在自然界所有极端的环境条件中，低温是最普遍存在的环境条件，同时对生命活动的影响最大^[1]。为适应生产发展需要，培育出在低温下具有高生物活性的微生物一直是微生物领域的研究重点。因此，微生物对温度的响应机制研究一直备受关注。微生物对温度的响应机制包含两个方面：温度对微生物代谢活动的影响机制，以及微生物在长期进化过程中为了抵御低温造成的不利影响而逐渐形成的一套完善的低温适应机制^[2]。由于耐冷菌能够适应低温环境，在食品、保健品及环境工程等领域具有广泛的应用前景。在环境工程目前的研究应用中，大多数耐冷菌从活性污泥中分离得到，应用于低温环境中复杂有机物的降解转化以及污水处理方面。因此，了解活性污泥菌群对温度的响应有助于耐冷菌的驯化培养。

厌氧氨氧化菌群作为活性污泥法水处理中节能高效的生物菌群，被报道最适生长温度为35-40 ℃，对低温条件十分敏感^[3]。已有的低温对厌氧氨氧化菌群的影响研究主要集中在氮去除活性、胞外聚合物含量、群落结构变化等方面，很少有研究从分子机理的角度对厌氧氨氧化菌群低温下的代谢特性进行研究。已有研究表明，低温会导致厌氧氨氧化菌代谢与生长速率的下降，同时也会影响厌氧氨氧化菌群的群落结构，主要表现为厌氧氨氧化菌占比下降，细菌多样性的降低。低温导致的厌氧氨氧化菌个体水平以及群落水平的变化，最终影响到污泥的宏观特性，主要表现为污泥脱氮效率的下降、胞外聚合物含量的改变以及污泥颗粒的解体^[3]。本课题组的前期工作表明，利用代谢组学可以从分子机理的角度深入研究厌氧氨氧化菌群在不同条件下代谢通路与代谢产物的变化，并阐释厌氧氨氧化菌群对不同条件的代谢响应机理^[4-7]。在此基础上，本文采用厌氧氨氧化污泥菌群作为研究对象，详细分析了温度对厌氧氨氧化污泥菌群代谢通路与代谢产物的影响，以期初步阐释厌氧氨氧化菌群低温响应机理，从而为耐冷菌的驯化培养奠定一定的理论基础。

1 材料与方法 1.1 污泥来源

试验接种的厌氧氨氧化污泥取自实验室35 ℃下长期稳定运行的厌氧氨氧化反应器。

1.2 主要试剂和仪器

反应器进水成分及NH₄⁺-N、NO₂^--N与NO₃^--N浓度测定等相关试剂均为国产分析纯试剂；FastDNA^® Spin Kit for Soil，MO BIO Laboratories公司。整个试验装置由进水系统、曝气系统、序批式反应器(Sequencing batch reactor，SBR)、出水系统、水浴循环系统以及自控系统组成。本试验选用两个相同的序批式反应器对厌氧氨氧化菌群低温特性进行相关研究。所用反应器由有机玻璃制造而成，有效体积为5 L。反应器外部设有水浴夹套，用以进行恒温水浴。UV-1800紫外分光光度计，岛津公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 反应器启动及运行

反应器进水采用人工配置的模拟废水^[8]，进水中NH₄⁺-N和NO₂^--N浓度均保持在50 mg/L。2个反应器均严格厌氧，进水pH控制在7.5-8.0。2个反应器初始运行温度均为35 ℃ (厌氧氨氧化菌最适生长温度)，接种的厌氧氨氧化污泥生物量浓度均为510 mg/L [以挥发性悬浮固体(Volatile suspended solids，VSS)计]。待2个反应器运行稳定后，R1反应器水浴温度降为25 ℃，并持续在25 ℃条件下运行。R2反应器水浴温度依旧维持在35 ℃。SBR启动初期水力停留时间为24 h。2个反应器在2个温度下共运行100 d，在反应器运行期间，每隔2 d监测进出水中NH₄⁺-N、NO₂^--N与NO₃^--N浓度。在反应器运行的最后一天(第100天)测定厌氧氨氧化污泥活性、生物量以及群落结构。在2个反应器运行稳定且脱氮效能差异明显的不同时期(第85、90、95与100天)采集污泥样品，并对污泥代谢物进行提取与分析。

