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文章信息
- 刘进超, 刘芳华, 张月超, 孟德龙, 王学明, 肖雷雷
- LIU Jin-Chao, LIU Fang-Hua, ZHANG Yue-Chao, MENG De-Long, WANG Xue-Ming, XIAO Lei-Lei
- 铁锰氧化物提高巴斯德梭菌电子输出率
- Iron and manganese oxides enhance electron output efficiency of Clostridium pasteurianum
- 微生物学通报, 2020, 47(1): 24-34
- Microbiology China, 2020, 47(1): 24-34
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190191
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文章历史
- 收稿日期: 2019-03-12
- 接受日期: 2019-04-29
- 网络首发日期: 2019-05-15
2. 中国科学院大学 北京 100049;
3. 中国农业大学烟台研究院 山东 烟台 264670
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Yantai Research Institute, China Agricultural University, Yantai, Shandong 264670, China
能量驱动着生物体进行各种生命活动,生命活动所需的能量主要来源于以糖类、蛋白质和脂肪等有机物进行的产能代谢[1]。微生物通过氧化有机物产生电子,在电子传递到电子受体的过程中伴随着能量的产生,从而实现产能代谢[2]。与O2、NO3−和SO42−等可溶性电子受体不同,不溶性的变价金属氧化物也可作为微生物的电子受体,其结果是固体金属氧化物中的变价金属被还原为更低价态的离子,而微生物对这些金属元素无同化作用,则此过程称为异化金属还原(dissimilatory metal reduction)[3]。由于铁锰氧化物的氧化还原电势相对较高[4],因此当体系中存在这些氧化物时,还原性底物的利用率可能会提高。
对于异化金属还原,现在研究较多的是革兰氏阴性菌,如希瓦氏菌属(Shewanella)和地杆菌属(Geobacter),大量报道证实革兰氏阴性菌可以利用固态电极或者铁锰氧化物作为电子受体,同时固态电极或者铁锰氧化物也影响革兰氏阴性菌的电子输出效率。Kato等[5]构建了地杆菌微生物燃料电池(microbial fuel cell,MFC),通过向其中添加铁氧化物,发现铁氧化物提高了3株地杆菌(G. bremensis,G. pelophilus,G. metallireducens)的电流输出,然而降低了其中一株地杆菌(G. sulfurreducens)的电流密度。Kato等[6]研究了MFC中的阳极电势对地杆菌的电流密度的影响,发现在广泛的阳极电势范围内,G. metallireducens和G. sulfurreducens均可产生高电流密度,而G. daltonii和G. bemidjensis仅仅在较窄的阳极电势范围内产生相对较大的电流密度。在我们以前的研究中,通过构建G. metallireducens和G. sulfurreducens共生体系,发现向其中添加纳米磁铁矿会促进二者之间的电子传递[7]。近期我们也发现,向黄河三角洲原位土壤中添加纳米磁铁矿提高了甲烷的产生,这是因为纳米磁铁矿加速了Geobacter与甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)之间的电子传递[8]。但是,固态电极或者铁锰氧化物是如何影响革兰氏阳性菌电子输出效率的研究还比较少。
