微生物学通报  2020, Vol. 47 Issue (1): 76−87

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王倩, 李欢, 郑琳, 贾文敬, 黄建忠, 李欣, 董思圳, 舒正玉
WANG Qian, LI Huan, ZHENG Lin, JIA Wen-Jing, HUANG Jian-Zhong, LI Xin, DONG Si-Zhen, SHU Zheng-Yu
植物根际芽胞杆菌菌种资源采集及其具有过水解催化活性水解酶基因的克隆
Isolation and classification of Bacillus sp. strains to mine genes encoding perhydrolysis activity
微生物学通报, 2020, 47(1): 76-87
Microbiology China, 2020, 47(1): 76-87
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190592

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收稿日期: 2019-07-21
接受日期: 2019-10-16
网络首发日期: 2019-10-28
植物根际芽胞杆菌菌种资源采集及其具有过水解催化活性水解酶基因的克隆
王倩 , 李欢 , 郑琳 , 贾文敬 , 黄建忠 , 李欣 , 董思圳 , 舒正玉     
福建师范大学生命科学学院 工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心 教育部工业微生物工程中心    福建  福州    350108
摘要: 【背景】 芽胞杆菌源枯草杆菌蛋白酶(subtilisin carlsberg)、乙酰基木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase)和头孢菌素乙酰水解酶(cephalosporin acetyl hydrolase)具有较高的过水解催化活性,有商业开发价值。【目的】 挖掘芽胞杆菌菌株中具有过水解酶催化活性的水解酶蛋白基因,为后续制备过水解酶及酶法合成过氧乙酸奠定基础。【方法】 利用定向筛选培养基,从植物根际及纳豆产品中筛选产蛋白酶芽胞杆菌候选菌株,并利用RFLP及16S rRNA基因对其进行鉴定。从蛋白酶高产芽胞杆菌菌株中克隆枯草杆菌蛋白酶、乙酰木聚糖酯酶和头孢菌素乙酰水解酶的全长基因。【结果】 从植物根际土壤及纳豆产品中共分离到85个候选菌株,RFLP及16S rRNA基因鉴定结果表明候选菌株均为芽胞杆菌,分别属于Bacillus subtilisBacillus cereusBacillus pumilusBacillus megaterium四个类群。从B. subtilis NSYT-3克隆的枯草杆菌蛋白酶基因编码的多肽链全长381个氨基酸,从B. pumilus OSLJ-3克隆得到的乙酰基木聚糖酯酶基因编码的多肽链全长320个氨基酸,从B. subtilis NSYT-3克隆的头孢菌素乙酰水解酶基因编码的多肽链全长318个氨基酸,3D结构模拟表明这3个酶蛋白均具有α/β水解酶折叠家族蛋白结构特点。【结论】 芽胞杆菌源具过水解催化活性水解酶基因的克隆,为后续开发酶法合成过氧乙酸工艺奠定了基础。
关键词: 根际细菌    芽胞杆菌    过水解催化活性    枯草杆菌蛋白酶    乙酰木聚糖酯酶    头孢菌素乙酰水解酶    
Isolation and classification of Bacillus sp. strains to mine genes encoding perhydrolysis activity
WANG Qian , LI Huan , ZHENG Lin , JIA Wen-Jing , HUANG Jian-Zhong , LI Xin , DONG Si-Zhen , SHU Zheng-Yu     
National & Local United Engineering Research Center of Industrial Microbiology and Fermentation Technology; Engineering Research Center of Industrial Microbiology, Ministry of Education; College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou, Fujian 350108, China
Abstract: [Background] Subtilisin carlsberg, acetyl xylan esterase and cephalosporin acetyl hydrolase from Bacillus sp. display high perhydrolysis activity in previous reports, and are worth developing for commercial application. [Objective] To produce perhydrolase for enzymatic synthesis of peroxyacetic acid in the future, series of hydrolase with promising perhydrolysis activity-encoding genes were cloned from Bacillus sp. strains isolated from rhizosphere soil samples and natto soybean products. [Methods] Protease-producing thermotolerant Bacillus sp. strains were screened from rhizosphere soil samples and natto soybean products using directed-screening medium, and then identified using 16S rRNA gene sequencing. Three full-length hydrolase genes (including subtilisin carlsberg, acetyl xylan esterase and cephalosporin acetyl hydrolase) were cloned from Bacillus sp. strains and then analyzed using sequence alignment. [Results] Total 85 protease-producing pseudo-Bacillus sp. strains was screened, and then identified and classified into four groups: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus pumilus and Bacillus megaterium. Three full-length hydrolase genes, subtilisin carlsberg gene (encoding 381 aa) from B. subtilis NSYT-3, acetyl xylan esterase gene (encoding 320 aa) from B. pumilus OSLJ-13, and cephalosporin acetyl hydrolase gene (encoding 318 aa) from B. subtilis NSYT-3, were cloned. All of the simulated 3D structure of subtilisin carlsberg, acetyl xylan esterase, and cephalosporin acetyl hydrolase were coincident with the typical structural characterization of α/β hydrolase fold enzymes. [Conclusion] Cloning and expression of hydrolase with perhydrolysis activity-encoding genes from Bacillus sp. strains will lay the foundation for the enzymatic synthesis technology of peroxyacetic acid.
Keywords: Rhizosphere bacteria    Bacillus sp.    Perhydrolysis activity    Subtilisin carlsberg    Acetyl xylan esterase    Cephalosporin acetyl hydrolase    

