2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 尹灵丹, 李亮, 刘平黄
- YIN Ling-Dan, LI Liang, LIU Ping-Huang
- 肠小体在猪肠道冠状病毒感染中的研究进展
- Research progress in enteroids in porcine enteric coronavirus infection
- 微生物学通报, 2020, 47(1): 263-271
- Microbiology China, 2020, 47(1): 263-271
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190343
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文章历史
- 收稿日期: 2019-04-17
- 接受日期: 2019-08-09
- 网络首发日期: 2019-09-12
猪肠道冠状病毒是引起仔猪腹泻的主要病原，临床感染以严重腹泻、呕吐、脱水和高死亡率为特征[1-4]，严重制约着养猪业的发展。猪肠道冠状病毒主要侵染猪小肠绒毛上皮细胞，引起绒毛显著萎缩、脱落，导致病猪发生严重腹泻[5-7]。然而，由于经典的体外细胞培养系统缺乏多样化的细胞类型和空间结构，不能体现胃肠道高度复杂的微环境，限制了猪肠道冠状病毒感染与宿主肠上皮之间相互作用的研究。近年来，随着干细胞生物学领域的发展，诞生了一种新型的体外培养模型——肠小体(enteroids)，该模型类似肠的微型结构，即隐窝-绒毛复合体[8]，这为深入探究肠道病毒的分子生物学特性提供了一个更可靠的体外研究模型。
1 猪肠道冠状病毒介绍猪腹泻是规模化养猪场中常见的一种疾病，其引起的脱水是导致病猪死亡的主要原因，给我国乃至全球养猪业造成了严重的经济损失。猪肠道冠状病毒是引起猪病毒性腹泻的主要病原，包括猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)，以及最近新发现的猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)。其中TGEV、PEDV和SADS-CoV都属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae family) α-冠状病毒属(Alphacoronavirus genera)，PDCoV属于δ-冠状病毒属成员[9-11]。
TGEV和PEDV是最早发现的两种猪肠道冠状病毒[12-13]，具有高度的肠致病性，且对两周龄以下仔猪的致死率高达100%[14-15]。TGEV于1945年在美国被首次分离[1]，之后在美洲、欧洲及亚洲等国家相继报道，呈地方性流行或发生于局部地区[14]。PEDV于1971年在英国被首次报道[2]，随后在欧洲以及中国、日本等亚洲国家相继报道[15-16]。2010年我国再次暴发严重的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)疫情，2013年美国首次出现PED的大暴发，导致约超过800万的新生仔猪死亡，并随后蔓延至加拿大及墨西哥[17-18]。迄今为止，PEDV仍在世界范围内广泛流行。
PDCoV基因组大小约为25.4 kb，是所有冠状病毒中基因组最小的。PDCoV于2012年在中国香港被首次报道[19]，2014年2月在美国首次检测到PDCoV，并迅速蔓延到美国多个州，感染猪的临床症状类似于PEDV感染，但仔猪的死亡率低于PEDV[20]。随后，PDCoV在韩国和中国大陆猪群中被发现[21-22]。
SADS-CoV是最近新发现的一种与HKU-2相关的蝙蝠源冠状病毒，基因组大小约为27 kb[23]。SADS-CoV于2017年在中国广东省首次被发现，并迅速蔓延到附近的猪场，在短时间内导致近2.5万头仔猪死亡。SADS-CoV感染猪的临床症状类似于PDCoV和PEDV感染，表现为严重且急性呕吐和腹泻，新生仔猪体重迅速减轻导致急性死亡，5日龄及以下的仔猪死亡率高达90%[24]。
