃(初级粪便)和最终粪便的微生物种类和丰度，本研究采用高通量测序方法，对黄翅大白蚁菌圃和粪便两个样本的16S rRNA基因和ITS序列进行分析，以期了解两个样本的细菌和真菌种类组成和多样性，为更深层次地解析培菌白蚁食物消化降解机制提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 白蚁样品

培菌白蚁及其巢于2018年11月底在广东韶关采集，运输到实验室后，散落的菌圃于-20 ℃冷冻保存，完整的黄翅大白蚁巢放入塑料盒饲养，之后收集白蚁产生的粪便冷冻保存。本实验5个样品分别为黑翅土白蚁菌圃(T1C)、黄翅大白蚁菌圃(T2C：正常菌圃；T3C：含炭角菌菌圃)、黄翅大白蚁粪便(T4F和T5F)。

1.1.2 主要试剂和仪器

E.Z.N.A^TM Mag-Bind Soil DNA Kit、DNA纯化试剂盒，Omega公司；Qubit^® dsDNA HS Assay Kit、2×Taq MasterMix DNA聚合酶，TaKaRa公司。Illumina MiSeq高通量测序由金唯智科技有限公司完成。PCR仪，Bio-Rad公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统，UVP公司。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA提取

按照DNA提取试剂盒说明书从样本中提取DNA，使用Qubit^® dsDNA HS Assay Kit检测DNA浓度，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA质量。

1.2.2 PCR扩增及文库构建

以上述提取的DNA为模板，用上游引物(5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′)和下游引物(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′)进行PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区域。用上游引物(5′-CGWTAACGAACGAG-3′)和下游引物(5′-AICCATTCAATCGG-3′)扩增真菌ITS rRNA的ITS2区。另外，通过PCR给16S rRNA基因和ITS序列的PCR产物末端加上带有Index的接头，以便进行NGS测序。PCR反应体系：2×Taq MasterMix 25 μL，细菌或者真菌上、下游引物(10 μmol/L)分别1 μL，模板DNA 20-30 ng，加无菌水至50 μL。扩增细菌的PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 5 s，57 ℃ 90 s，72 ℃ 10 s，24个循环；72 ℃ 5 min。扩增真菌的PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。通过酶标仪检测文库浓度。将文库定量到10 nmol/L，按Illumina MiSeq仪器使用说明书进行PE250/PE300双端测序，由MiSeq自带的MiSeq Control Software (MCS)读取序列信息。

1.2.3 高通量测序数据分析

双端测序得到的正反向Reads首先进行两两拼接，过滤拼接结果中含有N的序列，保留序列长度大于200 bp的序列。经过质量过滤去除嵌合体序列，最终得到的序列按照序列间的距离进行聚类，以97%以上的相似序列作为划分阈值，使用VSEARCH (1.9.6)进行归类分析并生成可操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)。比对的16S rRNA基因和ITS序列参考数据库是Silva 132。利用RDP classifier (ribosomal database program)贝叶斯算法对OTU的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。基于OTU得到分析结果，采用对样本序列进行随机抽取的方法，分别计算Shannon、Chao1等α多样性指数及Rarefaction曲线反映群落的物种丰度和多样性。

2 结果与分析 2.1 有效序列数和OTU聚类分析

测序后经质控、去嵌合体、拼接后获得有效序列。5个样品的16S rRNA基因和ITS的有效序列如表 1所示，16S rRNA基因序列条数分布在59 083-110 271之间，其中菌圃样品的有效序列条数高于粪便样品；而ITS有效序列条数在63 755- 93 280之间。在97%的相似水平下，对样品进行OTU聚类分析。5个样本细菌的OTU分别为90、164、143、199、91个；而真菌的OTU分别为29、11、10、58、55个(表 1)。细菌OTU数明显多于真菌，表明样品中的细菌种类多样性大于真菌。另外，不管是细菌还是真菌，粪便样品的OTU数值都大于菌圃样品的OTU，说明粪便比菌圃具有更多的微生物多样性。

