肠外致病性大肠埃希氏菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEc)是一类定殖于肠道外其他组织中的人畜共患病原菌，可引起人和动物的肺炎、脑膜炎、败血症和泌尿道感染^[1-2]。自2004年以来，猪源ExPEc在猪群中的分离率呈现明显上升趋势，且常与副猪嗜血杆菌、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等其他病原混合感染^[3-5]。由于猪源ExPEc也是生物膜感染的常见病原菌，多表现出多重耐药性，使得抗生素的效用大大降低，导致病猪死亡率不断提高，给我国养猪业造成严重的经济损失。

细菌生物膜(bacterial biofilm，BF)是细菌为适应生存环境，黏附于有生命或无生命物体表面后，被细菌自身产生的胞外多聚物基质包裹的膜状细菌群体^[6]。据美国国立卫生研究院(Nationat Instirutes of Health，NIH)的初步统计，大约85%的细菌性疾病与生物被膜形成有关。由于BF具有屏障作用，可阻止抗生素渗入，同时其中的细菌生长速度较慢，对抗生素不敏感，有的BF细菌还能分泌抗生素分解酶、产生抗生素耐药基因，导致其耐药性较浮游态细菌增强10−1 000倍^[7]。因此，在研究病原菌生物膜形成能力、调控机制以及生物膜形成与耐药性相关性的基础上，寻找有效的BF抑制剂或清除剂，对防治细菌生物膜相关感染具有重要意义。

本试验以从肺炎病猪体内分离鉴定的ExPEc为研究对象，通过优化分离株形成生物膜的最佳条件，检测其生物膜形成能力及携带的成膜相关基因，比较浮游状态和生物膜状态下分离菌株的耐药性，探讨生物膜形成与耐药性的关系，以期为从抗生物膜形成角度防治猪肠外大肠埃希氏菌病提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

1.1.1 细菌菌株

3株猪源ExPEc (SE-1、SE-2、SE-3)由本实验室从患有肺炎病猪的肺脏内分离鉴定并保存。

1.1.2 主要试剂与仪器

细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；BHI培养基、TSB培养基、MH培养基和营养肉汤培养基，杭州微生物试剂有限公司；头孢噻肟、头孢曲松和庆大霉素等12种抗菌药物，中国兽医药品监察所。

医用低温保存箱，海尔特种电器有限公司；紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；高速冷冻离心机，贝克曼库尔特公司；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；扫描电镜，日立公司。

1.2 分离菌株生物膜形成条件的优化

为了探讨培养基、培养温度、培养时间和初始菌液浓度对分离菌株生物膜形成的影响，选取培养基种类(BHI、TSB和营养肉汤)、培养温度(34、37、40 ℃)、培养时间(24、36、48 h)和初始菌液浓度(OD₆₀₀值0.2、0.3、0.5) 4个因素，每个因素各取3个水平，按L₉(3⁴)进行正交试验(表 1)，采用文献[8]报道的微孔板结晶紫染色法检测细菌生物膜。主要步骤为：将分离菌株接种不同培养基培养至不同OD₆₀₀值，取菌液加至96孔细胞培养板，200 μL/孔，按表 1中设置温度与时间进行培养，共做3个复孔，同时设置培养基作空白对照。培养结束后对生物膜依次进行甲醇固定、0.5%结晶紫染色、33%冰醋酸溶解结晶紫、测定溶解液OD₅₇₀值，通过分析各试验组与空白对照组的平均OD₅₇₀，确定3株分离菌株形成生物膜的最佳条件。

1.3 分离菌株的生物膜形成能力检测

1.3.1 微孔板结晶紫染色法检测生物膜形成能力

在最佳成膜条件下采用微孔板结晶紫染色法检测分离菌株形成生物膜能力。根据文献[9]报道，将空白对照组平均OD₅₇₀值加上其3倍标准差(SD)作为细菌生物膜形成的临界值(OD_c)，OD₅₇₀≤ OD_c判为无生物膜形成能力，OD_c < OD₅₇₀≤ 2OD_c判为生物膜形成能力较弱，2OD_c < OD₅₇₀≤ 4OD_c判为生物膜形成能力中等，OD₅₇₀ > 4OD_c判为生物膜形成能力强。

1.3.2 扫描电镜观察法检测生物膜结构

根据优化的成膜最佳条件，将3株分离菌株(SE-1、SE-2、SE-3)分别接种其最适培养基培养至最适的OD₆₀₀值。然后将菌液加到预先放有细胞爬片的6孔细胞培养板中，2 mL/孔，在各自最适温度下培养24 h或36 h。培养结束后，取出细胞爬片依次进行漂洗、2.5%戊二醛固定、酒精梯度脱水、丙酮脱水、CO₂临界点干燥和真空中离子溅射喷金，在扫描电镜下放大6 000倍进行细菌生物膜结构观察并拍照。试验中同时设置浮游态菌作对照。