2 猪肠道冠状病毒体外研究模型介绍病毒的体外分离与培养对研究病毒的生物学特性、致病机制及药物或疫苗的研发起着至关重要的作用。目前，研究TGEV致病性的体外模型主要有猪睾丸细胞(swine testicular，ST)、猪肾细胞(porcine kidney-15 cells，PK-15)和猪上皮细胞(空肠) (porcine small intestinal epithelial cell line- jejunum，IPEC-J2)[25-27]。PEDV的细胞适应性非常差，对其致病性的体外研究主要在Vero细胞上进行[28]。此外，ST、PK-15、IPEC-J2细胞以及另一种来源于非洲绿猴肾细胞的MARC-145也可以支持PEDV的体外增殖[27, 29]。TGEV和PEDV主要感染猪小肠绒毛上皮细胞[30-31]，然而ST、PK-15、Vero以及MARC-145细胞来源并非猪肠上皮，与猪肠上皮细胞的很多特性都不相同，往往不能模拟体内肠上皮细胞与TGEV或PEDV之间的相互作用。IPEC-J2细胞是从刚出生的未吃初乳的仔猪空肠中段分离而来的非永生化细胞系[32]，虽具有典型的肠上皮细胞特性，但缺乏肠上皮细胞多样化类型和空间结构的复杂性，因此不能很好地模拟自然感染过程。
PDCoV是2012年新发现的一种猪肠道冠状病毒，研究报道ST细胞和猪肾细胞(LLC porcinekidney，LLC-PK)能够支持PDCoV的体外分离与增殖[33]。然而，PDCoV主要感染猪小肠绒毛上皮细胞，因此，利用ST细胞和LLC-PK细胞进行PDCoV的相关研究不一定能真实反映体内病毒与宿主相互作用的情况。
SADS-CoV是2017年发现的一种新型冠状病毒，目前关于SADS-CoV的报道较少，研究发现只有Vero细胞支持SADS-CoV的体外分离与增殖[24]。然而，Vero细胞并非猪源细胞，并不能客观准确地反映SADS-CoV体内感染的情况。
综上，当前用于猪肠道冠状病毒的体外研究模型都存在一定的局限性，为更好地探究猪肠道冠状病毒的致病机制及其与宿主相互作用的生物学特征，亟需开发一种能够密切概括猪肠道的体外模型，以期为疾病防控提供更加合理有效的策略。
3 肠小体概述肠上皮是一个复杂的系统，是许多胃肠道病原的主要感染部位以及与肠道微生物相互作用的界面，由绒毛区(villius)和隐窝区(crypt)两个区域构成[34]。肠上皮是哺乳动物自我更新最快的组织，位于其底部隐窝结构中的肠干细胞是它快速更新不可或缺的驱动力。肠干细胞进行增殖后，逐步分化成多种肠道上皮细胞(图 1)，包括执行吸收功能的肠细胞(enterocyte)，执行分泌功能的潘氏细胞(paneth cell)、杯状细胞(goblet cell)、肠内分泌细胞(enteroendocrine cell)和簇绒细胞(tuft cell)，以及Peyer集合淋巴结中的M细胞(microfold cell)[35]。
近年来，随着肠道干细胞分离技术的进步，实现小肠上皮细胞体外长期培养成为可能。2009年Sato等[8]首次在体外建立了一种小肠类器官模型的培养方法，该技术在没有间质微环境的支持下利用单个Lgr5 (leucin-rich repeat-containing G protein-coupled receptor，Lgr5)标记的干细胞建立一个隐窝-绒毛样结构的微型类器官，这种类器官具有中间“囊样”结构的绒毛样区域和周围“芽状”结构的隐窝样区域的结构，并且包含分化成熟的各种小肠上皮细胞类型，称为肠小体(enteroids)。肠小体培养时需加入小肠生长所必需的生长因子(EGF、R-spondin-1、noggin、wnt3a等)来模拟小肠干细胞的培养微环境，同时用基质胶(matrigel)代替小肠间质的支架结构，为肠小体的体外培养提供三维基质支持，从而形成3-D肠组织类器官模型[36]。为建立猪肠小体培养模型，参考Sato等报道的培养方法，我们实验室成功从猪的十二指肠(duodenum)、空肠(jejunum)、回肠(ileum)分离并培养了Lgr5干细胞来源的肠小体，在培养第7天能分化形成具有隐窝-绒毛样结构的肠类器官(图 2)。
与目前传统的细胞模型相比，肠小体具有显著优势。首先，肠小体可通过周期性细胞解离和传代在体外长期、稳定地培养，并且具有稳定的表型和遗传学特征[38]。其次，肠小体几乎包含所有终末分化的肠上皮细胞类型，并含有隐窝-绒毛样结构，不仅与活体内完整肠道独特的组织结构相似，还具有吸收、分泌等生理功能[39]。此外，类似于经典的细胞系，常规的基础实验技术，如PCR、qPCR、免疫组化、免疫荧光、慢病毒感染、CRISPR/Cas9基因编辑等均适用于肠小体的研究[40-42]。总的来说，肠小体培养模型的成功构建，为在体外探索病原体与宿主相互作用的研究提供了一个全新的平台，进一步推动了生物体生理过程和疾病发病机制的探索，同时也促进了药物筛选、毒理学研究和再生医学等多个领域的发展。