植物根际通过植物、微生物及土壤的互作形成了一个特殊的微生态环境,植物根际土壤中已分离出真菌、细菌、古细菌、病毒等多种类型的微生物[1]。植物根际微生物可促进植物生长;增强植物的抗逆性(耐盐)、抗病能力;促进土壤中各种化合物及元素的矿化过程及物质循环,提升土壤肥力[2]。根际微生物在与植物互作过程中可产生包括纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、果胶酶、磷酸酶、脂肪酶、蛋白酶等多种水解酶[3]。从根际土壤(宏基因组文库)或根际微生物中挖掘新型酶蛋白已成为开发新型生物催化剂的常规途径之一[4-5]

α/β水解酶折叠家族酶蛋白(α/β hydrolase fold enzymes)是指酶蛋白的3D分子结构中存在8个平行的β-折叠片层(β-sheet),β-折叠片层之间和周围围绕有系列α-螺旋(α-helix)结构,能催化水解反应(醇解反应或氨解反应)等的一类酶蛋白[6]。α/β水解酶折叠家族酶蛋白是截至目前研究最为深入透彻的一类蛋白质家族,也是已完成结构解析种类和数量最多的蛋白质家族。作为重要的工业生物催化剂,该家族的多种酶蛋白已实现商业化生产,并广泛应用于绿色制药、食品加工、可降解高分子材料的合成、生物能源等领域[7]。除了水解反应,α/β水解酶折叠家族的酶蛋白还可以催化包括过水解反应在内的17种其他化学反应,是一种具有多功能催化活性(promiscuous activity)的生物催化剂[8]。在水解酶催化乙酸酯(乙酸或乙酸盐)水解反应过程中,反应体系中的过氧化氢可与水分子竞争,攻击第二过渡态复合物[酶-Ser-O-C(O)-CH3]中的酯键,并释放出过氧乙酸,该催化活性即为水解酶的过水解催化活性[9]。过氧乙酸作为一种重要的工业原料,在油脂加工、脱木质素、纤维素或纺织品的漂白、污水处理等领域具有较好的应用前景[10]。传统的化学合成工艺对设备和工艺要求高(耐浓硫酸腐蚀),存在严重的生产安全问题(过氧乙酸浓度大于70%时容易爆炸),因此,开发酶法合成过氧乙酸的绿色生产工艺具有重要的意义[9]

由于过水解催化活性属于α/β水解酶的多功能催化活性,因此挖掘并开发具有较好过水解催化活性的酶蛋白具有重要的意义。已报道的具有良好过水解催化活性(过水解活性/水解活性 > 1)的α/β水解酶有Bacillus subtilis源枯草杆菌蛋白酶(subtilisin carlsberg,EC 3.4.21.62,缩写为SCP)和头孢菌素乙酰水解酶(cephalosporin acetyl hydrolase,EC 3.1.1.41,缩写为CAH)、Bacillus pumilus源和Thermotoga maritima源乙酰基木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase,EC 3.1.1.72,缩写为AXE)、Mycobacterium smegmatis源Acyl transferase (EC 3.1.1.2)、Pseudomonas fluorescens源Aryl esterase (EC 3.1.1.2)等[9, 11-13]。上述酶蛋白及其应用基本上被Genencor、Procter & Gamble、Dynisco和Dupont等国际知名公司专利垄断。α/β水解酶催化合成过氧乙酸反应中,底物之一为过氧化氢,产物为过氧乙酸,均为强氧化剂,对酶蛋白对氧化剂的耐受性提出了较高的要求,产物过氧乙酸常通过偶联原位化学氧化解决。为克服底物过氧化氢对酶蛋白的潜在毒害,可通过引入葡萄糖氧化酶建立葡萄糖氧化酶-α/β水解酶(过水解催化活性)偶联反应来实现。因此,克隆并表达各类具有较高过水解催化活性的α/β水解酶,并测定其对过氧化氢的Km值,从而筛选出能与葡萄糖氧化酶高效偶联的酶蛋白,对提高葡萄糖氧化酶-α/β水解酶双酶催化偶联反应的催化效率和操作稳定性具有重要的意义。