梭菌属(Clostridium)属于革兰氏阳性微生物,是重要的发酵研究对象,在其代谢过程中,有机物被部分氧化,且释放的电子转移至内源性中间代谢产物中,以底物水平磷酸化产能[9]。同时,越来越多的梭菌被发现具有异化还原金属的能力[10-12],所以许多梭菌是发酵型异化金属还原菌(fermentative dissimilatory metal-reducing microorganisms),当外部环境存在含Mn(Ⅳ)/Fe(Ⅲ)氧化物时,仅有少于5%的电子传递至这些含变价金属的氧化物,但胞外电子受体的缺失并不影响发酵型异化金属还原菌的存活[13]。近期我们从黄河三角洲也分离了一株同时具备产电、异化金属还原和产氢能力的梭菌Clostridium bifermentans EZ-1[14],向EZ-1中添加弱晶型的水铁矿,该梭菌总的电子输出率提高了53.5%,并且水铁矿的添加改变了EZ-1的产氢代谢途径[15]。然而,对于结晶程度更高的铁锰氧化物如何影响发酵型异化金属还原菌电子输出率还知之甚少。
本研究以发酵型异化金属还原菌Clostridium pasteurianum为研究对象,分别向培养体系添加不同浓度的纳米Fe2O3和MnO2,通过检测发酵体系pH值、Clostridium代谢底物和产物的变化情况,并计算发酵过程的电子输出率,以此评估对于铁锰氧化物的添加,发酵型异化金属还原菌电子输出率是如何响应的。
1 材料与方法 1.1 菌株、主要试剂和仪器所用的微生物菌株是C. pasteurianum DSM 525,购自DSMZ菌种库。DSM 525是革兰氏阳性菌,严格厌氧,可产芽孢[16],其主要发酵代谢途径为[17]:
(1) |
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将冻存于−80 ℃超低温冰箱中的DSM 525菌株接种至MSG培养基中并传至3代。MSG培养基改良自文献[18]。MSG基本培养基(g/L):大豆蛋白胨0.50,胰蛋白胨0.50,葡萄糖10.00,NaCl 5.00,KH2PO4 0.54,K2HPO4·3H2O 2.10。混合液A:Mineral:Trace element:Vitamin按48:1:1 (体积比)组成。Mineral溶液(g/L):NH4Cl 6.00,NaCl 6.00,CaCl2·2H2O 0.20,MgCl2·6H2O 2.00;Trace element溶液(g/L):FeCl2·2H2O 2.00,ZnCl2 0.05,MnCl2·4H2O 0.05,CuCl2·2H2O 0.03,(NH4)6MnO24·4H2O 0.05,AlCl3 0.05,CoCl3·2H2O 0.20,H3BO3饱和溶液1 mL,浓盐酸1 mL;Vitamin溶液(g/L):生物素0.002,叶酸0.002,维生素B6 0.010,核黄素0.005,维生素B1 0.005,烟酸0.005,维生素B12 0.005,对氨基苯甲酸0.005,泛酸0.005。混合液B:L-半胱氨酸盐酸盐溶液:Na2S溶液按49:1 (体积比)组成。L-半胱氨酸盐酸盐溶液(g/L):NaHCO3 80.00,L-半胱氨酸盐酸盐1.00;Na2S溶液为242.00 g/L。基本培养基与混合液A和B的比例为100:1:1 (体积比)。
实验所用的α-Fe2O3购自阿拉丁公司,颗粒直径30 nm,纯度为99.5%;MnO2购自北京德科岛金公司,颗粒直径50 nm,纯度为99.9%。称取适量α-Fe2O3和MnO2并将其配置成母液。
紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;电化学分析仪和多通道恒电位仪,上海辰华仪器有限公司;气相色谱和高效液相色谱,安捷伦科技有限公司。
