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文章信息
- 陈雷, 杜爽, 王光玉
- CHEN Lei, DU Shuang, WANG Guang-Yu
- 源于微生物的海鞘天然产物
- Microbial origin of natural products isolated from ascidians
- 微生物学通报, 2020, 47(1): 295-304
- Microbiology China, 2020, 47(1): 295-304
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190436
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文章历史
- 收稿日期: 2019-05-20
- 接受日期: 2019-09-03
- 网络首发日期: 2019-10-10
海鞘(ascidians)是海洋天然产物的重要来源,已经从海鞘中分离到大约1 000种化合物[1],具有结构新颖和抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗感染等多种生理活性[2],如ET-743和Didemnin B[3]。由于从海鞘中分离的化合物与来自微生物的化合物结构相同或相似,人们开始怀疑这些海鞘天然产物的真正来源。近年来,越来越多的证据表明,从海鞘中分离到的化合物不是海鞘本身产生的,而是由与其共生的微生物产生的[4]。由于海洋无脊椎动物的采集或水产养殖存在着一定的困难,从海洋动物中直接进行化合物的分离与纯化面临高成本以及动物原料不足的问题。微生物资源的利用具有很多便利条件,如果能够证实海鞘天然产物是微生物来源的,就可以有效地解决药源问题,对药物的开发具有重要意义。
从20世纪80年代起人们开始研究海鞘天然产物的微生物来源,目前已经通过直接或间接证据表明约有8%的海鞘天然产物是由与海鞘共生的微生物产生的,代表性化合物见表 1和表 2[1, 4-31]。目前这方面的研究还处于起步阶段,虽然已经有一些科学家做了很好的尝试,但是还没有通用的有效方法可以直接借鉴。因此本文综述了海鞘天然产物微生物来源的相关研究方法,如海鞘来源可培养细菌的分离、海鞘来源不可培养细菌的粗提物检测、宏基因组学、全基因组测序等直接方法,以及将海鞘天然产物与非海鞘来源可培养细菌分到的化合物进行结构比对的间接方法。另外还可借鉴海绵等其他海洋动物化合物的微生物来源的证明方法,如原位杂交和多种方法联用等。本文还进一步分析了天然产物生物合成基因在确定天然产物的真正来源以及新药物发现方面的重要作用,为今后系统研究海鞘天然产物的微生物来源提供参考。
1 海鞘天然产物微生物来源的直接证据 1.1 海鞘来源可培养细菌的分离
Tambjamines是一种吡咯生物碱类化合物,从海鞘Atapozoa sp.、苔藓虫及其捕食者中都可分离,推测其可作为化学防御物质用于抵抗动物的捕食[32-33]。Tambjamines以前还从陆生放线菌Streptomyces sp. BE18591中分离到[34],它与多种细菌产生的灵杆菌素类生物碱(prodigiosin-type alkaloids)的结构非常相似[35],因此推测tambjamines可能来源细菌。研究者从采集自瑞典的成年海鞘Ciona intestinalis的体表分离到海洋细菌Pseudoalteromonas tunicata,从这种细菌中虽然没有分离到化合物tambjamines,但是得到了Tambjamines的衍生物YP1,因此证实了Tambjamines的细菌来源[5]。
目前从海鞘中分离到的可培养微生物的数量还很有限。除了Tambjamines以外,海鞘来源化合物直接通过分离海鞘微生物进而再次得到相同化合物的例子非常有限。因此今后需加强新颖而有效的海洋动物来源微生物分离培养方法的研究[36]。