由于枯草芽胞杆菌分泌的纳豆激酶(nattokinase)与本研究拟克隆的枯草杆菌蛋白酶具有高度的序列及结构一致性(仅少数几个氨基酸差异),因此本文除了主要从植物根际土壤中分离并鉴定芽胞杆菌外,也对部分市售纳豆产品中的芽胞杆菌进行了分离鉴定。本文从植物根际土壤及纳豆产品中共分离获得了85株产蛋白酶芽胞杆菌,基于限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)和16S rRNA基因序列进行了初步分类,同时结合已报道的芽胞杆菌源具较高过水解催化活性的酶蛋白资源(SCP、CAH和AXE),克隆了相应类群芽胞杆菌菌株中的SCP、CAH和AXE蛋白的编码基因,为后续开发利用上述酶蛋白催化合成过氧乙酸奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 土壤、纳豆产品样品

土壤样品分别采自山东青岛莱西、福建永泰、山西洪洞等8个地区19种植物的根际土壤。对土壤样品进行植物名称结合地域原则进行编号,如从洪洞(Hongtong)地区采集的小麦(Triticum aestivum)根际土壤,编号为TAHT。从上述各种样品中分离出的芽胞杆菌菌株再依次用序号编号。纳豆产品从市场随机购买,并基于商品名称进行编号。

1.2 主要试剂和仪器及培养基

干酪素、三氯乙酸、福林酚、L-酪氨酸等各种化学试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。

LATaq DNA聚合酶、限制性内切酶Hha Ⅰ、Msp Ⅰ和Rsa Ⅰ、λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker,DL2000 DNA Marker、pMDTM19-T Vector Cloning Kit等均购自宝生物工程(大连)有限公司;Gel extraction kit为Omega公司产品。本实验使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具体引物序列、引物的Tm等信息见表 1。PCR扩增仪和电泳仪,Bio-Rad公司;紫外凝胶成像系统,UVP公司;UV 2600紫外分光光度计,岛津公司。

表 1 本实验所用的PCR引物 Table 1 Pairs of the primers used in this study
Primers name Primers sequence (5ʹ→3ʹ) Tm (℃) Annealing temperature (℃) PCR product (bp)
27f AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 54.2 51 1 514
1492r GGTTACCTTGTTACGACTT 52.8
BSS(F) TGCTTGTGAAGATTTTCAGAGGCAGC 59.9 60 1 443
BSS(R) CGAGTCTACGGAAATAGCGAGAGA 59.4
AXE(F) GTCGGTCGTCCTCCTTTATTCGTTTCAT 60.4 60 1 341
AXE(R) CGATTCTCGGATTCATCCTTCACATCAT 58.3
CAH(F) ATGGAACTAAGCCGGGAAAGTCTTAAACA 59.5 60 1 328
CAH(R) GCACATAAATAAAGCGGACGTCGTAATCA 58.8

蛋白酶定性筛选培养基(g/L):干酪素15.0,琼脂20.0,氯化钠10.0,蛋白胨10.0,牛肉膏3.0,pH 7.0−7.5。

蛋白酶发酵培养基(g/L):豆粕粉3.0,乳糖1.0,MgSO4·7H2O 0.15,NaCl 0.5,K2HPO4 0.02,KH2PO4 0.08,pH 6.0。

1.3 产蛋白酶芽胞杆菌菌株的分离

芽胞杆菌菌株的分离采用热处理法[14],产蛋白酶芽胞杆菌菌株的分离采用含干酪素的蛋白酶定向筛选培养基[15]。具体如下:称取1 g土样(或纳豆粉末)添加到100 mL的无菌水中,在80 ℃下振荡20 min,静置片刻。取上清液梯度稀释,从10−5梯度的试管中取50 μL涂布蛋白酶定性筛选培养基,37 ℃培养12−16 h。待筛选平板上的菌落长出后,先将菌落影印到另外一个定性筛选平板上,并向原始平板中添加适量6% (质量体积比)的三氯乙酸。从影印平板上挑取原始筛选平板上有明显水解圈的对应菌落,划线挑取单菌落,编号并甘油管低温保存。

1.4 芽胞杆菌菌株产蛋白酶能力的定量检测

将上述定性筛选获得的产蛋白酶芽胞杆菌菌株接种到LB液体培养基,37 ℃、220 r/min培养8 h。活化后的菌悬液按照5% (体积比)的接种量接入蛋白酶发酵培养基中。装液量为50 mL (250 mL),37 ℃、200 r/min培养56 h。于4 ℃、8 000 r/min离心20 min收集发酵上清液,以备测定蛋白酶活性。

1.5 蛋白酶活性测定方法

蛋白酶活性的测定方法采用Folin-酚法,参照Huang等[16]和Chen等[17]并稍作修改。具体如下:1 mL 2 %干酪素溶液(20 mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液) 40 ℃水浴2 min后加入1 mL适当稀释后的待测酶液,40 ℃反应10 min后,向反应体系中加入2.0 mL 0.4 mol/L三氯乙酸终止反应,12 000 r/min离心2 min,取1 mL上清液加入5 mL 0.4 mol/L Na2CO3和1 mL Folin-酚,40 ℃反应20 min后,在660 nm下测量上述混合物的吸光度。