1.2 DSM 525铁锰氧化物还原及生理检测实验配制MSG基本培养基,分装20 mL至50 mL西林瓶内,曝氮气30 min使体系无氧,丁基橡胶塞密封,铝盖加固,1.7×105 Pa高压蒸汽灭菌30 min。待灭菌完成冷却后,分别添加0.2 mL混合液A和B至体系中,然后分别添加终浓度2.5、10 mmol/L的Fe2O3、MnO2至体系中,设置不接菌对照组,实验组转接5%的指数生长期(OD600=0.72)的DSM 525,定时取样测定其中的Fe(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)浓度,以及H2、CO2、葡萄糖和有机物含量。发酵结束后,测定发酵体系的pH值。
1.3 电化学活性表征与生长曲线测定构建单室微生物燃料电池(single-chamber microbial fuel cell,SCMFC)表征DSM 525的产电能力。将配好的培养基倒入阳极室,工作电极和对电极选用钛丝连接的石墨电极(20×20×0.2 mm),使用抽换气装置将阳极室空气置换为氮气,最后将电池灭菌。以甘汞电极作为参比电极,向电池内接入5% DSM 525,而另一个不接菌的电池作为对照。使用多通道恒电位仪对两个电池的产电情况进行测定。测定电流所加电压为0.4 V,敏感度为1.0×10−4,每隔2 s记录电流。循环伏安扫描操作过程:将上述MFC的三电极连接到电化学分析仪,设置最低且起始电压为−1 V,最高且最终电压为1.2 V,扫描速度是50 mV/s,共4个扫描片段,每0.001 s记录数据,敏感度设置为0.001 A/V。
向新鲜的培养基中接种5%的菌液,在30 ℃中的暗室中培养,定期取样,紫外分光光度计600 nm波长下测定吸光值。
1.4 Fe(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)浓度测量菲啰嗪(ferrozine)显色法测定Fe(Ⅱ)含量[19]。取样品0.1 mL注入离心管中,随即取0.5 mmol/L的盐酸0.9 mL加入其中,静置24 h后,5 000 r/min离心3 min,取0.1 mL上清液到新的离心管中,加入1.9 mL 0.1%的菲啰嗪显色液,在室温下反应5 min后,紫外分光光度计562 nm波长下测定吸光值,并根据制定的标准曲线计算样品的Fe(Ⅱ)含量。
甲醛肟法测定Mn(Ⅱ)含量[20-21]。甲醛肟溶液:4% (质量体积比)盐酸羟胺,0.74% (质量体积比)甲醛溶液,将以上溶液与氨水(25%−28%)按1:0.4的体积比混合为分析试剂。取0.5 mL样品溶液过滤,取0.1 mL样品与1.9 mL分析试剂混合,在室温下反应5 min后,紫外分光光度计450 nm波长下测定吸光值,并根据制定的标准曲线计算样品的Mn(Ⅱ)含量。
1.5 气体及有机物摩尔浓度测定取顶空气体样品0.2 mL,使用配置热导检测器(thermal conductivity detector,TCD)的气相色谱仪对H2和CO2摩尔浓度进行分析[22]。TCD温度设置为250 ℃,进样口温度为80 ℃,柱箱温度为80 ℃。以N2为载气,流速为5 mL/min。H2的出峰时间是0.88 min,CO2的出峰时间是2.3 min。
高效液相色谱仪对发酵底物葡萄糖和产物乙酸和丁酸进行分析[8]。检测器为示差折光检测器(refractive index detector,RID),温度55 ℃;色谱柱为Hi-Plex H (300×7.7 mm),柱温60 ℃;5 mmol/L稀硫酸溶液作流动相,流速0.6 mL/min。葡萄糖的出峰时间为10.4 min,乙酸出峰时间为16.3 min,丁酸出峰时间为24.5 min。