1.4 检测项目与分析方法

NH₄⁺-N浓度采用纳氏试剂分光光度法，NO₂^--N浓度采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法，NO₃^--N浓度采用酚二磺酸分光光度法^[9]。厌氧氨氧化污泥活性以单位质量污泥单位时间内去除NH₄⁺-N和NO₂^--N的质量来作为衡量指标，采用Feng等的测定方法^[5]。污泥生物量用VSS进行表征^[5]。所有测量一式三份取平均值。

1.5 微生物群落结构分析

收集0.5 g厌氧氨氧化湿污泥，使用FastDNA^® Spin Kit for Soil进行DNA提取，重复3次。使用338F/806R的扩增引物^[4]，其中正向引物为338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)，反向引物为806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。通过PCR扩增16S rRNA基因，PCR反应体系和条件同Guo等^[4]，在上海美吉生物医药有限公司Illumina MiSeq平台(Illumina Inc.，CA，USA)进行高通量测序，使用I-sanger (http://www.i-sanger.com/)进行数据分析^[5]。

1.6 代谢组学分析

1.6.1 代谢物的提取

为了研究厌氧氨氧化污泥代谢物的变化，采用Tang等的方法^[10]，将不同时期收集的污泥进行代谢组学分析(n=4)。首先快速收集污泥菌样，PBS冲洗后，使用-40 ℃ 60% (体积比)冷甲醇淬灭，-20 ℃、9 000×g离心10 min从冷甲醇中分离菌体。然后将菌体重悬于5 mL 80%冷甲醇中，在冰浴中200 W超声处理30 min后得到菌体的裂解溶液。以10 000×g离心裂解溶液20 min后收集上清液。最后将上清液在室温下氮吹蒸干用于代谢组学分析。同时，为了消除每个样品中由于细菌生物量的差别造成的偏差，对破碎菌体的蛋白含量(即菌体裂解溶液离心后的沉淀)进行测定，从而对代谢物含量进行标准化，蛋白含量的测定采用BCA法^[11]。

1.6.2 代谢物的检测

使用Q Exactive质谱仪收集质谱数据。代谢提取物用80%甲醇复溶，所得溶液两等份分别用于正离子模式与负离子模式下的分析。样品用含有10 mmol/L甲酸铵的50%乙腈作为洗脱剂注入正相层析柱。数据采集使用范围为70-1 050 m/z的数据依赖性质谱。全扫描和碎片光谱分别以70 000和17 500的分辨率收集，采用Tang等的源参数^[10]。使用包含740种化合物的自制数据库来查找识别代谢物。

1.6.3 代谢组数据分析

对于代谢组学数据，首先应用对数转换，然后通过t检验分析两个温度下污泥代谢物丰度之间的差异，以此鉴定它们之间存在显著差异的代谢物。在检验中，P < 0.05和倍数变化(R1 vs R2)大于1.2或小于0.83的代谢物被认为存在显著差异。使用Metaboanalyst (www.mataboanalyst.ca)对代谢组学数据进行分析^[7]，通过将代谢物匹配到KEGG数据库中的代谢途径鉴定污泥菌群中表达的代谢通路。采用Aggio等^[12]的方法，利用PAPi的R语言安装包分析代谢组数据，基于代谢物丰度在实验组(R1)与对照组(R2)的差异，计算每个KEGG代谢通路的活性值，比较两个温度下污泥菌群的代谢通路活性，并通过t检验找出通路活性具有显著差异的代谢通路。

2 结果与分析 2.1 降温对反应器脱氮效能、菌群活性与生长的影响

降温对反应器脱氮效能有显著影响。2个反应器在2个温度下运行100 d进出水NH₄⁺-N、NO₂^--N和NO₃^--N变化情况如图 1A、1B所示，降温后的前30天，R1对NO₂^--N的去除性能较差，但接下来的运行过程中R1的脱氮效能逐步提升，R1的厌氧氨氧化菌群逐渐适应25 ℃的温度，而R2的脱氮效能一直在提升并始终高于R1的脱氮效能。如图 1C所示，在100 d的反应器运行过程中，R1的总氮去除负荷维持在48.39±14.10 mg N/(L·d)，而R2的总氮去除负荷维持在143.25±24.82 mg N/(L·d)。两个反应器的总氮去除性能存在显著差异(P < 0.001)，R2的平均总氮去除负荷是R1的2.96倍。降温导致反应器脱氮效能大幅降低。