2.2 稀释性曲线和α多样性指数分析

稀释性曲线(rarefaction curve)是用于描述随着样本量的加大可能检测到的物种种类随之增加的状况，是调查样本的物种组成和预测样本中物种丰度的有效工具，在生物多样性和群落调查中被广泛用于判断样本量是否充分以及估计物种丰富度。因此，通过稀释曲线不仅可以判断样本量是否充分，在样本量充分的前提下，运用稀释曲线还可以对物种多样性和丰富度进行预测。从图 1可以看出，5个样品16S rRNA基因测序(图 1A)和ITS rRNA测序(图 1B)的OTU稀释曲线都是随着测序量的深度增加而增加，刚开始曲线指数上升，然后逐渐增加变缓，在序列数目 > 30 000条后，稀释曲线进入平稳期。通常当曲线趋于平缓时表示随着抽取的数据量加大，检测到的OTU数目不再增加，说明此时的测序数据量较为合理。本实验测序量合理，应该最大程度地检测到了培菌白蚁菌圃和粪便样品中的细菌和真菌种类。

α多样性指数分析可衡量和反映样品微生物群落的丰度和多样性，由表 2可知，粪便样品细菌的Chao1指数、ACE指数均大于菌圃的Chao1指数和ACE指数，再次表明粪便样品中细菌群落的丰度大于菌圃样品的丰度；其次，16S rRNA基因Shannon指数和Simpson指数也呈现一致的现象，可说明培菌白蚁粪便中细菌的多样性要高于菌圃。

与16S rRNA基因分析数据相比较，真菌ITS的多样性指数总体上都小于16S rRNA基因分析的多样性指数，说明5个样品中的真菌种类数都少于细菌种类数。单独看真菌ITS的多样性指数，结果基本与细菌类似，也就是粪便样品真菌的各项指数均大于菌圃样本的相关数值，粪便样品的真菌种类多样性大于菌圃。一般情况下，Coverage指数的数值越高，样本中序列未被测出的概率越低。本测序分析中Coverage指数值均大于0.95，接近1 (表 2)，说明样品的序列基本上都已被检出，即测序结果可反映培菌白蚁菌圃和粪便样品微生物种类的真实情况。

2.3 培菌白蚁样品细菌、真菌在不同分类水平上的分析

2.3.1 细菌在门水平上的分析

各样品经高通量测序检测出的细菌门类组成见图 2A。T1C包括7个细菌门，优势菌门为变形菌门(Proteobacteria，86.94%)，其次是拟杆菌门(Bacteroidetes，8.32%)、厚壁菌门(Firmicutes，3.3%)等；T2C包括10个细菌门，优势菌门为变形菌门(82.4%)，其次是拟杆菌门(12.62%)、纤维杆菌门(Fibrobacteres，1.9%)、厚壁菌门(1.58%)等；T3C包括6个门，优势菌门为变形杆菌门(93.38%)，其次是厚壁菌门(4.45%)、拟杆菌门(2.06%)；以上3个菌圃样品不论是黑翅土白蚁T1C还是黄翅大白蚁T2C和T3C，变形菌门都是绝对优势菌门，丰度超过82.4% (表 3)。在两种白蚁之间主要不同的门是螺旋菌门(Spirochaetes)，其在黑翅土白蚁T1C中的丰度是25%，但是在黄翅大白蚁菌圃和粪便样品中都没有。两个粪便样品T4F和T5F都包括7个门，第一优势菌门为拟杆菌门(55.12%-73.38%)，第二优势菌为变形菌门(13.38%-33.57%)。在菌圃中的绝对第一优势菌是变形菌门，在粪便样品中成为第二优势菌门。