1.6 电子输出量与电子输出率计算方法本文中的电子输出是指电子转移到a物质生成b物质(电子输出的产物),根据b物质与电子的化学计量关系计算电子输出量,将所有电子输出量相加即为该组总电子输出量。电子输出率的计算方法为[15]:将对照组总的电子输出量c定义电子输出率为100%,实验组中电子输出量是对照组的n倍,则实验组的电子输出率为100n%,这是一种直观表示实验组与对照组电子输出关系的方式。
根据公式(1)可知,1 mol C6H12O6发酵生成2 mol乙酸,释放8 mol电子[23],8 mol电子转移给质子,在梭菌氢酶的作用下生成4 mol氢气,因而该反应中氢气是电子输出产物,每生成1 mol氢气的电子输出量是2 mol。公式(2)中,1 mol C6H12O6发酵生成CO2释放8 mol电子,只有4 mol质子接收4 mol电子生成2 mol氢气,意味着每生成1 mol丁酸接收了4 mol电子,则该公式中根据氢气和C4H8O2物质的量计算电子输出即可。实验组中,加入铁锰氧化物,发生反应为:
(3) |
(4) |
从中可以看出,Fe2+和Mn2+也是电子输出产物,根据公式(3)、(4)中的化学计量关系,计算电子输出量。
1.7 数据分析应用IBM SPSS statistics 25对数据显著性进行t检验分析和曼-惠特尼U检验分析。
2 结果与分析 2.1 DSM 525电活性表征将5% DSM 525接种到SCMFC阳极室,并实时检测SCMFC电流密度。结果如图 1A所示,相对于不接菌的对照组,接种DSM 525的实验组随培养时间的增加,电流密度逐渐增大,且在32 h达到最大值0.93 mA/m2,32 h后逐渐降低。从生长曲线来看(图 1B),DSM 525在30 h后基本进入指数期末期,此时必要营养成分没有特别限制生长,菌体密度接近最大,代谢葡萄糖速度快,产生大量电子传递到电极,表现为电流密度的增大。随着葡萄糖的大量消耗和代谢产物的累积,DSM 525从稳定期进入衰亡期,电流密度趋于0 mA/m2。循环伏安扫描结果(图 1C)显示,对照组的曲线平滑且无氧化还原峰,与之相比,实验组的电流明显较大,在0.8 V处有还原峰,说明DSM 525可能产生还原性的代谢产物,但没有氧化峰,表明DSM 525可能不是通过电子穿梭机制进行胞外电子传递。以上结果表明,DSM 525是一株具有胞外电子传递能力的电活性微生物,在MFC中可以将胞内有机物氧化产生的电子传递到固体电极表面,从而产生电流。
2.2 DSM 525厌氧还原铁锰氧化物将Fe2O3和MnO2分别添加到接种DSM 525培养体系中,检测体系中Fe2+和Mn2+浓度随培养时间的变化情况。结果如图 2所示,接菌的实验组中,随时间的增加,体系中累积的Mn2+和Fe2+物质的量越高,而不接菌的对照组Mn2+和Fe2+物质的量基本为零,表明DSM 525可以厌氧还原铁锰氧化物。当添加浓度均为2.5 mmol/L时,体系中最大Mn2+物质的量(0.040 mmol)要高于Fe2+ (0.026 mmol),MnO2的还原率为82.9%,Fe2O3的还原率为27.2%;当添加浓度均为10 mmol/L时,体系中Fe2+物质的量(0.071 mmol)要高于Mn2+ (0.061 mmol),MnO2的还原率为33.3%,Fe2O3的还原率为18.6%。以上结果表明,相较于Fe2O3,DSM 525更易于还原MnO2,这可能是因为MnO2/Mn2+氧化还原电势高于Fe2O3/Fe2+,因而接受电子的趋势更强[24]。
