多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一类含有两个及两个以上苯环的化合物，是工业生产中一种重要的工业原料及产品，由于在环境中难以自然降解而长期存留，具有潜在的“三致效应”，一直受到研究者密切关注^[1]。

微生物降解是多环芳烃降解的主要途径，目前关于微生物降解多环芳烃的相关酶类多有报道。邻苯二酚(又名儿茶酚)是芳香族化合物降解过程中一种重要的中间产物，邻苯二酚双加氧酶是一类含铁的氧化酶，是降解邻苯二酚的关键酶，它能够断裂邻苯二酚的苯环结构并在断裂的碳原子两端加上一个氧原子，使得多环芳烃类化合物转化为长碳链并最终进入三羧酸循环而降解为二氧化碳和水^[2]。这一类能够使苯环结构开环的酶类在芳香族化合物降解的过程中发挥了重要作用，在多种细菌尤其是土壤菌株中广泛存在^[3]。

邻苯二酚双加氧酶根据开环位置的不同，可以分为邻苯二酚1, 2-双加氧酶(Catechol 1, 2-dioxygenases，C12O)和邻苯二酚2, 3-双加氧酶(Catechol 2, 3-dioxygenases，C23O)^[4]，C12O催化邻苯二酚内开环生成顺, 顺-粘康酸(Cis, cis-Muconic acid)，是邻位裂解途径(图 1)中的关键酶，而邻苯二酚2, 3-双加氧酶催化邻苯二酚外开环生成粘康酸半醛(2-Hydroxymuconic semialdehyde)，是间位裂解途径中的关键酶，这两条降解途径是多环芳烃降解过程中最重要的分支。

1 C12O的基本特点及分类

邻苯二酚在C12O的作用下，通过邻位裂解途径打开苯环，这一途径又叫β-酮己二酸途径。C12O是β-酮己二酸途径中的关键酶，属于内二元醇双加氧酶家族。邻苯二酚通过C12O催化生成产物顺, 顺-粘康酸，在下游粘康酸环异构酶Ⅰ、异构酶Ⅰ、水解酶的作用下继续分解，其代谢最终生成琥珀酸盐和乙酰辅酶A，将有毒性的芳香族化合物通过细菌代谢为可进入三羧酸循环的化合物^[5]。C12O催化得到的中间产物顺, 顺-粘康酸也是合成新型树脂材料、药物、农药的重要原料。

根据底物特异性的不同，目前C12O可分为三类，第一类C12O对氯儿茶酚有很好的催化作用，在氯代芳香族化合物的降解途径中起到了重大作用；第二类C12O对儿茶酚、4-甲基儿茶酚具有相对高的活性；第三类C12O对3-甲基儿茶酚、4-甲基儿茶酚具有较高的活性，这类酶在革兰氏阳性菌中分布最为广泛^[6]。

2 C12O的结构特点

邻苯二酚1, 2-双加氧酶、原儿茶酸3, 4-双加氧酶(Protocatechuate 3, 4-dioxygenase，3, 4-PCD)、偏苯三酚1, 2-双加氧酶(Hydroxyquinol 1, 2-dioxygenase，1, 2-HQD)是3种能够只用非血红素铁作为辅因子催化邻位裂解途径的氧化酶类，属于非血红素铁加氧酶大家族，在结构上具有相似性^[7]。1988年第一次对3, 4-PCD的晶体衍射发现，非血红色铁作为辅因子被2个组氨酸残基和2个酪氨酸残基所固定，与一个水分子或羟基基团构成3, 4-PCD的活性中心^[8]，之后通过对Acinetobacter sp.ADP1和Pseudomonas arvilla C-1中的C12O进行了晶体衍射，对C12O的结构也有了一定的了解^[9]。

通过X射线衍射结构发现，酶和底物的结合域位于Leu73、Pro76、Ile105、Pro108、Leu109、Arg221、Phe253、Ala254所构成的袋状结构，其中Ile105、Pro108、Arg221和Phe253在C12O家族中高度保守^[10]，C12O与3, 4-PCD的结构相似，大多是由两个相同亚单位形成的二聚体，每个亚单位的分子量大都在30−34 kD，每个亚单位包括一个三价的铁离子，这个铁离子被两个组氨酸、两个酪氨酸和一个羟基基团固定，共同形成一个三角双锥型结构并构成了C12O催化的活性中心，与3, 4-PCD不同的是，每个C12O均包含两分子的磷脂，同时在两个亚单位的连接部分，C12O形成一个特殊的螺旋拉链式结构域^[11]。扫描C12O和底物结合的结构发现，原本约束铁离子的酪氨酸和羟基不再与铁离子相连，形成一个铁离子在中心的八面体空间构象，使得底物能够与铁离子结合形成复合体^[12](图 2)。