1.2 海鞘来源不可培养细菌的粗提物检测研究人员已经从Didemnidae科的海鞘,也称为Didemnid海鞘中分离到很多结构新颖且具有较好药理活性的化合物,如C11环戊烯酮类化合物(cyclopentenones)。还有科学家从蓝细菌中也分离到C11化合物。由于Didemnidae科中有很多属种的海鞘(如Lissoclinum sp.和Diplosoma sp.)都与蓝细菌(如原绿藻Prochloron sp.)共生,所以猜想C11化合物可能是由蓝细菌产生的。由于海鞘的共生体蓝细菌Prochloron sp.无法获得纯培养,所以Takayuki等通过挤压浮游生物网(squeezing through the plankton net)的方法将海鞘Diplosoma virens与其体内的蓝细菌Prochloron sp.分离,在分离的Prochloron sp.丙酮提取物的1H-NMR图谱中找到了与C11 cyclopentenones相同的峰,证实了这种海鞘天然产物C11化合物的共生微生物来源[7]。
Bistramides是从热带海鞘Lissoclinum bistratum中分离出来的化合物[6]。这种海鞘中存在共生体蓝细菌Prochloron sp.,通过人工将Prochloron sp.与宿主海鞘分开,然后从各自的提取物中分离化合物Bistramides,研究表明Bistramides类化合物在Prochloron中比在海鞘中的含量高,说明Bistramides可能是蓝细菌产生的[6]。
1.3 宏基因组学方法Riesenfeld等[8]采用宏基因组学方法对采自南极洲的海鞘Synoicum adareanum中分离出的一种聚酮类化合物Palmerolide A的生物来源进行研究,在显微镜下可以观察到海鞘的被囊内存在着很多微生物,通过变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和16S rRNA基因克隆文库法分析了微生物的多样性,发现α-和γ-变形杆菌纲的细菌约占75%,以Pseudovibrio和Microbulbifer属居多;以这种海鞘和海鞘体内的微生物为模板,对Ⅰ型PKS (polyketide synthase)的酮基合成酶(ketosynthase,KS)结构域进行PCR扩增,对扩增出的KS基因进行了BLAST同源性分析和系统发育分析,发现其与微生物(Candidatus Endobugula sertula)来源的苔藓抑素(bryostatins)的生物合成基因有较高的相似性,Microbulbifer属的菌株和Candidatus Endobugula sertula的系统发育关系较密切并且同属于γ-变形杆菌纲交替单胞菌目(Alteromonadales)的成员,因此推断化合物Palmerolide A可能是由海鞘体内的γ-变形杆菌纲的共附生微生物产生。该研究虽然证明了Palmerolide A的微生物来源,但是还需要进一步研究这个KS基因与Palmerolide A生物合成之间的关系,以及到底是哪种微生物含有这个KS基因。
海鞘Lissoclinum patella是一种复海鞘,是由一个共同的被膜包裹着许多小的个体(zooid)构成的。Patellazoles是分离自这种海鞘的一类具有较强细胞毒活性的聚酮类化合物。采用宏基因组测序和构建DNA克隆文库的方法来寻找Patellazoles的生物合成基因的来源,发现并不在预想的海鞘Lissoclinum patella或者共生的蓝细菌Prochloron didemni中,而是存在于与每个小个体(zooid)共生的一种新的α-变形杆菌纲的细菌Candidatus Endolissoclinum faulkneri中。研究发现Patellazole的生物合成基因ptz是Candidatus Endolissoclinum faulkneri基因组中唯一的次级代谢产物基因,通过多种化学和生物学方法进一步证实了ptz基因与Patellazoles生物合成的一致性;这种共生细菌Candidatus Endolissoclinum faulkneri已经对基因组进行了精简,去掉了一些无用的基因,导致这种细菌离开宿主海鞘无法独立生存[9],这也证实了次生代谢产物Patellazoles对于维持海鞘与细菌的共生关系具有重要作用。
Ecteinascidin 743 (ET-743)是一种四氢异喹啉生物碱类化合物,分离自加勒比海鞘Ecteinascidia turbinata,已经通过欧盟认证在临床上用于软组织肉瘤和卵巢癌的治疗[2]。研究发现,ET-743与其他3种细菌来源的天然产物Saframycin A (来源于Streptomyces lavendulae)、Saframycin Mx1 (来源于Myxococcus xanthus)和Safracin B (来源于Pseudomonas fluorescens)的结构相似性很高,因此研究者开始怀疑并着手研究ET-743的真正来源[10]。通过基于下一代测序的宏基因组学方法,首先从整个动物体入手,找到ET-743的生物合成基因簇,之后通过宏基因组DNA的提取、测序、组装分析等过程将生物合成基因簇定位于一种γ-变形杆菌纲的细菌Candidatus Endoecteinascidia frumentensis的基因组中,从而证实了化合物ET-743的微生物来源[10]。