1个酶活单位(U)定义为:在上述条件下,每分钟释放出1 μmol酪氨酸所需要的酶量。

1.6 产蛋白酶芽胞杆菌菌株16S rRNA基因的PCR扩增

1.6.1 提取芽胞杆菌基因组DNA

芽胞杆菌基因组DNA的提取方法参照孙明等[18]。活化后的芽胞杆菌细胞经溶菌酶处理后,2% (质量体积比)的SDS裂解细胞;经苯酚抽提、无水乙醇沉淀等处理后,获得芽胞杆菌全基因组DNA。

1.6.2 PCR扩增16S rRNA基因

芽胞杆菌菌株16S rRNA基因的PCR扩增参照Ouattara等[19]。PCR扩增引物为27f和1492r (具体序列见表 1)。PCR反应体系(总体积25 μL):10×buffer (含Mg2+) 2.5 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 1.0 μL,引物27f (10 μmol/L) 1.0 μL,引物1492r (10 μmol/L) 1.0 μL,LATaq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.1 μL,基因组DNA 1.0 μL,ddH2O 18.4 μL。PCR反应条件:95 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min,51 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,20个循环;72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经电泳检测并纯化后用于后续实验。

1.7 产蛋白酶芽胞杆菌菌株16S rRNA基因限制性片段长度多态性分析

经电泳检测并纯化后的16S rRNA基因PCR扩增产物分别用3种限制性内切酶Hha Ⅰ、Msp Ⅰ和Rsa Ⅰ进行酶切,酶切产物进行电泳观察。基于酶切产物对芽胞杆菌进行初步分类。

1.8 产蛋白酶芽胞杆菌16S rRNA基因的聚类分析

从前述分类获得的每个类群中分别挑选产胞外蛋白酶酶活最高的2个菌株,测定其16S rRNA基因序列,并提交NCBI核苷酸数据库。根据16S rRNA基因序列,利用Mega 5.1 (Neighbor-joining method)对从土壤中分离的芽胞杆菌进行聚类分析。

1.9 三种具有过水解酶催化活性的酶蛋白编码基因的克隆

根据已知B. subtilis SCP蛋白和CAH蛋白编码基因的核苷酸序列,分别设计引物对BSS(F)/BSS(R)和CAH(F)/CAH(R),以B. subtilis NSYT-3的基因组DNA为模板,PCR扩增SCP和CAH编码基因;根据已知B. pumilus AXE蛋白编码基因的核苷酸序列设计引物对AXE(F)/AXE(R),以B. pumilus OSLJ-13的基因组DNA为模板,PCR扩增AXE蛋白的编码基因。引物对的核苷酸序列、PCR扩增时使用的退火温度及PCR产物的大小见表 1

1.10 SCP、CAH和AXE蛋白多肽链氨基酸序列聚类分析

从NCBI数据库中分别检索出不同B. subtilis菌株的SCP蛋白和CAH蛋白多肽链氨基酸序列,以及不同B. pumilus菌株的AXE蛋白多肽链氨基酸序列,并分别与本实验中从B. subtilis NSYT-3菌株克隆的SCP和CAH、从B. pumilus OSLJ-13菌株克隆的AXE蛋白的多肽链氨基酸序列进行比对。利用Mega 5.1 (Neighbor-joining method)对上述酶蛋白进行聚类分析。

1.11 SCP、CAH和AXE蛋白的3D结构模拟

根据克隆基因编码的多肽链氨基酸序列,利用Swiss-model进行同源建模;获得的PDB文件利用YASARA软件可视化,并评估前述基于序列比对预测的催化三联体氨基酸残基之间的氢键网络。

2 结果与分析 2.1 产蛋白酶根际细菌的初筛

由于芽胞杆菌产生的芽胞具有较好的热耐受性[20],因此本研究用高温处理土壤悬液(实验中使用的热处理温度为80 ℃),可以有效杀灭土壤中的大多数微生物,达到富集芽胞的目的。本实验从各种植物的根际土壤中均分离到产蛋白酶的细菌菌株(图 1)。从每种植物根际土壤(或纳豆样品)分离平板上挑选出1−3个菌落,共挑选出85个菌株进行后续实验。不同细菌菌落周围的水解圈大小存在显著的差异(图 1),说明不同菌株之间产蛋白酶能力存在一定的差异。由于从常温根际土壤中也可分离到耐热的非芽胞杆菌菌株[21-22],因此,筛选平板上获得的菌株是否为芽胞杆菌菌株还需进一步进行分子鉴定。

