牛冠状病毒(Bovine coronavirus，BCoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，是具有多形性、有囊膜、单股正链的RNA病毒^[1]。BCoV是引起牛呼吸道感染、新生犊牛腹泻和成年牛冬痢的主要病原^[2]。从1972年起，BCoV已被多个国家报道，该病呈世界性分布，不仅影响奶牛产奶性能，而且病愈后的犊牛生长、发育和生产性能都会受到影响。BCoV主要经由消化道和呼吸道两种途径传播，感染牛会在特定时间排毒来感染牛群^[3]。

BCoV粒子共有5种主要结构蛋白，分别是囊膜蛋白M、核衣壳蛋白N、纤突蛋白S、小膜蛋白E和血凝脂酶糖蛋白HE^[4]。核衣壳蛋白(N)含有3个结构域，是一种碱性磷蛋白，具有高度保守性的抗原，在冠状病毒RNA合成中发挥作用，多用于BCoV的早期诊断^[5]。牛冠状病毒的检测方法有很多，包括透射电子显微镜、间接免疫荧光、血凝试验、RT-PCR和RT-qPCR等，虽然前几种方法可以对BCoV进行早期诊断，但费时且成本高昂，对操作人员要求较高，不适于牛场大规模检疫^[6-9]。ELISA方法操作简便，不需要特殊仪器设备，适合于血清学流行病学调查。本研究前期建立的ELISA方法所使用的重组N蛋白抗原以包涵体形式表达，通过电洗脱变性条件下纯化得到，其作为ELISA抗原存在用量大、敏感性低和亲和力弱等不足。本研究通过对上述方法进行改进，使用经DNAStar软件预测的免疫原性较好的N蛋白抗原表位作为抗原，经基因工程方法获得可溶性重组蛋白，采用镍柱天然条件下纯化得到亲和力较好的活性蛋白，容易与抗体结合，建立的方法敏感性更高、稳定性更好，可进一步装配成稳定的ELISA诊断试剂盒，进一步丰富了BCoV检测技术，为BCoV实验室诊断和流行病学调查提供了技术保障，为防控BCoV提供了有效的检测手段。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 病毒及阳性血清

BCoV-CD分离毒株由本实验室分离鉴定及保存^[10]；标准阴性血清、标准阳性血清、牛副流感3型(BPIV3)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻-粘膜病(BVDV)、大肠杆菌(E. coli)阳性血清均由黑龙江八一农垦大学传染病研究室制备保存^{[1, 11-15]}。

1.1.2 主要试剂和仪器

ELISA板购自Costar有限公司；脱脂乳购自BD公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自索莱宝公司；TMB显色液及其它试剂均为国产分析纯。PCR仪、半干转膜仪、全自动凝胶成像系统和酶标仪均为Bio-Rad产品。

1.1.3 引物设计与合成

利用DNAStar软件对BCoV-CD毒株n基因抗原表位进行预测，使用Premier 5.0软件设计n基因扩增引物，引物两端引入Sal I和BamH I酶切位点，具体序列：F：5′-GGATCCGATCAGTCCGACC AATCTAG-3′；R：5′-GTCGACAGGGCTCATCCAT CTTCTTA-3′。

1.1.4 临床检测样本

临床样本是本实验室2007-2017年收集并保存的牛血清，具体信息见表 1。

1.2 BCoV间接ELISA抗原的制备

1.2.1 N蛋白原核表达载体的构建和表达

以BCoV-CD分离毒株的cDNA为模板，通过PCR使用n基因扩增引物扩增目的片段，PCR反应体系(25 μL)：Quick Taq HS DyeMix (2×) 12.5 μL，上、下游引物各(12.5 μmol/L) 1 μL，cDNA 2.0 μL，ddH₂O 8.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。目的片段为1 241 bp，构建出pMD18-T-N质粒，将阳性质粒与pET-32a(+)表达载体同时用BamH I和Sal I进行双酶切，凝胶回收基因和线性化的pET-32a载体，利用T4 DNA酶连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达鉴定。将表达的重组菌超声破碎，300 V每次超声10 s，超声6次后取裂解的菌液通过SDS-PAGE电泳进行可溶性分析。