1.4 全基因组测序通过对海鞘体内的目标菌株进行全基因组测序可以发现海鞘天然产物的真正来源。来自加勒比海鞘Trididemnum solidum的Didemnin B是第一个进入临床试验的海洋来源抗肿瘤药物。现已证实Dideminin B是由海洋α-变形杆菌纲的细菌Tistrella mobilis产生的[25]。通过对细菌Tistrella mobilis KA081020-065的全基因组测序发现了Didemnin B的生物合成基因簇,并提出前体化合物Didemnin X和Y可在该细菌中转化为Didemnin B的假设[11]。
与海鞘共生的细菌中,最有代表性的细菌是原绿藻属(Prochloron)的细菌[37]。在海鞘被膜中发现了类菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acid,MAA)可以保护海鞘体内的蓝藻免受紫外线的伤害,在对海鞘Lissoclinum patella的全基因组测序分析发现,MAA的生物合成基因簇存在于蓝细菌Prochloron的基因组中,从而证实了MAA的微生物来源[12]。
一千多种海鞘天然产物中近一半都分离自Didemnidae科的海鞘,其中最具代表性的是海鞘Lissoclinum patella[38]。Lissoclinum patella是一种生活在热带印度洋-太平洋地区的复海鞘,是研究共生关系的理想模型[8]。目前已知的分离自Lissoclinum patella的大约70种化合物都是由其共生的微生物产生的,并且大多数都是由共生蓝细菌Prochloron didemni产生的[38]。Patellamides是从Didemnidae科海鞘中分离出来的一系列环肽类化合物。通过对来自帕劳的海鞘Lissoclinum patella样品以及与其共生的蓝细菌Prochloron didemni分别进行全基因组测序,发现化合物patellamide A和C的生物合成基因簇并不在宿主海鞘中,而是存在于与其共生的蓝细菌中[13],证明了化合物Patellamides的微生物来源。研究者把Patellamide A和C的生物合成基因簇在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达,并在重组后的大肠杆菌提取物中获得了这两种化合物[39]。
2 海鞘天然产物微生物来源的间接证据一些海鞘天然产物与非海鞘来源可培养微生物分离的化合物结构相似,可以间接表明海鞘天然产物可能是微生物来源的。
聚酮类化合物是海鞘天然产物中重要的一类。一些分离自海鞘的聚酮类化合物与其他来源(如土壤、附生植物、海绵等)细菌分离到的化合物结构具有高度的相似性,所以推测这些海鞘天然产物可能是微生物来源的(表 2)。除了化合物Bistramides之外,这些化合物的生物合成途径高度相似,结构基因都是结构化排列的,都具有相似的假定起始单元,接着是0-2个氨基酸,然后是16-26个碳的聚酮链,包括13-24个原子的大环结构;化合物Bistramides中的氨基酸位置不在起始位置,而是在化合物的中间[4, 17]。
从海鞘中分离到许多肽类化合物,一些具有抗肿瘤活性的肽类化合物已经应用于临床,如ET-743、Didemnin B和Aplidine等[2]。许多海鞘分离到的肽类化合物与其他细菌来源化合物的结构高度相似(表 2)。聚酮类化合物和非核糖体肽类化合物多是由微生物生成的,混合聚酮-肽类化合物的生物合成也只在细菌和低等真核生物中被发现,这也间接证明了海鞘来源的这些化合物潜在的共生微生物来源[25]。