图 1 产蛋白酶菌株在筛选培养基上的菌落形态 Figure 1 Colony morphology of protease-producing bacterial strains 注:筛选培养基从左到右、从上到下的菌株编号依次为:NSYT-1,NSYT-2,NSYT-3,NSBY-2,NSHM-1,NSHM-2,NSHM-3,BCPH-2,BCPH-1,NSSC-2,NSCX-3,NSSC-1,TAHD-1,BNYT-2,OSLJ-13,NSSC-3,NSBY-1,NSCX-1,NSBY-3. Note: From left to right and up to down of screening medium, the corresponding strains number: NSYT-1, NSYT-2, NSYT-3, NSBY-2, NSHM-1, NSHM-2, NSHM-3, BCPH-2, BCPH-1, NSSC-2, NSCX-3, NSSC-1, TAHD-1, BNYT-2, OSLJ-13, NSSC-3, NSBY-1, NSCX-1, NSBY-3.
2.2 根际细菌产蛋白能力的定量分析

各种根际细菌在产蛋白酶诱导培养基中均可分泌产生胞外蛋白酶(表 2)。不同细菌菌株分泌产生胞外蛋白酶的能力存在较大的差异,细菌菌株产胞外蛋白酶的能力与土壤类型、植物类型和植物生长状态有关。本实验中主要农作物如水稻(Oryza sativa L.,缩写为OS)、小麦(Triticum aestivum,缩写为TA)、油菜(Brassica napus L.,缩写为BN)等植物的根际土壤中均分离到产胞外蛋白酶能力较高的细菌菌株(发酵上清液蛋白酶活性均大于10 U/mL)。同时也观察到,经过长期人工驯化后的产蛋白酶细菌菌株,如纳豆产品(natto soybean,缩写为NS)中分离获得的细菌菌株均表现出较高的产蛋白酶能力,其中NSYT-3菌株的发酵上清液中蛋白酶的酶活达到49.9±0.2 U/mL。

表 2 不同根际细菌菌株产蛋白酶能力的比较 Table 2 Protease activity of the fermentation broth from bacteria strains isolated from rhizosphere soils
Strains Protease activity (U/mL)
BNYT-1 2.9±0.2
BNYT-2 10.5±0.0
AGYT-1 9.7±1.1
FSYT-1 9.0±0.2
FSYT-2 3.2±0.1
FSYT-3 5.9±1.1
TAHD-1 12.2±0.6
TAHD-2 7.2±0.4
PSHD-1 5.6±0.1
PSHD-2 0.3±0.1
TALX-1 2.4±0.0
TALX-2 3.4±0.1
ZMLX-1 6.3±0.0
ZMLX-2 1.7±0.2
PPYL-1 5.2±6.6
PPYL-2 1.0±0.2
PPYL-3 2.1±0.0
PPYL-4 3.8±0.2
PPYL-5 3.3±0.2
PPYL-6 2.3±0.1
CCYL-1 1.0±0.2
CCYL-2 6.3±0.2
CCYL-3 2.5±0.1
CCYL-4 7.1±0.4
FVYL-1 4.7±0.1
CPGG-1 4.5±0.1
CPGG-2 3.6±0.0
CPGG-3 7.1±0.4
CPGG-4 2.3±0.5
CPGG-5 2.1±0.1
CPGG-6 4.1±0.2
CPGG-7 4.1±0.8
CPGG-8 1.9±0.0
AFGG-1 0.2±0.2
AFGG-2 3.9±0.5
AFGG-3 0.7±0.2
ACLJ-2 3.7±0.1
OSLJ-1 3.2±0.1
OSLJ-2 3.2±0.8
OSLJ-3 6.8±0.1
OSLJ-4 4.9±0.2
OSLJ-6 3.2±0.2
OSLJ-7 1.2±0.1
OSLJ-8 4.2±0.3
OSLJ-9 3.5±0.1
OSLJ-10 2.0±0.0
OSLJ-11 2.5±0.3
OSLJ-12 3.7±0.0
OSLJ-13 10.4±0.3
OSLJ-14 3.2±0.3
OSLJ-15 8.4±0.2
OSLJ-16 8.3±0.1
PALJ-1 6.1±0.0
PALJ-2 4.0±0.5
PALJ-3 2.7±0.3
PALJ-4 3.9±0.1
PALJ-5 2.8±0.3
PALJ-6 5.9±0.2
PALJ-7 9.6±0.4
BCPH-1 10.9±0.1
BCPH-2 8.4±0.4
BCPH-3 7.4±0.1
BCPH-4 3.2±0.3
BCPH-5 5.1±0.1
BCPH-6 4.8±0.0
BCPH-7 7.5±0.3
AMPH-1 2.5±0.1
AMPH-2 5.1±0.2
SOCY-1 2.7±0.1
SOCY-2 10.7±0.4
NSSC-1 11.8±0.3
NSSC-2 9.2±0.1
NSSC-3 9.9±0.1
NSBY-1 11.6±0.3
NSBY-2 18.4±0.1
NSBY-3 9.5±0.2
NSYT-1 29.9±1.8
NSYT-2 45.8±0.7
NSYT-3 49.9±0.2
NSCX-1 10.8±0.7
NSCX-2 4.3±0.3
NSCX-3 11.8±0.1
NSHM-1 6.2±0.2
NSHM-2 5.8±0.0
NSHM-3 6.5±0.2
2.3 产蛋白酶耐热菌株16S rRNA基因的RFLP分析