2.3.2 细菌在属水平上的分析

图 2B显示样品中细菌在属水平的结构分析。从中可以看出，黑翅土白蚁T1C菌属结果明显不同于黄翅大白蚁T2C和T3C。假单胞菌属(Pseudomonas，77.09%)在T1C样品中占绝对优势，相对丰度在1%以上的还有别样杆菌属(Alistipes，3.08%)、不动杆菌属(Acinetobacter，2.02%)、沙雷氏菌属(Serratia，1.5%)、乳球菌属(Lactococcus，1.4%)、营发酵单胞菌属(Dysgonomonas，1.31%)和拟杆菌属(Bacteroides，1%)。在T2C和T3C样品中，丰度最高的菌属为Burkholderia-Caballeronia- Paraburkholderia，在2个黄翅大白蚁菌圃中丰度分别为49.77%和90.82%，与T3C相比，T2C注释到更多的属，相对丰度在1%以上的还有9个属：沙雷氏菌属(Serratia，8.85%)、沃尔巴克氏体属(Wolbachia，6.7%)、别样杆菌属(Alistipes，5.61%)、鲁泰杆菌(Luteibacter，3.77%)、营发酵单胞菌属(Dysgonomonas，1.63%)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium，1.26%)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas，1.14%)、迷踪菌属(Elusimicrobium，1.1%)和假单胞菌属(Pseudomonas，1%)；而T3C样品中相对丰度在1%以上的除了Burkholderia- Caballeronia-Paraburkholderia (90.82%)，主要是芽孢杆菌属(Bacillus，4.21%)和盐单胞菌属(Halomonas，1.28%) 2个菌属。在黄翅大白蚁粪便样品中，T5F中相对丰度在1%以上的有14个属：别样杆菌属(Alistipes，21.18%)、营发酵单胞菌属(Dysgonomonas，10.84%)、短波单胞菌属(Brevundimonas，4.95%)、丛毛单胞菌属(Comamonas，4.49%)、副杆菌属(Parabacteroides，4.35%)、鲍特杆菌属(Bordetella，3.08%)、拟杆菌属(Bacteroides，2.2%)、Candidatus_Saccharimonas (2.04%)、乳球菌属(1.79%)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas，1.77%)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio，1.55%)、贪铜菌属(Cupriavidus，1.41%)、Shinella (1.34%)和鞘氨醇菌属(Sphingopyxis，1.18%)。T4F样品中相对丰度在1%以上的有10个属：别样杆菌属(26.32%)、营发酵单胞属(9.55%)、副杆菌属(4%)、Candidatus_ Saccharimonas (3.23%)、乳球菌属(2.7%)、拟杆菌属(1.92%)、鲍特杆菌属(1.44%)、脱硫弧菌属(1.18%)、短波单胞菌属(1.11%)、Lactovum (1.09%)。总而言之，黑翅土白蚁菌圃(T1C)丰度优势细菌属主要是假单胞菌属和别样杆菌属，而黄翅大白蚁菌圃(T2C和T3C)丰度优势菌属是Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia。在黄翅大白蚁粪便样品中丰度优势菌属为别样杆菌属和营发酵单胞菌属。另外，与前面α多样性指数分析一致，粪便样品包含更多的细菌菌属(图 2B)。

2.3.3 真菌在门水平上的分析

根据ITS序列分析，注释到真菌门水平的5个样品均包含2个主要门类：担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota) (图 3A，表 4)。在T1C黑翅土白蚁菌圃样品中，担子菌门占绝对优势(98.73%)，含少量的子囊菌门(1.19%)；在黄翅大白蚁2个菌圃样品中，担子菌门和子囊菌门2个门类所在比例差异不像黑翅土白蚁样品那么显著，在T2C中担子菌门和子囊菌门分别是51.83%和48.17%，而在T3C中2个门类分别是64.19%和35.81%。在黄翅大白蚁粪便样品中，T4F优势菌门为担子菌门(79.7%)和子囊菌门(19.69%)；而T5F的优势菌门为子囊菌门(53.15%)和担子菌门(45.12%) (表 4)。与黄翅大白蚁菌圃样品相比，粪便样品T4F和T5F中还注释到Zygomycota和Chytridiomycota两个门。

2.3.4 真菌在属水平上的分析

图 3B展示样品中真菌在属水平的结构分析。菌圃样品中鸡枞菌属(Termitomyces)丰度最高。在3个菌圃中的丰度分别是：T1C：98.71%；T2C：51.83%；T3C：64.16%。菌圃样品中相对丰度在1%以上的属还包括炭角菌属(Xylaria)，另外，在T2C菌圃样品中有48.16%没有鉴定到属。粪便样品注释到真菌属的数量明显多于菌圃，T5F包括27个属，T4F包括23个属。T5F样品中相对丰度在1%以上的有毛孢子菌属(Trichosporon，44.48%)、Cephaliophora (36.67%)、短柄霉属(Aureobasidium，6.09%)和f_Amphisphaeriaceae_ unclassified (1.72%)，7.21%没有鉴定到属。T4F样品中相对丰度在1%以上的有毛孢子菌属(Trichosporon，79.06%)、Cephaliophora (17.06%)，2.03%没有鉴定到属。