3 C12O的酶学特性 3.1 C12O的酶活测定

邻苯二酚经过C12O催化后生成的裂解产物顺, 顺-粘康酸在260 nm处有特异性吸收峰，因此可通过测定260 nm处反应溶液的光吸收值，来测定C12O的酶活，其吸光系数ε[L/(mol·cm)]=16 800^[13]。

3.2 C12O的酶学性质

3.2.1 C12O的基本酶学性质

C12O最适反应pH多在7.0−8.0之间，当pH大于9.0或小于6.0时，酶活即迅速下降。当C12O在25 ℃以邻苯二酚作为底物进行反应时，K_m值大多在1−10 mmol/L之间，不同菌属间无明显差异。大多数C12O的最佳反应温度为45 ℃，研究者发现也有喜温性的C12O，嗜热土芽孢杆菌分泌的耐热C12O最适反应温度高达60 ℃^[14]，甚至当温度达到90 ℃时依然能保持一定的活性。大多数C12O耐热性较差，超过40 ℃ 10 min即迅速失活。

C12O的底物特异性与其菌种来源有一定的关系^[15]，一般而言，革兰氏阳性菌中C12O通常对邻苯二酚和甲基邻苯二酚具有较高的催化效率，对邻位和间位的甲基邻苯二酚催化效率没有差异性，而革兰氏阴性菌中C12O则仅对4-甲基邻苯二酚具有较高的催化效率，对邻苯二酚及甲基邻苯二酚的催化效率较低，其中的结构差异还需要进一步的研究^[16]。

3.2.2 C12O在不同介质下的酶活

为了解C12O在不同环境下酶学特性的差异，一些学者尝试在不同介质中测定C12O的酶学特性。Sanakis等为了解天然状态下C12O的性质，从Pseudomonas putida DSM437分离得到C12O，并在完全无水的有机环境中测定了C12O的酶学性质，并对水环境和有机环境中酶学性质的差异作了理论上的分析，结果发现在有机环境中酶依然具有催化活性但酶活力已大大减小^[17]，而Di Nardo等则尝试把纳米材料应用到酶学研究中，他们将C12O固定化到一种新型材料纳米海绵上，使得C12O的K_m值从2.0±0.3 mmol/L，提高到16.6±4.8 mmol/L，最适反应温度从30 ℃提高到50 ℃，同时对环境的耐受性更好^[18]。Guzik等则通过海藻酸钙凝胶将C12O进行固化，从而增加其稳定性和降解效率，结果发现通过海藻酸钙凝胶固化后的C12O具有更低的最适反应温度，更大的底物降解范围及对外界环境更强的抵抗性^[19]。

4 C12O同工酶及表达调控 4.1 C12O的编码基因

自1950年Hayaishi首次报道C12O以来^[20]，邻苯二酚1, 2-双加氧酶得到了广泛研究，已在不动杆菌属、红球菌属、鞘氨醇单胞菌属、假单胞菌属等多种菌属中克隆得到多个C12O基因^[21-23]。

当前报道的大多数C12O编码基因都命名为catA，由936个核苷酸组成，多位于catRBCA基因簇上，受调控基因catR调节。大部分catA都位于细菌的基因组上，也有少数位于质粒上。例如，Pseudomonas putida ND6菌株中的质粒pND6-1上存在一个单独的C12O编码基因catA，序列分析发现其周围有转座基因，因此很有可能是基因水平转移的结果^[24]。