从海鞘Eudistoma toealensis中分离到的一系列属于吲哚并咔唑类生物碱的星形孢菌素(staurosporine)类化合物,最早发现是由陆生链霉菌产生的。由于星形孢菌素具有较强的细胞毒活性,已经进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验用于癌症的治疗[1]。海鞘中分离的生物碱类化合物Pibocins与真菌来源的化合物Festuclavines的结构高度相似[28]。从海鞘Didemnum voeltzkowi中分离到的Tubercidin类似物,在其他来源的可培养放线菌中也获得了类似的化合物[29]。从海鞘Ritterella tokioka中分离到的萜类化合物Ritterazines与海洋寄生虫Cephalodiscus gilchristi中获得的化合物Cephalostatins表现出惊人的结构相似性,因此有人提出该化合物可能来源于微生物[30]。从皱瘤海鞘Styela plicata中分离到的一种腺嘌呤核糖核苷化合物,与红树植物内生真菌Penicillium sp.中分离得到的化合物2ʹ-脱氧腺苷的结构高度相似[31]。这些证据都间接表明了这些化合物可能是微生物来源的。
3 非海鞘天然产物微生物来源的直接证据 3.1 原位杂交与海鞘一样,海绵、苔藓虫等海洋无脊椎动物也是海洋天然产物的重要来源,从这些海洋动物中分离到的化合物也有共生微生物来源的。Calyculin A是从海绵Disodermia calyx中分离到的一种具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物,通过构建Disodermia calyx的宏基因组DNA文库,并筛选Trans-AT聚酮合成酶的保守结构域KS的基因序列,成功得到了该化合物的cal生物合成基因簇,并利用PCR和荧光原位杂交法验证了海绵中Entotheonella属的共生细菌是cal生物合成基因簇的真正来源,也证实了化合物Calyculin A的微生物来源[14]。
苔藓抑素(bryostatins)是分离自海洋苔藓虫Bugula neritina的具有抗肿瘤活性的天然产物,是由Ⅰ型聚酮合酶(PKS-I)催化合成的大环内酯类聚酮化合物。在苔藓虫中发现有一种不可培养的γ-变形菌纲的共生细菌Candidatus Endobugula sertula。Davidson等[15]从苔藓虫Bugula neritina中提取总DNA并克隆PKS-I基因片段,然后用特异性的引物KSa来扩增KSa基因,研究发现KSa RNA探针特异性结合在苔藓虫幼虫的共生细菌Candidatus Endobugula sertula中,而不是结合在苔藓虫细胞中;在实验室苔藓虫的养殖实验中,如果用抗生素抑制苔藓虫中共生细菌的生长,则会导致KSa基因表达以及Bryostatins的生成量下降,从而证实了Bryostatins是共生细菌生成的;同时还从苔藓虫中直接克隆化合物Bryostatin的生物合成基因,然后用这个基因在异源宿主细菌中进行了Bryostatin的表达[15]。
3.2 多种方法联用在研究海洋动物分离化合物微生物来源的时候,可以通过多种方法的联用来证明。化合物Polytheonamide是从海绵Theonella swinhoei中分离到的一种结构复杂的线性多肽,由49个氨基酸残基组成,首先通过对整个海绵的总DNA文库进行筛选,确定了这种化合物是由poy基因簇编码的[16],然后需要在这种海绵丰富的微生物群中找到化合物Polytheonamide的真正生产者。通过对海绵细胞进行分离、差速离心和荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS),将单个细菌和宿主的颗粒分离到微孔板中,并进行全基因组扩增[16]。基于Polytheonamide和通用16S rRNA基因序列的PCR筛选结果表明,poy基因簇存在于Candidate Entotheonella属的一种丝状多细胞细菌(a filamentous multicellular bacterium)中,通过对离心富集的细菌部分进行宏基因组测序也证实了这个结果,从而表明Candidate Entotheonella属的细菌是Polytheonamide类化合物的真正生产者[16]。后来又将这个属分为Candidatus Entotheonella factor和Candidatus Entotheonella gemina,它们属于一个新的门(Tectomicrobia),目前该属尚无可以纯培养的菌株[16]。除了poy基因簇外,在Entotheonella属的菌株中还发现了很多聚酮和肽类天然产物的基因簇,可以合成很多之前从海绵中分离出来的化合物,如Onnamides、Cyclotheonamides、Keramamides、Konbamides、Nazumamides、Peudotheonamides和Theopederins等,因此具有极其重要的开发前景[16]。