2.3 Fe2O3和MnO2促进DSM 525底物消耗如图 3所示,在含有Fe2O3的接菌实验组中,与不含铁锰氧化物的接菌对照组相比,前18 h葡萄糖消耗量和消耗速率无明显差异;18−36 h,添加2.5、10.0 mmo/L Fe2O3的实验组中,葡萄糖消耗量(0.38 mmol,0.39 mmol)均高于对照组(0.32 mmol),且实验组中的葡萄糖消耗完全,而对照组仍有0.06 mmol葡萄糖未消耗。相比Fe2O3,仅6 h后,添加MnO2实验组中葡萄糖消耗量与对照组存在显著差异,6−24 h的消耗量最大为0.61 mmol,大于对照组(0.47 mmol)和Fe2O3实验组(0.53 mmol);而在24−36 h,Fe2O3添加组葡萄糖消耗量(0.24 mmol)高于MnO2添加组(0.15 mmol)。以上结果表明,Fe2O3和MnO2的添加显著增加了DSM 525葡萄糖消耗量和消耗速率。另外,金属氧化物浓度梯度不同(2.5、10.0 mmo/L)对于葡萄糖消耗速率和消耗量的影响无显著差异。
2.4 Fe2O3和MnO2促进DSM 525代谢产物累积由公式(1)和(2)可知,DSM 525代谢葡萄糖的产物主要是H2、乙酸、丁酸和CO2。DSM 525代谢葡萄糖产物的变化情况如图 4所示。在不含铁锰氧化物的接菌对照组中,葡萄糖消耗量为0.75 mmol,理论上最大氢产量为3.0 mmol,而实际为1.02 mmol,产氢效率为34%;Fe2O3添加的实验组中,葡萄糖消耗量为0.81 mmol,理论产氢量为3.24 mmol,实际产氢量为1.24 mmol (图 4A),产氢效率为38.2%;添加MnO2的实验组中,葡萄糖消耗量为0.80 mmol,理论产氢量为3.20 mmol,实际产氢量为1.12 mmol (图 4B),产氢效率为35%。经过t检验可知,除了10 mmol/L MnO2添加无显著影响(P > 0.05),其它实验组的氢气产量和产氢效率相比对照有显著增加。
对照组中,乙酸和丁酸最大产量分别为0.24 mmol和0.44 mmol;Fe2O3实验组的乙酸和丁酸最大产量分别为0.33 mmol (图 4C)和0.54 mmol (图 4E);MnO2实验组的乙酸和丁酸最大产量分别为0.30 mmol (图 4D)和0.47 mmol (图 4F)。t检验分析可知,除了10 mmol/L MnO2添加无显著影响(P > 0.05),其它实验组的乙酸、丁酸产量相比对照有显著增加。这表明适量铁锰氧化物的添加会同时促进两种产氢代谢途径。
Fe2O3和MnO2添加对体系CO2累积的影响如图 4G、H所示,对照组中CO2最大量为0.53 mmol,添加MnO2实验组中CO2最大量为0.56 mmol,添加Fe2O3实验组中CO2最大量为0.59 mmol。同样地,通过t检验分析发现除了10 mmol/L MnO2添加无显著影响(P > 0.05),其它实验组的CO2产量相比对照有显著增加。细胞内有机物经一系列氧化分解生成CO2,因此CO2在一定程度上可以反映细菌数量、酶活性等微生物生长状态。以上结果表明,低浓度铁锰氧化物(2.5 mmol/L)可以促进DSM 525发酵代谢,更有利于其生长;而高浓度铁锰氧化物(10.0 mmol/L)虽能促进DSM 525葡萄糖发酵代谢,但由于大量铁锰离子释放,可能对DSM 525有一定毒性;因为铁是微生物所需的大量元素,而锰是微量元素[25],因此大量的锰离子对DSM 525毒害性更强。
通过发酵产物物质的量计算发酵过程电子输出和电子输出率的情况如表 1所示。整体上,Fe2O3和MnO2的添加分别提高DSM 525总的电子输出率24.27%和10.82%,Fe2O3促进效果相比MnO2更优。尽管还原Mn(Ⅳ)的电子输出量(0.079 mmol,0.12 mmol)要高于还原Fe(Ⅲ) (0.026 mmol,0.071 mmol),但Fe2O3实验组总电子输出物质的量(4.55 mmol,4.71 mmol)要高于MnO2添加实验组(4.20 mmol,4.17 mmol),且均高于对照组的电子输出物质的量(3.79 mmol)。高浓度Fe2O3添加实验组还原Fe(Ⅲ)的电子输出率是其低浓度添加实验组的2.6倍;高浓度MnO2添加实验组还原Mn(Ⅳ)的电子输出比率是其低浓度添加实验组的1.5倍。另外,通过计算金属还原所占电子输出比率可知,最高为2.88%,低于5%,这与以前的研究[13]吻合。