1.2.2 重组蛋白的鉴定及纯化

以Anti-His-Tag单克隆抗体为一抗，对表达的重组蛋白进行Western blotting鉴定。按照CTB His-Binding-resin镍柱说明书在非变性条件下进行重组蛋白纯化。

1.3 BCoV间接ELISA条件优化

1.3.1 抗原包被条件及样品稀释浓度的优化

包被抗原时，选择50 mmol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)、50 mmol/L pH 7.6的Tris盐酸缓冲液(TBS)、10 mmol/L pH 7.6的磷酸盐缓冲液(PBS)作为包被液，采用2.5、5.0、7.5和10.0 μg/mL的抗原浓度包被，选择37 ℃包被(1.0 h和2.0 h)、4 ℃过夜、37 ℃包被(1.0 h和2.0 h)后4 ℃过夜等5个条件进行包被，BCoV标准阳性血清、阴性血清按照1:50、1:100、1:200进行稀释，每组做4次重复。

1.3.2 二抗及血清反应条件的优化

分别采用5%脱脂乳、1% BSA、PBS、1% BSA+5%犊牛血清、PBST对标准阳性、阴性血清进行稀释。将HRP标记羊抗牛IgG按照1:2 500、1:5 000、1:7 500、1:10 000的浓度进行稀释。选取1%明胶、5%明胶、5%脱脂乳、1% BSA、10%犊牛血清作为封闭液，每组做4次重复。

1.4 阴阳性临界值的确定

采用优化的间接ELISA方法对24份经病毒中和试验检测过的BCoV阴性血清进行检测，每份血清样品均多次重复检测，测其OD₄₅₀，通过公式计算阳性和阴性的临界值，临界值=X+3SD，当待检样品的OD₄₅₀ > X+3SD时，判定为阳性；当待检样品的OD₄₅₀ < X+3SD时，判定为阴性；当待检样品的OD₄₅₀=X+3SD时，判定为可疑^[10]。

1.5 交叉反应、符合率、重复性试验

1.5.1 交叉反应试验

采用优化的间接ELISA方法检测对本实验室保存的BRSV、BRV、IBRV、BPIV3、BVDV和E. coli等6种阳性血清进行检测，每个样品进行4次重复，同时设BCoV标准阳性血清、阴性血清和空白对照孔，确定该方法是否存在交叉反应。

1.5.2 符合率试验

利用病毒中和试验^[11]和建立的间接ELISA方法对40份疑似BCoV感染的牛血清样品进行检测。根据OD₄₅₀值判定样品阴阳性，确定该方法与病毒中和试验的符合率。

1.5.3 重复性试验

随机挑选5个样品进行批内和批间重复试验，计算每份样本的平均值(X)、标准差(SD)和变异系数(CV)。

1.6 黑龙江省BCoV血清流行病学调查结果

采用间接ELISA方法对2010-2017年间黑龙江省不同地区603份牛血清进行检测，调查其血清阳性率。

2 结果与分析 2.1 BCoV N蛋白原核表达载体的构建和表达

构建的pMD18-T-N质粒经Sal I和BamH I双酶切后，经1%凝胶电泳出现1 241 bp和2 692 bp基因，与预期目的基因片段大小一致，见图 1A。重组表达载体质粒pET-32a-N用Sal I和BamH I进行双酶切鉴定，结果显示在1 241 bp和5 900 bp处出现条带，分别与载体和目的条带大小一致，说明表达质粒构建成功，如图 1B所示。对重组菌的菌液上清和菌体沉淀做SDS-PAGE凝胶分析，结果菌液上清和沉淀当中都出现了大小约为66 kD目的条带，表明该融合蛋白存在可溶性表达，见图 1C。

2.2 重组BCoV N蛋白的Western blotting鉴定及纯化

Western blotting结果显示重组菌在约66 kD处有特异性免疫印迹，而空载体对照未出现，见图 2A，结果表明BCoV N蛋白在大肠杆菌中融合表达。通过镍柱在自然条件下获得了较纯的重组蛋白，咪唑浓度为200 mmol/L时洗脱效果最佳，见图 2B。

2.3 BCoV间接ELISA条件优化

2.3.1 抗原包被条件及样品稀释浓度的优化

由图 3A和3B可知选取碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，在37 ℃包被1.0 h时，P/N值最大，包被效果最好。由图 3C和3D可知，当抗原包被浓度为2.5 μg/mL效果最好，样品进行1:50稀释时P/N值最大，样品稀释效果最佳。