以产蛋白酶细菌菌株的基因组DNA为模板,以27f和1492r为引物,PCR特异性扩增出一条长度为1 516 bp的DNA片段(图 2A)。该PCR扩增产物经Hha Ⅰ酶切后,产生两种酶切带型(图 2B),带型1含868、406和239 bp三种片段;带型2含577、405、348和182 bp四种片段。PCR扩增产物经Msp Ⅰ酶切后产生3种酶切带型(图 2C),带型1含602、386、207、146和106 bp五种片段;带型2含534、386、207、124和106 bp五种片段;带型3含604、385、207、124和105 bp五种片段。带型2和带型3每条泳道后面两条小片段(124和106 bp,124和105 bp),由于DNA扩散未清晰区分开,但每条泳道的第一条片段(534/604 bp)区分明显。PCR扩增产物经Rsa Ⅰ酶切后,产生3种酶切带型(图 2D),带型1含466、402、351、142和97 bp五种片段;带型2含433、402、396和97 bp四种片段;带型3含620、497、434、402和97 bp五种片段(结合后续核苷酸序列分析发现,该泳道中的1 026 bp和890 bp属于16S rRNA基因PCR扩增产物不完全酶切产物)。

图 2 16S rRNA基因PCR扩增产物及其限制性内切酶酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图 Figure 2 Gel-electrophoresis of PCR-amplified 16S rRNA gene fragment and the restriction pattern 注:M:DNA marker;A:16S rRNA PCR扩增产物电泳图;B:16S rRNA基因PCR扩增产物经Hha Ⅰ酶切后的酶切产物电泳图;C:16S rRNA基因PCR扩增产物经Msp Ⅰ酶切后的酶切产物电泳图;D:16S rRNA基因PCR扩增产物经Rsa Ⅰ酶切后的酶切产物电泳图. Note: M: DNA marker; A: Gel-electrophoresis of PCR-amplified 16S rRNA gene fragment; B: Restriction pattern of PCR-amplified 16S rRNA gene fragment digested with Hha Ⅰ; C: Restriction pattern of PCR-amplified 16S rRNA gene fragment digested with Msp Ⅰ; D: Restriction pattern of PCR-amplified 16S rRNA gene fragment digested with Rsa Ⅰ.

对经PCR扩增获得的每一株产蛋白酶耐热菌株的16S rRNA基因片段,分别用限制性内切酶Hha Ⅰ、Msp Ⅰ和Rsa Ⅰ进行酶切,并基于每种限制性内切酶的带型(图 2)进行分类,分类结果如表 3所示。上述产蛋白酶耐热菌株(表 2)的16S rRNA基因经RFLP分析,一共可以分为12个类群(表 3)。从每一个类群中挑选产蛋白酶能力最高的两个菌株,对其16S rRNA基因进行核苷酸序列测定。

表 3 产蛋白酶耐热菌株的RFLP分型 Table 3 RFLP types of protease-producing pseudo-Bacillus sp. strains
Types of RFLP Strains
H1M1R3 OSLJ-13; BNYT-2
H1M3R2 TAHD-2; FSYT-1
H1M2R2 OSLJ-12
H2M2R1 BCPH-6; CCYL-2; CPGG-1;ZMLX-2
H2M3R2 BCPH-2; CCYL-4; CPGG-4;CPGG-5;CPGG-6;CPGG-8;AFGG-1;PPYL-1;PPYL-3;PPYL-4;PPYL-6;CCYL-1;BCPH-1;BCPH-3;BCPH-7;BCPH-4;AMPH-1;AMPH-2;TALX-2;ZMLX-1;OSLJ-2;OSLJ-3;OSLJ-6;OSLJ-11;SOCY-2;FSYT-3;PSHD-1;PSHD-2;NSHM-3
H1M2R1 NSYT-2; NSYT-3
H2M1R2 SOCY-1; OSLJ-16; CPGG-2
H2M3R1 CCYL-3
H1M3R3 NSSC-1; AGYT-1; NSHM-2;PPYL-5;AFGG-2;CPGG-3
H1M2R3 NSCX-1; NSBY-2; OSLJ-15;OSLJ-9;FSYT-2;TAHD-1;PALJ-7;OSLJ-14;NSBY-1;BNYT-1;NSSC-3;NSSC-2;NSBY-3;NSYT-1;NSCX-2;NSCX-3;NSHM-1;AFGG-3
H2M1R1 OSLJ-10; PALJ-2; ACLJ-2;ALLJ-9;OSLJ-4;PALJ-1;PALJ-3;PALJ-4;PALJ-5;PALJ-6;BCPH-5;FVYL-1
H2M2R2 PPYL-2; OSLJ-8; TALX-1;OSLJ-1;OSLJ-7;CPGG-7
注:下划线菌株为16S rRNA基因测序菌株.
Note: The underlined strain is 16S rRNA gene sequencing strain.
2.4 产蛋白酶菌株16S rRNA基因序列的聚类分析