降温也会对厌氧氨氧化污泥菌群氮去除活性产生显著影响，如图 1D所示。在反应器运行最后一天监测污泥菌群的NH₄⁺-N与NO₂^--N去除活性，R2菌群平均NH₄⁺-N去除活性是R1的4.85倍，R2菌群平均NO₂^--N去除活性是R1的4.28倍(P < 0.001)。降温导致厌氧氨氧化污泥氮去除活性大幅下降。

在反应器运行最后一天监测污泥菌群的生物量，计算2种温度下污泥菌群生物量的增长速率。R1与R2菌群平均增长速率分别为20.88 mg VSS/d和32.88 mg VSS/d。降温导致厌氧氨氧化污泥菌群增长速率显著降低(P < 0.05)。

2.2 降温对污泥群落结构的影响

降温导致厌氧氨氧化污泥群落结构产生明显差异。如图 2所示，污泥中存在3种厌氧氨氧化菌，分别为Candidatus Jettenia caeni、Candidatus Brocadia sinica和Candidatus Brocadia fulgida。这3种厌氧氨氧化菌在R1中的平均占比分别为37%、37%和7%，在R2中的平均占比分别为41%、39%和6%。R1中厌氧氨氧化菌的总占比平均为81%，R2中厌氧氨氧化菌的总占比平均为86%，25 ℃条件下污泥中厌氧氨氧化菌的占比要显著低于35 ℃的污泥(P < 0.05)。同时也检测到了硝化螺菌属(Nitrospira)，其最适生长温度为20-30 ℃。R1中硝化螺菌属的总占比平均为5%，R2中硝化螺菌属的总占比平均为4%，25 ℃条件下污泥中硝化螺菌属的占比要显著高于35 ℃的污泥(P < 0.05)。

2.3 降温对菌群总体代谢通路活性的影响

此次代谢组学分析共检测到816种代谢物，其中有436种代谢物匹配到了KEGG数据库的代谢通路，其他未匹配上的代谢物大多为组成细胞结构的物质。丰度具有显著性差异的代谢物共有575种。如图 3A所示，以R1作为实验组，R2作为对照组，降温导致丰度显著上调的代谢物数量要高于丰度显著下调的代谢物数量。

降温导致污泥菌群的代谢通路活性发生显著变化。图 3B显示了通路活性具有显著性差异的代谢通路。降温导致菌群的脂肪酸延长、CO₂固定途径、TCA循环与丙酮酸代谢的通路活性显著下调。然而，降温也会导致菌群一些代谢通路活性显著上调，包括肽聚糖合成、蛋白质降解与吸收、氨酰基-tRNA合成、脂多糖合成、谷胱甘肽代谢、嘌呤与嘧啶代谢、磷酸戊糖途径。

2.4 降温对菌群脂肪酸组成的影响

降温导致污泥菌群的脂肪酸组成发生显著变化。如图 4A所示，降温导致短链的饱和脂肪酸十一酸(C11:0)及不饱和脂肪酸蓖麻油酸(C18:1)、二十碳烯酸(C20:1)、二十二碳六烯酸(C22:6)的丰度显著上调，而具有较长碳链的软脂酸(C16:0)的丰度显著下调，其倍数变化为0.82。

2.5 降温对菌群磷脂代谢的影响

降温导致污泥菌群的磷脂代谢发生显著变化，代谢组学检测到了厌氧氨氧化菌群磷脂酰胆碱(PtC)与磷脂酰乙醇胺(PtE)合成通路中代谢物的变化。PtC与PtE生物合成的直接前体物质包括乙醇胺磷酸(PE)、胆碱磷酸(PC)与甘油磷酸(Sn-glycero-3P)，而乙酰胆碱(Acetylcholine)是胆碱磷酸生物合成的前体物质。如图 4B所示，随着温度的降低，乙醇胺磷酸与胆碱磷酸的丰度显著下调，而甘油磷酸与乙酰胆碱的丰度没有显著变化；降温造成乙醇胺磷酸与胆碱磷酸的丰度显著下调，从而导致代谢通路的下游物质磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺含量减少。