4.2 C12O的同工酶

除了在多个种属中克隆到C12O编码基因外，在多个芳香烃降解菌株中报道了C12O同工酶的存在^[25-26]，例如Frateuria species ANA-18^[27]和Acinetobacter lwoffii K24^[28]中都发现有2种不同的C12O (CatA₁和CatA₂)，Arthrobacter BA-5-17中有4种不同的C12O^[29]。我们课题组前期在天津市南排污河废水中分离得到一株可以高效降解萘的Pseudomonas putida ND6^[30]。通过全基因组测序发现ND6中也存在4个不同的C12O编码基因^[31]，其中3个位于ND6基因组上，一个位于ND6特有的质粒pND6-1上，这4个C12O编码基因分属不同的基因簇，一致性约70%，在系统发育树上属于不同的分支。

长期进化使得微生物具有非常经济的基因组，而芳香烃降解细菌中C12O同工酶现象因何存在，是否有助于其提升降解芳香烃的能力，值得思考和研究。回顾文献可发现，同工酶往往出现在降解途径的限速步骤，例如芳香烃降解过程中编码芳环羟基化双加氧酶和芳环断裂双加氧酶的基因。邻苯二酚是多种芳香烃降解过程的共同中间产物，其开环过程是芳香烃代谢共有的限速步骤，因此邻苯二酚间位(meta-)和邻位(ortho-)两种降解途径共存在芳香烃降解菌中十分常见，例如苯甲酸降解菌Pseudomonas putida P8、萘降解菌Pseudomonas putida G7和Pseudomonas putida NCIB 9816等^[32-34]。由于芳香族物质代谢过程中多有毒性产物积累，即便是能够以芳香烃为唯一碳源和能源生长的降解菌，芳香烃降解的中间代谢产物也会对其造成细胞毒性。因此，这些针对中间产物的催化步骤也往往存在同工酶，以增加酶的剂量，减轻这些中间产物对细胞的毒害。我们的研究^[35]也佐证这一推论，当采用较高的萘浓度(4 g/L)胁迫萘降解菌ND6菌株后，检测其蛋白表达谱变化，发现与萘降解相关的上调的蛋白一共有4个，分别是两个C12O蛋白及其下游的粘糠酸环异构酶。其次，由于儿茶酚开环步骤的重要性，C12O的同工酶现象也可以增强微生物对于该基因突变的适应性。我们研究发现，ND6菌株中所有的C12O编码基因在萘降解过程中均发挥生物学活性，敲除其中任意一个编码基因，萘降解能力虽然略有下降，但是不会丧失(结果正在整理中)。Pseudomonas putida mt-2菌中既有儿茶酚的邻位开环途径，也有儿茶酚间位开环途径，其含有2个C12O基因(catA₁，catA₂)，catA₂对于维持mt-2菌株中TOL质粒pWW0的稳定存在具有十分重要的意义^[36]。再次，我们发现ND6菌株中有4个C12O同工酶，这4个C12O在最适反应pH及底物特异性方面比较相似，但是，在最适反应温度、米氏常数等方面又有所不同，这些差异有利于ND6菌株适应不同的环境条件^[37]。C12O同工酶酶学性质差异的现象在Frateuria species ANA-18^[38]和Acinetobacter radioresistens S13^[39]等菌株中也存在。

4.3 C12O同工酶编码基因的表达调控

C12O同工酶编码基因的表达一种是菌体内组成型表达，另一种则与特定的芳香族化合物诱导有关。C12O能够被苯胺苯甲酰胺、甲苯、苯甲醇、苯甲酸盐和苯酚等多种化合物诱导产生，细菌内多个编码C12O的基因根据诱导物的不同而具有不同的调控模式。例如在Acinetobacter radioresistens S13中，如果以苯酚作为碳源培养时，菌体内只能合成一种C12O，而以甲苯作为碳源培养在同样条件下培养时，菌体内则可以产生2种不同的C12O同工酶^[39]。Burkholderia sp. TH2^[25]在甲苯中培养时可产生两种不同的C12O (CatA₁和CatA₂)，但在氯苯甲酸中却只能合成一种C12O (CatA₂)，通过基因敲除去掉catA₂后发现catA₂对细菌生长并不是必需的，但可以提高在氯苯甲酸中的生长状态，在嗜盐单胞菌属G-16.1中，以苯酚作为碳源培养产生的C12O比以苯甲酸作为碳源培养产生的C12O活性高了接近一倍^[40]。而我们的研究还发现，ND6菌株中染色体上的2个编码儿茶酚邻位开环的基因簇(catR_ⅠB_ⅠC_ⅠA_Ⅰ和catR_ⅡB_ⅡC_ⅡA_Ⅱ)可以交互调控，敲除任意一个调控基因(catR_Ⅰ或catR_Ⅱ)，另一个基因簇仍然可以表达(结果正在整理中)。