项目 Item |
对照 Control |
Fe2O3 (mmol/L) | MnO2 (mmol/L) | |||
2.5 | 10 | 2.5 | 10 | |||
H2 (mmol) | 2.04±0.14 | 2.48±0.03 | 2.48±0.04 | 2.24±0.11 | 2.18±0.18 | |
丁酸Butyrate (mmol) | 1.75±0.12 | 2.04±0.04 | 2.16±0.08 | 1.88±0.07 | 1.87±0.03 | |
Fe(Ⅱ)/Mn(Ⅱ) (mmol) | 0 | 0.026±0.002 1 | 0.071±0.005 3 | 0.079±0.03 | 0.12±0.03 | |
电子输出Electron output (mmol) | 3.79 | 4.55 | 4.71 | 4.20 | 4.17 | |
总电子输出率 The total electron output efficiency (%) |
100.00 | 120.05 | 124.27 | 110.82 | 110.03 | |
金属还原所占电子输出比率 Electron output ratio of metal reduction (%) |
0 | 0.57 | 1.51 | 1.88 | 2.88 |
为了探索Fe2O3和MnO2对发酵体系pH值的影响,发酵结束后,测试pH值结果如图 5所示,仅添加铁锰氧化物而不接种DSM 525的对照组中发酵前后pH值无显著差异,pH值均为6.70左右,经曼-惠特尼U检验发现它们之间并无显著差异,表明不同浓度铁锰氧化物的添加不会改变培养基的pH值,排除了初始pH值差异对DSM 525发酵过程的影响。仅接种5% DSM 525的对照组和添加铁锰氧化物且接种5% DSM 525的实验组中,由于大量发酵代谢产物乙酸和丁酸的累积及CO2的溶解,pH值均大幅降低;统计学分析结果显示,二者终pH值无显著差异,但相比未添加铁锰氧化物的对照,铁锰氧化物的添加显著促进了DSM 525代谢产物——乙酸、丁酸和CO2的产生(图 4)。由此表明,铁锰氧化物的添加可以有效缓冲发酵过程中由于发酵产物酸累积导致pH值的快速下降。pH值是影响发酵的重要限制因素,过低的pH值会抑制发酵过程的继续进行,而铁锰氧化物的添加可以有效缓冲发酵体系中pH值的快速下降,促使发酵过程继续进行,提高底物利用率。
3 讨论与结论发酵型微生物具有多种发酵途径,如乙醇发酵、丁酸发酵和混合酸发酵等。发酵型微生物通过发酵获取能量用于生命活动,同时发酵型微生物也被广泛用于工业发酵,从而获得高附加值的产物。提高发酵效率一直以来都是人们所关注的热点问题。近些年,纳米技术领域的快速发展加速了其在生物过程方面的潜在应用价值。由于纳米颗粒易于制备和特殊的理化特性,将纳米颗粒添加到体系中提高发酵效率具有较好的研究前景。
本研究测试了Fe2O3和MnO2对C. pasteurianum DSM 525发酵代谢的影响,结果表明DSM 525具有产电能力,且能厌氧还原铁锰氧化物中的Fe(Ⅲ)/Mn(Ⅳ)。近些年,研究发现多种梭菌属如C. butyricum[11]、C. sporogenes[12]、C. bifermentans[14]等具有电化学活性。相比于革兰氏阴性菌,革兰氏阳性菌因细胞壁厚、具有电子传递能力的细胞色素蛋白相对较少等原因,胞外电子传递机制研究滞后。大量研究发现,梭菌属发酵体系的循环伏安扫描结果存在氧化还原峰[11-12, 14],表明通过产生具有氧化还原性物质作为电子穿梭体可能是梭菌胞外电子传递重要机制之一,而本研究的DSM 525仅有还原峰,说明梭菌中可能也存在其它胞外电子传递机制。