1.4 分离菌株携带的生物膜形成相关基因检测

根据GenBank中收录的大肠埃希氏菌黏附素编码基因iha、I型菌毛蛋白编码基因fimA、鞭毛编码基因flhD/flhC、毒蛋白编码基因hipA、S-核糖同型半胱氨酸裂解酶编码基因luxS以及编码β-1, 6-N-乙酰葡聚糖胺合成酶基因(pgaA、pgaB、pgaC、pgaD)序列设计合成10对特异性引物(表 2)，PCR检测分离菌株是否携带这些生物膜形成相关基因。PCR反应体系：2×PCR Mix 6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH₂O 4 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，46−54 ℃ (不同基因的退火温度见表 2) 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 5 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并拍照。

1.5 抗菌药物对猪源ExPEc分离株的最小抑菌浓度(MIC)测定

采用微量肉汤稀释法^[10]检测12种抗菌药物对生物膜态与浮游态猪源ExPEc分离株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。

1.5.1 生物膜态猪源ExPEc分离株的培养

参考陈迁^[11]报道的培养方法，将3株分离菌株分别接种MH肉汤培养液，37 ℃、180 r/min振荡培养过夜，取50 μL菌液加至预先置有细胞爬片的6孔细胞培养板中，再加入5 mL MH培养液，37 ℃培养，每24 h换液一次，连续培养7 d，取出细胞爬片用PBS冲去表面浮游菌，用细胞刮刀刮下生物膜态细菌，并用MH培养液将其浓度稀释为10⁷ CFU/mL，用于后续MIC测定。

1.5.2 浮游态猪源ExPEc分离株的培养

将3株分离菌株分别接种MH培养液，37 ℃、180 r/min振荡培养，并用MH培养液将菌液浓度稀释至10⁷ CFU/mL，用于后续MIC测定。

1.5.3 MIC测定

抗菌药物用灭菌蒸馏水配制成浓度为1 280 μg/mL的药物原液。在96孔微量板每排的第1孔加160 μL MH培养液，其余各孔加100 μL MH培养液。然后，向第1孔内加入40 μL药物原液、混匀，吸出100 μL至第2孔进行稀释，依次类推稀释至第10孔，使1−10孔的药物终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25 μg/mL，第11孔和第12孔分别用作培养液对照和菌液对照。最后，向1−10孔加入100 μL浓度为10⁷ CFU/mL的生物膜态或浮游态菌液、混匀，置37 ℃培养20 h，以能使孔内液体澄清、无絮状或沉淀物生成的最低药物浓度为其对测试菌的MIC。试验重复3次。

2 结果与分析 2.1 猪源ExPEc分离株生物膜形成的最佳条件

选取培养基种类、培养温度、培养时间和初始菌液浓度4个因素，设计4因素3水平正交试验。结果如表 3所示，通过比较4因素的极差R值，发现3株猪源ExPEc成膜的最佳条件并不一致。其中，菌株SE-1成膜最佳条件为A₁B₁C₂D₃，即将OD₆₀₀为0.5的起始菌液接种TSB培养基，37 ℃培养24 h，可产生最大量的生物膜；菌株SE-2形成的最佳条件为A₁B₃C₁D₂，即将OD₆₀₀为0.3的起始菌液接种营养肉汤，34 ℃培养24 h；菌株SE-3形成的最佳条件为A₂B₂C₁D₃，即将OD₆₀₀为0.5的起始菌液接种BHI培养基，34 ℃培养36 h。

2.2 猪源ExPEc分离株的生物膜形成能力

在最佳成膜条件下采用微孔板结晶紫染色法检测3株猪源ExPEc的成膜能力。结果如图 1所示，3株分离菌在孔侧壁与底部均有明显附着，而空白对照孔内无染液附着。SE-1、SE-2和SE-3菌株的平均OD₅₇₀值分别为2.15±0.07、4.19±0.06和4.30±0.02，均显著大于4OD_c (0.09±0.001)，表明3株猪源ExPEc的成膜能力均很强。

扫描电镜下可以观察到最佳成膜条件下培养的菌株SE-1在细胞爬片表面聚集后形成明显的片状生物膜(图 2A)；菌株SE-2和SE-3能在细胞爬片表面明显聚集，形成多层结构的生物膜，并且聚集体间有空隙(图 2C、E)；浮游态下的3株细菌散在细胞爬片上，无聚集现象(图 2B、D、F)。

2.3 猪源ExPEc分离株携带的生物膜形成相关基因

以3株猪源ExPEc基因组DNA为模板，PCR检测生物膜形成相关基因。结果如图 3所示，从3株分离菌中均扩增到pgaA、pgaB、pgaC、pgaD、luxS、fimA、hipA、iha、flhC和flhD基因，说明它们均同时携带所检测的10个生物膜相关基因。

2.4 抗菌药物对猪源ExPEc分离株的MIC值

结果如表 4所示，与浮游态细菌相比，头孢噻肟、头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星和氟苯尼考对生物膜态SE-1菌株的MIC值分别提高了8、32、32、32和4倍，且该菌株形成生物膜后对后4种药物的敏感性由原来敏感转为中敏或耐药。头孢噻肟、头孢曲松、氨苄西林、庆大霉素、安普霉素、恩诺沙星、阿奇霉素和氟苯尼考对生物膜态SE-2菌株的MIC值分别提高了16、32、8、16、2、8、16和16倍，其对头孢噻肟、头孢曲松、氨苄西林、庆大霉素和恩诺沙星的敏感性由原来敏感或中敏转为中敏或耐药。头孢噻肟、头孢曲松和恩诺沙星对生物膜态SE-3菌株的MIC值分别增加了4、16和8倍，其对头孢曲松和恩诺沙星的敏感性由原来敏感转为耐药。