2.6 降温对菌群嘌呤与嘧啶丰度的影响

降温导致污泥菌群的嘌呤与嘧啶丰度发生显著变化。如图 4C所示，随着温度的降低，胸腺嘧啶(Thymine)的丰度显著下调，鸟嘌呤(Guanine)、腺嘌呤(Adenine)与尿嘧啶(Uracil)丰度显著上调，而胞嘧啶(Cytosine)的丰度没有显著变化。鉴于胸腺嘧啶是DNA特有的碱基，其丰度的下调表明降温导致污泥菌群DNA的合成减少，进一步影响到了菌群的细胞增殖。而尿嘧啶作为RNA特有的碱基，其丰度的上调表明降温条件下污泥菌群RNA合成的提高。可见，降温导致厌氧氨氧化菌群DNA与RNA的合成受到了影响。

2.7 降温对菌群抗低温胁迫关键代谢物丰度的影响

降温导致污泥菌群抗低温胁迫关键代谢物的丰度发生显著变化。如图 4D所示，随着温度的降低，精氨酸(Arginine)、脯氨酸(Proline)、胍丁胺(Agmatine)、胍丁胺的下游代谢产物腐胺(Putrescine)以及谷胱甘肽(Glutathione)的丰度均显著上调。

2.8 降温对菌群信号分子丰度的影响

降温导致污泥菌群信号分子的丰度发生显著变化。如图 5所示，c-AMP、c-GMP与c-di-GMP作为第二信使，随着温度的降低，c-AMP与c-GMP的丰度没有显著变化，而c-di-GMP的丰度显著上调。S-腺苷基甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)作为厌氧氨氧化菌群中重要的第一信使AHL生物合成的前体物质，降温条件下其丰度显著上调，导致其下游代谢物AHL的含量增加。两种温度下厌氧氨氧化菌的代谢模型如图 6所示。

3 讨论与结论

研究活性污泥系统对低温的响应有助于耐冷菌的驯化培养。低温除了会影响到菌群的代谢活性与增长速率，也会导致菌群调控自身代谢，进行细胞的全局性响应，形成多种适应低温环境的生理机制^[13]。本研究以厌氧氨氧化污泥菌群作为研究对象，试图阐释厌氧氨氧化菌群的低温响应机理。在不同温度下，厌氧氨氧化菌群具有完全不同的代谢响应。TCA循环与磷酸戊糖途径同属于细胞的中心碳代谢通路，细胞内其他代谢通路都是在此基础上进行的。TCA循环可以产生大量还原力供生命活动需要，同时通过其中间产物为合成复杂的细胞物质提供碳骨架^[14]。磷酸戊糖途径是细胞嘌呤与嘧啶核苷酸、脂肪酸以及脂多糖合成的枢纽^[14]。厌氧氨氧化菌属于化能自养型菌，将CO₂固定后转化为丙酮酸参与细胞物质合成^[15]。本研究表明，35 ℃条件下TCA循环上调，导致菌群能从TCA循环中获得的参与一系列氨基酸与碳氢化合物合成的中间产物增多，进而促进碳骨架的合成，导致该温度条件下菌群的活性与增长速率提高。而25 ℃下厌氧氨氧化菌群磷酸戊糖途径上调，进一步导致了下游通路中RNA合成水平的提高、脂肪酸组成的变化以及脂多糖的大量合成。这种差异说明了不同温度条件下的厌氧氨氧化菌群会上调不同的中心碳代谢通路，进而导致不同的生长与代谢策略。35 ℃条件下菌群偏向于合成碳骨架促进自身生长，导致厌氧氨氧化菌群活性更强，增长更快。而25 ℃条件下菌群偏向于提高转录水平、调控膜脂组成、积累抗低温胁迫代谢物等方式来帮助自身抵御低温带来的不利影响。