综上所述，对降解菌株中C12O同工酶存在的生态学意义提出以下推断：

(1) C12O催化的儿茶酚开环是芳烃降解的限速步骤，因而同工酶的存在可以增加酶的剂量，减少儿茶酚积累对菌体细胞的危害。

(2) 由于儿茶酚开环步骤的重要性，C12O同工酶的存在降低了基因突变带来的风险，提高了细菌的适应性。

(3) C12O同工酶的氨基酸序列往往存在差异，因此其酶学性质也不尽相同，对增强细菌对芳烃的利用及环境适应性都是有利的。

(4) C12O同工酶的表达调控模式也往往不一样，并存在同工酶所在操纵子的交互调控现象。

因此，多种芳香烃降解菌中存在C12O同工酶不是偶然现象，而是作为细菌适应环境的一种进化优势被选择并保留了下来。

5 C12O的应用 5.1 用于污染物检测及PAHs生物降解

芳香族化合物具有难以降解的特点，易在环境长期存留，对土壤微生物、植物和动物造成持续毒害，进而损害土壤功能，并可通过食物链最终富集到人体中，成为潜在的致癌物质。检测环境中PAHs具有十分重要的意义，而C12O可作为检测环境中PAHs的一种有效方式，Zucolotto等将氯儿茶酚1, 2-双加氧酶与纳米材料联用，可检测到环境中低至10⁻¹⁰ mol/L的邻苯二酚^[41]。同时，尽管C12O对芳香烃类化合物具有催化降解能力，但由于芳香烃性质稳定，降解效率不高，限制了其工业化应用的进程，因此，研究人员试图利用计算机模拟设计、定向进化、新型材料等先进技术，对C12O编码基因进行改造，以提高C12O对芳香烃类化合物的降解能力并扩大其底物选择范围。Han等将Acinetobactersp.ADP1中C12O的76位氨基酸由脯氨酸定向突变为丙氨酸，相当于人工扩大了结构域的范围，使得C12O的催化能力提高了十倍^[11]，而Nardo等将C12O固定到纳米材料中，发现其催化效率、酶学特性均有大幅度提高，为降解环境中PAHs污染提供了一种好的选择^[18]。

5.2 用于工业原料顺, 顺-粘康酸的生产

顺, 顺-粘康酸是工业生产中一种重要的原材料，它不仅能够通过氢化作用形成脂肪酸以合成杀虫剂、杀菌剂、聚氨酯、尼龙等材料，同时也是一些新型树脂、药物的合成原料，目前通过生物合成是最有效、经济且安全的方式。

通过对C12O编码基因或表达环境进行调控，可经过多种方式提高C12O的产量或催化效能：(1)通过基因改造使得菌体内能够定向进行蛋白合成；(2)通过提高菌体内C12O产量达到提高转化效率的目的^[42]；(3)通过定点突变改变C12O空间构象；(4)通过加入特殊介质材料，最终达到提高C12O酶促效率，提高顺, 顺-粘康酸产量的目的，顺, 顺-粘康酸不仅具有较好的经济价值，同时对环境友好，不会有其他有毒副产物^[43]。

6 总结与展望

邻苯二酚双加氧酶是芳香烃降解过程中非常重要的一类酶，在芳香族化合物降解过程中起着重要的作用。C12O是邻苯二酚在β-酮己二酸降解途径中的关键酶，目前对C12O的性质和结构已做了深入的研究，对底物与酶相互作用过程也有了一定的了解，不同基因表达的C12O对不同底物具有不同的降解特性，其酶学性质也表现出不同的特点，进一步探索C12O的多样性，是目前研究C12O酶学性质的一个重要方面。

C12O在微生物体内多存在同工酶现象，它们往往出现在降解过程中的限速步骤和毒性中间产物的催化步骤，因此对同工酶的协同作用方式及分子生态学意义的研究具有十分重要的意义，不断发展的基因组学、蛋白质组学和宏基因组学等现代分子生物学技术，为研究人员开发新颖的C12O资源，寻找、发现其同工酶编码基因存在意义提供了更多更有效的手段，使C12O有了更广阔的应用前景。