2.3.2 二抗浓度、样本稀释液及封闭条件的优化

由图 4可知，当HRP标记羊抗牛IgG稀释度为1:7 500，封闭条件为1%明胶封闭0.5 h，样本稀释液选择PBST时，P/N值最高，ELISA反应效果最佳。

2.4 阴阳临界值的确定

24份BCoV阴性血清样品OD₄₅₀平均值为0.168，标准差为0.019，根据公式计算阴阳临界值X+3SD=0.225。因此待检样品OD₄₅₀ > 0.225为阳性，待检样品OD₄₅₀ < 0.225时为阴性，待检样品OD₄₅₀=0.225为可疑。

2.5 交叉反应、重复性、符合率试验

2.5.1 交叉反应试验

采用优化的间接ELISA方法对实验室保存的BCoV、BRV、BRSV、BVDV、IBRV、BPIV3和E. coli的阳性血清进行检测，结果表明建立的检测方法与BRV、BRSV、BVDV、IBRV、BPIV3和E. coli抗体无交叉反应，特异性良好，见表 2。

2.5.2 重复性试验

随机挑选5个样品进行批内和批间重复试验，批内最大的变异系数为8.97%，批间重复的最大变异系数为4.24%，均小于10%，说明建立的检测方法重复性良好，结果见表 3。

2.5.3 符合性试验

应用病毒中和试验和建立的间接ELISA方法分别对40份疑似BCoV感染的牛血清样品进行检测。在病毒中和试验中，31份样品被确定为中和抗体阳性；在间接ELISA方法中29份样品被确定为阳性，结果见表 4。

2.6 黑龙江省BCoV血清流行病学调查结果

采用优化好的间接ELISA方法对黑龙江省603份待检血清进行检测，结果为596份阳性血清，7份阴性血清，BCoV的阳性率为98.84%。各地区的阳性率分别为齐齐哈尔97.78%，鸡西98%，大庆98.83%，牡丹江96.67%，绥化96.67%，其余地区的阳性率都为100%。

3 讨论与结论

腹泻是新生犊牛最严重的疾病之一，腹泻发生率随年龄的增长而下降，1月龄以内的犊牛发生腹泻的风险最大。BRV、BCoV、产肠毒素性大肠杆菌(K99)和隐孢子虫等是引起犊牛腹泻的主要病原^[16-18]。BRV和BCoV在世界各国的牛群中广泛传播，而BCoV的发生频率往往高于BRV^{[5, 19-20]}。对于BCoV的检测方法有很多，但是大多不适合大量样本的快速检测，而ELISA方法可以弥补上述缺陷。

本研究利用当地分离的流行毒株BCoV-CD基因组为模板扩增得到n基因，通过原核表达获得可溶性蛋白作为ELISA抗原，建立的方法更适合于当前国内BCoV感染的流行病学调查。本试验建立的间接ELISA方法与常见的牛腹泻病原BRV、BVDV和大肠杆菌等阳性血清无交叉反应，而且与病毒中和试验符合率达到95%，说明本方法可以用于临床诊断。采用本试验建立的间接ELISA方法，对603份实验室采集并保存的牛血清进行检测，并完善黑龙江省BCoV流行病学调查，结果表明，BCoV血清阳性率高达98.84%，个别地区阳性率可达100%。比以前刘合义等检测的阳性率65.23%明显升高^[10]，可能由于当前集约化养殖程度提高，饲养密度加大，使BCoV传染的风险增加^{[10, 16]}。BCoV感染成年牛导致“冬痢”，该病传播速度非常快，在几天内可波及全群或整个地区。最近研究表明，BCoV能够引起持续感染，感染牛长期带毒和连续排毒，造成该病毒在牛群中长期存在^[21]。

本试验建立的间接ELISA方法不仅原料易于获得，而且成本低廉，所建方法特异性强、敏感性高、稳定性好，利于装配成检测试剂盒，更适合于基层单位推广使用。然而该方法还需要通过对大量临床样本的检测和验证来进一步完善，并组装成快速检测试剂盒，为我国养牛业健康发展提供技术保障。