转录调控与腐胺的积累有助于厌氧氨氧化菌群适应低温。已有研究表明，降温会抑制细菌生长相关基因的转录水平^{[1, 13-14]}。然而本研究发现，基于尿嘧啶含量的上升、氨酰基-tRNA合成通路活性的上调以及磷酸戊糖途径上调，推测低温条件下厌氧氨氧化菌群RNA合成水平反而提高。鉴于低温条件下厌氧氨氧化菌群增长速率下降，菌群提高RNA合成水平并不是用于合成碳骨架促进细胞增殖与生长，而是进行低温下的转录调控，如合成冷应激蛋白维持基因正常表达^[16]、合成蛋白酶降解低温下变性蛋白^[14]等。通过转录调控，厌氧氨氧化菌群可以维持低温下基本的生理代谢。在厌氧氨氧化菌群通过转录调控以适应低温的过程中，腐胺合成通路上调。目前尚未有腐胺调控细菌适应低温条件的报道。Song等的研究表明，在低温驯化过程中，植物叶片中腐胺含量有明显累积，腐胺通过提高抗氧化系统效率，减少低温造成的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生，从而降低膜脂的过氧化程度，缓解低温胁迫对植物造成的伤害^[17]。也有研究表明，腐胺可以与DNA、RNA、蛋白质和磷脂发生相互作用，涉及到酶活性与膜结构的调节^[18-19]。Feng等的研究表明，腐胺在促进细菌正常增殖与生长的过程中起到重要作用^[5]。本研究首次发现25 ℃条件下厌氧氨氧化菌群腐胺含量的上调，推测腐胺是调控低温下菌群细胞正常增殖与生长的重要物质，起到调节膜组成与结构的作用。

信号分子在厌氧氨氧化菌适应低温过程中起重要调控作用。已被证实厌氧氨氧化菌具有合成分泌信号分子AHL的能力，且基于AHL的群体感应系统能够参与菌群代谢的调控^{[10, 20-21]}。目前基于AHL的群体感应系统是否参与了厌氧氨氧化菌群低温适应性鲜有报道。本研究结果表明，在25 ℃条件下菌群AHL合成的前体物质SAM显著增加，推测导致厌氧氨氧化菌用于种内通讯的关键信号分子AHL的含量增加。已有研究表明，群体感应系统与低温适应性有关联，群体感应信号分子通过改变细菌细胞膜的结构以及冷应激蛋白的含量，进而影响细菌低温下的代谢调控^[22]。本研究发现，25 ℃条件下菌群AHL含量增加的同时，不饱和脂肪酸与短链饱和脂肪酸的含量增加，菌群通过改变膜脂组成进而改变了细胞膜结构，提高了低温条件下细胞膜的流动性。同时，随着温度的下降，厌氧氨氧化菌群脂多糖的合成上调，进而改变了细胞膜的组成以应对低温胁迫。厌氧氨氧化菌具有特殊的细胞膜组成，阶梯烷膜脂与胆碱磷酸、乙醇胺磷酸或甘油磷酸结合形成膜脂作为细胞膜骨架^[23]。本研究结果表明，25 ℃条件下厌氧氨氧化菌基于胆碱磷酸与乙醇胺磷酸的磷脂代谢发生了显著变化。以上分析结果表明，基于AHL的群体感应系统很可能通过调控厌氧氨氧化菌细胞膜结构参与了厌氧氨氧化菌的低温适应性。本研究表明，通用第二信使c-AMP与c-GMP随着温度的降低，其含量并没有显著变化，而c-di-GMP的含量显著增加。Guo等的研究表明，c-di-GMP通过调控胞外多糖的分泌以促进厌氧氨氧化污泥生物膜的形成^[24]。本研究中，随着温度降低，厌氧氨氧化菌通过合成更多的c-di-GMP以促进生物膜的形成，有利于菌群抵抗低温造成的不利生长环境。

本研究以厌氧氨氧化污泥菌群为研究对象，从分子机理的角度初步分析了污泥菌群适应低温环境的生理机制，阐释了转录调控、腐胺以及信号分子在菌群适应低温过程中的重要作用。低温下厌氧氨氧化菌群通过大量合成腐胺与信号分子，通过调控膜脂组成与改变膜结构的方式，调控菌群代谢以适应低温环境。后续还需要深入、系统研究基于活性污泥系统菌群的低温响应机制，从而为耐冷菌的驯化培养奠定良好的理论基础。