4 肠小体在肠道病原研究中的应用各种肠道病原感染引起的腹泻是临床常见的一种疾病，严重危害人类或动物的健康[43]。在腹泻疾病的发生发展过程中，肠上皮是病原感染的主要靶点，由于传统的体外细胞模型不能概括胃肠道高度复杂的生理特性，而肠小体模型的构建成功弥补了这一不足，成为一种在体外研究肠道病原感染期间肠上皮病理生理改变及其致病机制等方面的良好模型。随着肠小体培养技术的日趋成熟，近年来，肠小体模型已经广泛应用于人类及小鼠的小肠生理与疾病基础的相关研究。
4.1 肠小体在人轮状病毒感染中的应用人轮状病毒(human rotavirus，HRV)是一种分节段的双链RNA病毒[44]，是全球严重腹泻病的主要病原，每年导致约45.3万的5岁以下儿童死亡[45]。由于HRV在大多数转化细胞系和动物模型中生长受限[46-48]，以致于不能深入理解HRV的生物学特性以及与宿主之间的相互作用。随着人类肠小体模型的成功构建，为进一步探究HRV的发生发展以及致病机制等提供了一个重要的体外研究模型。
为评估肠小体是否可以作为HRV感染模型，Saxena等[49]将HRV Ito毒株(G3P[8])和Wa毒株(G1P[8])感染从不同患者的小肠不同区域(十二指肠、空肠、回肠)分离的肠小体，通过RT-qPCR、流式细胞术、电镜以及免疫组化进行分析，结果表明肠小体支持HRV进行有效的复制，且从小肠所有肠段分离的肠小体都对HRV易感。由于HRV存在宿主限制性，而许多动物轮状病毒(animal rotavirus，ARV)具有更广泛的宿主适应性，于是Saxena等进一步比较了HRV Ito毒株和ARV RRV毒株(G3P[3])在肠小体上是否存在感染的差异性，利用流式细胞术分析，发现HRV感染的细胞(51.6%±10.8%)显著多于ARV感染的细胞(13.5%±2.4%)，表明肠小体对同源的HRV更易感[49]。肠小体含有多种终末分化的细胞类型，通过免疫荧光分析，发现HRV主要感染肠细胞以及肠内分泌细胞，表明HRV存在细胞特异性的感染方式[49]。
在HRV感染性腹泻的发生过程中，常发生肠管腔肿胀和液体分泌等生理变化。为探究肠小体是否可以模拟这一过程，Saxena等将肠小体暴露于HRV毒株Ito，并在不同时间点通过显微镜测定肠小体的腔半径[49]。结果发现，肠小体在感染HRV后3–4 h开始扩张，并在感染后6 h扩张至最大腔半径；此外，当肠小体暴露于轮状病毒肠毒素NSP4时，也发生显著的管腔扩张[49]。这些结果表明，肠小体能够模拟HRV感染的病理生理学相关的特性。
4.2 肠小体在其它肠道病原感染中的应用人类诺如病毒(human norovirus，HuNoV)是全球急性胃肠炎的主要致病因素[50]，许多学者尝试在体外建立HuNoV的培养系统，但目前关于成功建立HuNoV培养模型的报道仍然较少[51]。2016年，Ettayebi等[52]首次将肠小体用于HuNoV的研究。Ettayebi等[52]将HuNoV GII.4基因型接种人空肠小体，通过RT-qPCR、免疫荧光、流式细胞术以及电镜分析，证实人肠小体支持HuNoV进行有效的复制。其次，研究发现HuNoV仅感染肠细胞，提示肠细胞可能是HuNoV感染的主要靶细胞[52]。此外，进一步研究发现，肠小体能够模拟流行病学中HuNoV的感染模式，表明肠小体模型是一种生物学相关系统，能模拟遗传决定的个体差异性[52]。最后，Ettayebi等研究发现，肠道环境中的一种关键因子——胆汁在HuNoV感染中具有至关重要的作用[52]。总的来说，该研究首次利用肠小体建立了HuNoV体外感染模型，有助于深入理解HuNoV的进化及致病机制。
2017年，Drummond等[53]从人类胎儿小肠分离并培养了肠小体，并将该模型应用于肠道病毒(enteroviruses)感染的研究。Drummond等[53]通过研究发现肠小体能够支持多种肠道病毒[柯萨奇病毒B (coxsackievirus B，CVB)、埃可病毒11 (echovirus 11，E11)、肠道病毒71 (enterovirus 71，EV71)]的复制及子代病毒的释放。随后，Drummond等通过RNA-Seq分析，结果发现肠小体在E11感染时能显著诱导细胞因子、趋化因子以及干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的表达，然而CVB和EV71感染并未诱导这些信号分子的表达，表明肠小体在肠道病毒感染时能诱导宿主产生抗病毒免疫应答，且存在病毒类型特异性差异[53]。此外，进一步研究发现，E11主要感染肠细胞和肠内分泌细胞，不感染杯状细胞，表明肠道病毒感染特定的小肠上皮细胞类型[53]。