铁锰氧化物的添加提高了DSM 525的电子输出率,其潜在的机制可归纳为3点:(1)铁锰氧化物的加入增加了额外的电子输出途径,使得DSM 525消耗更多的葡萄糖,从而产生更多电子;(2)铁锰氧化物的还原可以缓冲发酵体系pH值,降低产物(乙酸和丁酸)抑制效应,从而更有利于DSM 525高效发酵;(3)静置培养条件下,铁锰氧化物从上到下分布密度逐渐增加,上下分布不均使得DSM 525电子输出存在差异,使得同菌株间产生电势差,有利于种内电子传递。
本研究发现,添加铁锰氧化物的实验组中葡萄糖消耗量明显高于对照组,MnO2接受电子的趋势更强,而实验前期MnO2实验组葡萄糖消耗量也高于Fe2O3实验组,以上结果表明,铁锰氧化物的加入激活了DSM 525胞外电子传递通路,增加了体系中电子输出的需求,促进底物葡萄糖的消耗,以产生更多电子满足需求。在我们最新的研究中,以10.0 g/L葡萄糖为底物并接种DSM 525的体系里,对照组DSM 525只消耗了68%的葡萄糖,当添加无定形水铁矿后,葡萄糖消耗完全[26]。Zhao等[27]向混合体系(C. butyricum丰度较高)中添加磁铁矿,提升了葡萄糖的转换效率。Popovic等[28]发现,正常情况下C. beijerinckii代谢木糖的能力较弱,当向体系中添加弱晶型的Fe(OH)3和两种典型的电子穿梭体(蒽醌-2, 6-二磺酸钠和核黄素)后,电子穿梭体加速了C. beijerinckii与Fe(OH)3的电子传递,木糖利用增加的同时丁醇产量提升。
pH对微生物的生长影响不可忽视,因而在发酵过程中的pH控制十分必要。铁锰氧化物的添加可以有效缓冲发酵体系pH值,有利于发酵过程持久高效的进行。我们此前的研究结果也表明水铁矿具有缓冲体系pH值的作用[26]。Beckers等[29]利用C. butyricum在可控pH值的厌氧序批式反应器中发酵产氢,共运行15个周期,在第一个周期内,发酵体系pH值从7.6降至5.2,之后控制在5.2左右,然而第一个周期的产氢量仅为1.7 L,而后面周期的产氢量为3.0−3.3 L,此外的许多研究也都表明了pH对发酵过程的持续进行具有重要的调节作用[30-31]。近年来,有研究发现异化还原金属氧化物与缓冲pH值直接关联的新机制,Orenia metallireducens Z6是一株发酵产氢气、有机酸的发酵型微生物,同时可进行异化铁还原,其铁还原过程耦合氢气和质子的消耗,缓冲了pH值的下降,从而促进了发酵过程的持续进行[32]。
近些年,微生物种间直接电子传递(direct interspecies electron transfer,DIET)一直是研究的热点,不同种的微生物通过DIET获得能量,实现互营生长。然而均一的纯培养体系下同种微生物性质基本相同,难以设置条件区别同种微生物互营与否,目前种内电子传递的概念和相关研究较为匮乏,在静置培养条件下,纳米颗粒因重力作用在体系中分布不均,使得微生物与其接触程度存在差异,从而使同种微生物间产生电势差,创造了利于DSM 525种内电子传递的条件。
本文结果表明,适量铁锰氧化物的添加促进了DSM 525发酵代谢葡萄糖,从而产生更多电子满足电子输出的需求,更多的电子转移到内源性代谢产物,使得最终产物累积增多;另外,铁锰氧化物的添加对于体系pH值有一定缓冲作用,这也可能是铁锰氧化物促进DSM 525发酵的重要原因之一。化学计量分析结果表明,铁锰氧化物的添加显著促进了C. pasteurianum电子的胞外输出率。本文研究结果进一步拓展了对铁锰氧化物与发酵型异化金属还原菌之间相互作用机制的认识。
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