3 讨论与结论

培菌白蚁是热带和亚热带地区生物质的主要分解者之一，它们在体外菌圃上专一培养真菌Termitomyces。在培菌白蚁生活史中，其体内肠道微生物和体外菌圃微生物在培菌白蚁的食物消化利用方面发挥重要作用，是研究宿主-微生物相互作用良好的模型系统^{[12, 17-19]}。为了了解肠道菌群的作用，通过高通量测序、微生物分离培养等方法，人们对白蚁肠道核心菌群种类多样性等方面开展了许多研究^{[10, 11, 13-14, 20-21]}，而关于体外菌圃微生物方面的研究比较少^[22]。培菌白蚁菌圃含有细菌和真菌，本文通过16S rRNA基因和ITS区域高通量测序分析了菌圃的菌群组成结构，菌圃是培菌白蚁消化食物后通过肠道排出的初级粪便^[16]，所以我们也分析了培菌白蚁产生的最终粪便的菌群组成。

T1C是黑翅土白蚁野外采集的菌圃，其绝对优势菌门是变形菌门，这一结果与文献报道的下层菌圃(bottom comb)细菌门水平上的组成结构类似^[16]。Liang等分析了喂食不同食物(leaves和branches)黑翅土白蚁菌圃上(top)、中(middle)、下(bottom)细菌组成，发现上、中菌圃第一主要优势菌门是拟杆菌门，下层菌圃第一优势菌门是变形菌门。Liang等研究发现树叶和树枝对黑翅土白蚁菌圃组成比例有一些影响，但是其核心菌群门比例没有明显变化^[16]。我们野外采集的菌圃属于成熟老菌圃，所以分析结果和文献中报道的下层菌圃组成一致^[16]。

T2–T5是黄翅大白蚁的4个样品，前2个(T2C和T3C)是菌圃，后2个(T4F和T5F)是粪便样品。平行样品间虽然组成略有差别，但是主要优势细菌相同。和黑翅土白蚁一样，变形菌门是黄翅大白蚁菌圃样品中的第一优势菌，而在粪便样品中这一地位被拟杆菌门替代，变形菌门成为第二优势菌。变形菌门可能参与食物的脱毒和消化^[16]，所以在菌圃样品中的比例大于粪便样品。相比菌圃，粪便样品的细菌组成与培菌白蚁肠道微生物更相似。拟杆菌门是培菌白蚁肠道和粪便样品的第一优势菌，黄翅大白蚁后肠与粪便优势菌属均为拟杆菌门的别样杆菌属(Alistipes)和营发酵单胞菌属(Dysgonomonas)^{[6, 20]}，关于这2个优势菌属的作用还不清楚^[23]。粪便微生物比菌圃微生物更具多样性且更类似肠道微生物，可能原因是粪便微生物大部分来源于肠道。培菌白蚁肠道中的拟杆菌门和厚壁菌门细菌被认为是糖苷水解酶的主要产生菌，培菌白蚁以菌圃上的真菌为食，这些酶可能在白蚁消化真菌细胞壁过程中发挥作用^[13]。

培菌白蚁与鸡枞菌Termitomyces共生，白蚁从周围环境中收集死亡的植物材料，带到巢中消化，经过白蚁肠道排出的分泌物形成新生菌圃(fresh comb)，同时白蚁从环境中获得鸡枞菌孢子。鸡枞菌在菌圃上生长，形成许多小白球菌(fungus nodules)，为白蚁提供食物^{[22, 24]}。通过高通量ITS区域分析菌圃真菌多样性，丰度最高的真菌是鸡枞菌属(Termitomyces)真菌。鸡枞菌不仅提供给培菌白蚁食物，同时也具有抑制其他病原真菌如木霉菌和白僵菌的功能^[22]及拮抗真菌如炭角菌的作用^[25]。另外，培菌白蚁肠道来源放线菌门(Actinobacteria)的细菌和厚壁菌门的芽孢杆菌(Bacillus)对白蚁环境中的潜在致病菌也有抑制作用^[26-28]，在培菌白蚁废弃的巢或者白蚁死亡的巢中，经常看到炭角菌(Xylaria)的生长。本研究中的T2C和T3C都是黄翅大白蚁菌圃，但是T3C样品来自白蚁刚刚死亡的巢，所以炭角菌占较高的比例。

综上所述，本研究对培菌白蚁菌圃和粪便样品进行了细菌和真菌种类的高通量测序分析，是首次对白蚁粪便样品进行微生物多样性调查。结果表明白蚁粪便样品与培菌白蚁肠道菌有更多的菌群结构相似性，其细菌和真菌的丰度也明显多于培菌白蚁菌圃。本文加深了人们对培菌白蚁体内外共生微生物的了解和认识，为进一步深入研究培菌白蚁与共生菌群相互作用和关系奠定了基础。