3 讨论与结论

近年来，有关猪源ExPEc分离鉴定的文献报道较多^{[4, 12-13]}，但猪源ExPEc生物膜形成能力与耐药性的研究鲜有报道。夏京津等^[14]研究发现细菌生物膜的形成受菌株、菌液初始浓度、营养条件、培养条件等多种因素影响。对此，本研究首先设计4因素3水平的正交实验探讨菌液初始浓度、培养基种类、培养温度及培养时间对3株猪源ExPEc生物膜形成的影响，结果显示3株猪源ExPEc的最佳成膜条件并不一致。其中，SE-1菌株的最佳成膜条件是将OD₆₀₀为0.5的起始菌液接种TSB培养基，37 ℃培养24 h；SE-2菌株的最佳成膜条件是将OD₆₀₀为0.3的起始菌液接种营养肉汤，34 ℃培养24 h；SE-3菌株的最佳成膜条件是将OD₆₀₀为0.5的起始菌液接种BHI培养基，34 ℃培养36 h。最佳成膜条件的确定，为后续检测其生物膜形成能力及生物膜态下细菌的耐药性奠定基础。

大肠埃希氏菌生物膜的形成与其黏附、运动、群体感应及代谢等均有关系，受多种相关基因的调控。已有研究报道^[15-16]外膜蛋白Iha和I型菌毛蛋白是致病性大肠埃希氏菌的重要黏附素，其编码基因iha和fimA是重要的生物膜形成相关基因。张祥武^[17]研究发现鞭毛调控基因flhD/flhC通过调控大肠埃希氏菌运动性而影响其生物膜形成。赵俊桥^[18]证实大肠埃希氏菌毒素——抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系统中的hipA基因可通过影响胞外DNA浓度而影响生物膜形成。Vuotto等^[19]报道了LuxS和pga操纵子(A/B/C/D)是大肠埃希氏菌群体感应系统(quorum sensing，QS)中的两个重要调节基因，它们分别编码QS信号分子合成酶和生物膜中多糖主要成分β-1, 6-N-乙酰葡聚糖胺合成酶，在细菌生物膜形成过程的初始黏附和成熟过程中发挥调节作用。本研究采用PCR方法检测猪源ExPEc分离株携带生物膜形成相关基因情况，结果显示它们均同时携带上述10种生物膜形成相关基因，这一结果从基因层面初步揭示了3株猪源ExPEc成膜能力强的主要原因，这也预示着可将抑制成膜基因的表达或研制其编码蛋白的结构竞争物来抑制生物膜的形成，从而作为一种抗菌治疗的研究方向达到抗生物膜细菌感染的目的。

MIC值是美国国家临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Instute，NCCLS)制定的体外试验敏感与耐药的判断标准。本研究检测了12种抗菌药物对浮游态与生物膜态猪源ExPEc分离株的MIC值，结果发现，与浮游菌相比，头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星和氟苯尼考对生物膜态SE-1菌株的MIC值分别提高了4−32倍，药物敏感性由敏感转为中敏或耐药；头孢噻肟、头孢曲松、氨苄西林、庆大霉素和恩诺沙星对生物膜态SE-2菌株的MIC值分别提高了8−32倍，由敏感转为中敏或由中敏转为耐药；头孢曲松和恩诺沙星对生物膜态SE-3菌株的MIC值分别增加了8−16倍，由敏感转为耐药。上述结果表明仅以浮游菌所做的药敏试验结果可能并不能真实评估抗菌药物对生物膜细菌的耐药性，在临床上判断抗菌药物治疗效果应依据实际造成感染的细菌状态来确定。

已有研究认为细菌的生物膜形成能力与耐药性是密切相关的，一方面生物膜胞外多糖可阻止外源抗生素进入膜内，降低了抗生素对膜内细菌的抑制或杀伤作用^[20]；另一方面细菌生物膜内营养缺乏使细菌生长与代谢较游离态缓慢，导致其对抗生素不敏感^[21]。此外，生物膜内细菌的群体感应系统与一些耐药基因可协同表达而导致耐药^[22]。药物外排泵和超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBLs)的产生分别是细菌对喹诺酮类药物和头孢曲松耐药的主要机制之一^[23-24]，本研究中3株生物膜态猪源ExPEc对头孢曲松和喹诺酮类药物均呈现耐药，我们认为这些分离株可能是通过表达LuxS基因和pga操纵子，协同表达了外排泵基因和ESBLs基因而导致耐药性的产生，但其内在的相关性机制有待于进一步研究。猪源ExPEc生物膜形成能力与耐药性的关系仍需使用大样本进行广泛深入研究，才能得到客观、准确的评价。