对经核苷酸测序获得的产蛋白酶菌株16S rRNA基因序列与ATCC标准菌株进行比对和聚类分析。分析结果表明:本次筛选的菌株均为芽胞杆菌(Bacillus sp.),获得的芽胞杆菌分属4种类型,分别为Bacillus subtilisBacillus pumilusBacillus cereusBacillus megatetium (图 3)。

图 3 产蛋白酶菌株的16S rRNA基因序列的聚类分析 Figure 3 Phylogenetic analysis of protease-producing strains using 16S rRNA gene sequences 注:括号里的数字代表GenBank中的序列号;每个分支上的数字代表进化百分数. Note: Numbers in parentheses represent the sequences accession number in GenBank; the number at each branch point is the percentage supported by bootstrap.
2.5 SCP、CAH和AXE多肽链氨基酸序列聚类分析

已有专利及文献表明,B. subtilis产生的SCP、CAH蛋白及B. pumilus产生的AXE蛋白均具有较高的过水解催化酶活[11-12],因此,本研究从分离到的B. subtilis NSYT-3菌株和B. pumilus OSLJ-13菌株中分别克隆上述酶蛋白基因。从B. subtilis NSYT-3菌株克隆的SCP蛋白的编码基因全长1 146 bp (NCBI登录号:MK673994),编码381个氨基酸,该肽链的氨基酸序列与已报道的B. licheniformisB. lentus产生的SCP蛋白(PDB登录号分别为:1AF4和1NDQ)的氨基酸序列的一致性(identity)分别为70%和60%。从B. subtilis NSYT-3菌株克隆的CAH蛋白的编码基因全长957 bp (NCBI登录号:MK673996),编码318个氨基酸,该肽链的氨基酸序列与已报道的B. subtilis产生的CAH蛋白(PDB登录号分别为:1ODS)其氨基酸序列具有高度的序列一致性,一致性达98%。从B. pumilus OSLJ-13菌株克隆的AXE蛋白的编码基因全长963 bp (NCBI登录号:MK673995),编码320个氨基酸,该肽链的氨基酸序列与已报道的B. pumilus产生的AXE蛋白(PDB登录号为2XLB)的氨基酸序列具有高度一致性,达97%。聚类分析结果显示,本研究克隆的3种酶蛋白与其他同功蛋白具有高度的序列一致性,分属于SCP、CAH和AXE三类酶蛋白家族(图 4)。

图 4 本研究克隆的3种酶蛋白多肽链氨基酸序列的聚类分析 Figure 4 Phylogenetic analysis of amino acid sequences from subtilisin carlsberg, cephalosporin acetyl hydrolase and acetyl xylan esterase, respectively 注:括号里的数字代表GenBank中的序列号;每个分支上的数字代表进化百分数. Note: Numbers in parentheses represent the sequences accession number in GenBank; The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap.
2.6 具有过水解酶催化活性的酶蛋白3D结构模拟

分别以已结构解析的SCP (PDB数据库:1AF4)、AXE (PDB数据库:2XLB)和CAH (PDB数据库:1ODS)为模板,对从B. subtilis NSYT-3菌株克隆的SCP蛋白、B. pumilus OSLJ-13菌株克隆的AXE蛋白和从B. subtilis NSYT-3菌株克隆的CAH蛋白进行同源建模,获得的PDB文件经YASARA软件优化并可视化后,从图 5A5B5C可以看出,模拟获得的3D分子结构均具有α/β水解酶折叠家族蛋白的结构特征,分子结构中央均为系列β-折叠片层结构,系列α-螺旋围绕在β-折叠片层结构的周围。基于序列比对预测为催化三联体的氨基酸残基之间(分析数据未显示,SCP蛋白高度保守的氨基酸残基为Asp138、His170和Ser327;AXE蛋白高度保守的氨基酸残基为Ser181、Asp269和His298;CAH蛋白高度保守的氨基酸残基为Ser181、Asp269和His298)均可形成氢键网络(键长均在1.767 Å−1.826 Å之间,与氢键键长范围相符,图 5D5E5F)。