2018年，Holly等也利用肠小体模型进行了人腺病毒(human adenovirus，HAdV)致病机制的相关研究。Holly等研究发现肠小体能够支持多种血清型的HAdVs (HAdV-5p，HAdV-16p，HAdV-41p)进行有效的复制[54]；他们进一步研究发现，肠小体也能够支持HAdV临床毒株的复制；另外，他们研究还发现Ⅰ型和Ⅲ型IFN处理肠小体后能有效地抑制HAdV的复制，但处理传统细胞系并不能明显抑制病毒的复制；此外，该研究还发现HAdV-5p优先感染杯状细胞，且能被人肠道α-防御素HD5中和[54]。
肠道小肠上皮能产生丰富的α-防御素，有研究报道α-防御素能选择性中和某些AdV血清型[55-56]。为探究自然分泌的α-防御素对鼠腺病毒2 (mouse adenovirus 2，MAdV-2)的影响，Wilson等从野生型(WT)小鼠和缺乏功能性α-防御素(Mmp7–/–)小鼠的肠组织分离肠小体，然后将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记的MAdV-2 (MAdV-2.IXeGFP)显微注射到肠小体的管腔中，并检测病毒的感染情况[57]。结果表明，在WT肠小体内产生的病毒显著高于在Mmp7–/–肠小体内产生的病毒，且与体内感染结果一致[57]。
5 肠小体在PEDV感染中的应用虽然肠小体已经在人类以及小鼠肠道病原研究中成功应用，但猪肠小体应用于猪肠道冠状病毒感染的相关研究报道却较少。2019年，我们实验室成功建立猪肠小体的培养，并首次将该模型应用于PEDV感染的研究[37]。为探究PEDV是否能够感染猪肠小体，我们将临床分离株PEDV-JMS感染猪小肠不同区域(十二指肠、空肠、回肠)分离的肠小体，通过免疫荧光等分析(图 3)，结果发现从小肠不同区域分离的肠小体都对PEDV易感[37]。有研究报道PEDV体内主要感染小肠，但在结肠中也存在限制性的感染[58]。为探究肠小体是否能模拟PEDV在不同肠段感染的差异性，我们将PEDV-JMS感染回肠小体和结肠小体，通过RT-qPCR、免疫荧光进行分析，结果发现PEDV在回肠小体上的复制显著优于结肠小体，表明肠小体能够模拟PEDV体内感染的发生发展过程；我们进一步研究发现，与细胞适应株PEDV-CV777相比，临床分离株PEDV-JMS在回肠小体上复制得更好[37]，表明利用猪肠小体分离PEDV临床株有着巨大的应用前景；同样地，与HRV和HuNoV一样，我们研究发现PEDV可以感染肠细胞以及杯状细胞，且与体内感染结果一致[37]。
最近有研究报道PEDV感染IPEC-J2细胞能够抑制Ⅰ型和Ⅲ型IFN的产生[59]，为探究PEDV感染肠小体是否能抑制IFN应答，我们检测了PEDV-JMS感染回肠小体不同时间点的Ⅰ型和Ⅲ型IFN的mRNA水平，结果发现PEDV在感染早期能够抑制IFN的产生；此外，我们进一步比较了Ⅰ型和Ⅲ型IFN在肠小体上的抗病毒活性，结果发现与Ⅰ型IFN相比，Ⅲ型IFN能够诱导更强的ISGs的表达，并且表现出更强的抗PEDV活性[37]。
总之，我们实验室利用猪肠小体建立了PEDV感染模型，且该模型能很好地模拟PEDV体内感染的过程，为进一步深入探究PEDV的致病机制奠定了基础。
6 展望猪肠道冠状病毒仍然是引起仔猪腹泻的主要原因，主要通过粪-口途径传播，感染小肠绒毛上皮细胞，引起仔猪的急性呕吐、腹泻及死亡。然而，由于当前用于猪肠道冠状病毒的体外研究模型大部分来源都并非猪肠上皮，如Vero、ST、PK-15细胞等，而IPEC-J2细胞虽来源于猪肠上皮，但其并不能模拟肠道复杂的生理特性，限制了对病毒生物学功能以及与宿主相互作用的深入了解。肠小体具有模拟胃肠道高度复杂的空间结构及生理功能的特点，克服了以前一些传统细胞模型的不足，已广泛应用于人类及小鼠肠道病原的相关研究。该模型的应用已经在肠道研究领域取得了许多重大突破，为肠道感染的防控与治疗提供了新的思路。猪肠小体培养模型的建立，以及成功应用于PEDV感染的研究，突破了一直限制猪肠道冠状病毒体外研究的瓶颈，这为将来广泛应用于其它猪肠道冠状病毒感染的相关研究奠定了基础。
综上，肠小体为猪肠道冠状病毒的基础研究提供了一个理想的体外模型，使阐明其与宿主相互作用的致病机制以及病理生理成为可能，从而为疾病的治疗和防控提供新的理论指导。
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