4 天然产物生物合成基因的运用天然产物生物合成基因的测定在确定天然产物的真正来源以及新药物发现方面具有重要作用。通过对微生物的基因组进行测序,然后利用生物信息学预测出可能产生次级代谢产物的生物合成基因簇,进一步对基因簇进行活化或者异源表达,预测产物的理化性质,最终分离并鉴定目的产物[40]。
对于编码次级代谢产物的功能基因的发现是确定天然产物来源的重要依据。目前研究较多的基因如聚酮合酶(polyketide synthases,PKS)基因和非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases,NRPS)基因,此外还有核糖体合成的翻译后修饰肽(ribosomally synthesized post-translationally modified peptides,RiPPs)基因以及参与萜类化合物合成的萜环化酶基因和异戊二烯转移酶基因等[41]。通过对编码这些化合物的生物合成基因簇的克隆和分析,可为海鞘天然产物微生物来源的研究提供有利证据。
基因组测序技术的快速发展揭示了海鞘来源微生物中含有丰富的次级代谢产物基因簇,这远远超过了从海鞘和微生物中分离到的次级代谢产物的数量。因此如何激活这些“沉默的”基因簇对于海洋新药的研发具有重要意义。目前已经在研究的激活微生物中沉默的次级代谢产物基因簇的方法,有可调节启动子与途径特异性转录因子的融合、去除异染色质形成所需的基因、与微生物共培养来模拟自然条件、一株菌多种化合物策略(one strain many compounds,OSMAC)等,其中大多数方法都是在对真菌Aspergillus nidulans研究中发展起来的,因为这种模式生物具有高效的基因靶向系统[42]。但上述方法并非完全适用于其他类型微生物,因此开发新型、高效的激活方法对于海鞘微生物及其化合物的研究将具有重要的推动作用。
目前大多数海鞘天然产物的真正来源微生物是不可培养的。如果能够实现海鞘天然产物生物合成基因的异源表达,不仅可以为找到其真正来源微生物提供有利证据,还可以通过异源表达激活一些沉默的基因,从而促进新化合物的发现[43]。现在常用的异源表达的宿主有链霉菌(Streptomyces)、曲霉菌(Aspergillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、分枝杆菌(Mycobacterium)以及大肠杆菌(Escherichia coli)等[43-44]。Shrestha等[45]将来自Streptomyces clavuligerus的4种克拉维酸(clavulanic acid,CA)的生物合成基因在菌株Streptomyces venezuelae YJ028中进行异源表达,得到3种克拉维酸的中间体Deoxygaunidinoproclavaminic acid、Guanidinoproclavaminic acid和Dihydroclavaminic acid,并通过培养基优化等方法提高克拉维酸的产量和实现工业化生产。
5 展望目前已经从海鞘中分离到超过1 000种化合物,从海鞘来源细菌分离到150种化合物[2],其中有很多化合物是相同的。现在已有多种方法应用于海鞘天然产物潜在微生物来源的研究,可以直接或间接证明一些从海鞘分离到的化合物实际上是由与其共生的细菌产生的。这些研究还只是冰山一角,随着研究方法的不断进步,以后还会有更多的海鞘天然产物生物合成途径得到阐述。不仅仅是细菌和蓝细菌,以后可能还会有更多的微生物类群会被鉴定为海鞘天然产物的真正生产者。
目前虽然对海鞘与细菌(尤其是蓝细菌)之间的共生关系有了一定的研究,但对于海鞘与共生微生物以及次生代谢产物间的很多生物学问题尚不十分清楚。海鞘天然产物对这种共生关系有哪些影响?控制这种共生关系的因素有哪些?海鞘次生代谢产物通常是有毒的,它对于海鞘本身、周围的生态环境以及不同物种间的相互作用有哪些影响?这些化合物是否真的是用于海鞘的防御?研究化合物的真正生物来源是一个很好的突破口,可以从遗传物质的角度阐述其合成途径,进而探讨其对宿主和微生物的生理作用,这对于从根本上解析海鞘与微生物间的共生关系具有重要意义。
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