图 5 从B. subtilis NSYT-3克隆的Subtilisin carlsberg和Cephalosporin acetyl hydrolase及从B. pumilus OSLJ-13克隆的Acetyl xylan esterase的3D结构模型及其活性中心催化三联体之间形成的氢键网络 Figure 5 3D structural model and hydrogen-bond network between the residues of the catalytic triad from B. subtilis NSYT-3 subtilisin carlsberg, B. subtilis NSYT-3 cephalosporin acetyl hydrolase and acetyl xylan esterase from B. pumilus OSLJ-13 注:A:从B. subtilis NSYT-3克隆的Subtilisin carlsberg的3D结构模型;B:从B. pumilus OSLJ-13克隆的Acetyl xylan esterase的3D结构模型;C:从B. subtilis NSYT-3克隆的Cephalosporin acetyl hydrolase的3D结构模型;D:组成Subtilisin carlsberg活性中心催化三联体的氨基酸残基及其氢键网络;E:组成Acetyl xylan esterase活性中心催化三联体的氨基酸残基及其氢键网络;F:组成Cephalosporin acetyl hydrolase活性中心催化三联体的氨基酸残基及其氢键网络. Note: A: The overall 3D structure of subtilisin carlsberg from B. subtilis NSYT-3. β-strands were represented as arrows and surrounded by α-helices. B: The overall 3D structure of acetyl xylan esterase from B. pumilus OSLJ-13. β-strands were represented as arrows and surrounded by α-helices. C: The overall 3D structure of cephalosporin acetyl hydrolase from B. subtilis NSYT-3. β-strands were represented as arrows and surrounded by α-helices. D: Asp138, His170 and Ser327 formed the catalytic triad of B. subtilis NSYT-3 subtilisin carlsberg within in the range of H-bond interactions. E: Ser181, Asp269 and His298 formed the catalytic triad of B. pumilus OSLJ-13 acetyl xylan esterase within in the range of H-bond interactions. F: Ser181, Asp269 and His298 formed the catalytic triad of B. subtilis NSYT-3 cephalosporin acetyl hydrolase within in the range of H-bond interactions.
3 讨论与结论

根际微生物与植物的互作可有效增强植物抗逆(及抗病)能力,提高植物吸收和利用各类营养物质,促进植物生长。如植物根际的Bacillus sp.、Pseudomonas sp.及Streptomyces sp.等菌株,通过合成抗生素、酶等代谢产物有效拮抗根结线虫的侵害[23]。Mandal等(2018)调查分析了植物根际芽胞杆菌菌株的种类,从植物根际土壤中分离并鉴定出具有不同生理功能(如溶磷、释氨、合成吲哚乙酸、抗真菌、产生淀粉酶、蛋白酶纤维素酶等酶蛋白)的10余种芽胞杆菌菌株[24]。根际微生物类型、丰度及其分泌的各种酶蛋白活性已成为判断土壤肥力的重要参考依据之一[25-26]。采用类似实验方法,本课题组先前从植物根际土壤中也快速分离到胞外脂肪酶高产菌株[27],比较并分析相关文献后发现,从植物根际土壤中分离获得胞外酶高产菌株的方法,较传统的从特定生境中筛选目的菌株(如从油污土壤中分离脂肪酶高产菌株、从屠宰场土壤中分离蛋白酶高产菌株)[28]具有诸多优点:(1)根际土壤中微生物种类更丰富,可以获得各种类型微生物菌株;(2)根际土壤中菌落数量更多,无需富集培养;(3)根际土壤微生物代谢活力强,胞外酶生产能力高。从植物根际筛选特定微生物菌群有可能成为一种简便快捷、具有通识性的途径和方法。

α/β水解酶折叠家族酶蛋白表现出来的过水解催化活性,属于其多功能催化活性(promiscuous activity),具有重要的开发价值。目前相关的专利及产品均为宝洁、杜邦等国际公司所垄断,因此,开发具有自主知识产权的过水解酶产品具有重要意义。本文从筛选到的芽胞杆菌菌株中克隆了不同类群具有过水解催化酶活的系列候选基因,候选基因后续的重组表达实验结果表明,从B. subtilis NSYT-3菌株克隆的CAH重组蛋白和从B. pumilus OSLJ-13菌株克隆的AXE重组蛋白均具有过水解催化活性,比活力分别为2.0 U/mg和0.9 U/mg,其对过氧化氢的Km分别为87.1 mmol/L和107.0 mmol/L。从B. subtilis NSYT-3菌株克隆的SCP基因在大肠杆菌中异源表达时,重组蛋白均形成了包涵体,其表达体系还有待进一步优化。葡萄糖氧化酶与上述重组蛋白偶联反应的催化效率及其在黑色素脱色中的应用效果正在评估中。同时,基于多肽链氨基酸序列比对,我们也发现不同菌种(菌株)编码的酶蛋白多肽链氨基酸残基在某些位点表现出强烈的菌种(菌株)差异性。如B. pumilus OSLJ-13 AXE蛋白多肽链的Pro235、Leu250和Phe300,在其他菌种(菌株)的AXE蛋白多肽链的相应位置分别被Arg、Gly和Gly所替代,结合模拟的3D结构对这些差异性位点进行深入分析,将有助于利用蛋白质工程手段快速提高酶蛋白的过水解催化活性或降低酶蛋白对过氧化氢的Km[7]

本研究结果将为后续深入研究α/β水解酶过水解催化活性的催化机理、相关酶制剂的制备开发等奠定基础。

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