2019, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 吕心涛, 蒋勇, 孟春霖, 张树军, 谷鹏超, 杨岸明, 王佳伟, 韩晓宇
- LÜ Xin-Tao, JIANG Yong, MENG Chun-Lin, ZHANG Shu-Jun, GU Peng-Chao, YANG An-Ming, WANG Jia-Wei, HAN Xiao-Yu
- 好氧和缺氧条件下游离亚硝酸对氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的选择性抑制
- Inhibitory of FNA on the activity of AOB and NOB under aerobic and anoxic conditions
- 微生物学通报, 2019, 46(8): 1927-1935
- Microbiology China, 2019, 46(8): 1927-1935
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190300
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文章历史
- 收稿日期: 2019-04-09
- 接受日期: 2019-06-28
- 网络首发日期: 2019-07-08
2. 北京城市排水集团有限责任公司 北京 100044;
3. 北京市水环境技术创新中心 北京 100044
2. Beijing Drainage Group Co. Ltd., Beijing 100044, China;
3. Beijing Water Environment Technology Innovation Center, Beijing 100044, China
近年来，厌氧氨氧化技术越来越受到水处理行业的青睐，是环境界公认的最具可持续发展特质的废水脱氮技术[1-3]。厌氧氨氧化工艺突破传统生物脱氮工艺理论和技术，是未来废水处理领域最具潜力、最经济的脱氮工艺[4]。厌氧氨氧化菌利用亚硝酸盐氮(NO2--N)为电子受体，氨氮(NH4+-N)为电子供体，无需有机物为碳源，实现生物自养脱氮[5]。对比传统生物脱氮，短程硝化+厌氧氨氧化技术具有减少60%曝气量、100%碳源投加量的技术优势[6-7]。稳定短程硝化是实现城市污水厌氧氨氧化技术的必需条件，而城市污水稳定短程硝化一直是难以攻克的课题[8-9]。短程生物脱氮实质是利用氨氧化菌(Ammonia oxidizing bacteria，AOB)体内的氨单加氧酶(Ammonia monooxygenase，amoA)和羟胺氧化酶(Hydroxylamine oxidoreductase，HAO)将NH4+-N氧化为NO2--N的过程[10]，为厌氧氨氧化菌提供NO2--N。
短程硝化的实质是使亚硝酸盐氧化菌(Nitrite oxidizing bacteria，NOB)成为劣势菌属并逐渐被淘洗出系统，使AOB成为硝化菌群中的优势菌种[11-13]。研究发现，AOB的氧饱和常数低于NOB的氧饱和常数，在低溶解氧(Dissolved oxygen，DO)下更有利于短程硝化的实现[14]，Blackburne等[15]研究认为，在DO浓度为0.4 mg/L时可以实现NAR高达90%，Ma等[16]发现DO浓度控制在0.4-0.7 mg/L时系统中NAR达到95%，实现短程硝化，但Zeng等[17]研究表明，系统长期处于低DO浓度下会导致活性污泥解体，出现丝状菌膨胀。因此单纯通过控制低DO浓度并不能长期稳定实现短程硝化。Anthonisen等[18]发现一定浓度的游离亚硝酸(Free nitrous acid，FNA)对NOB活性具有强烈抑制作用，Vadivelu等[19]认为在好氧条件下FNA对NOB和AOB的抑制浓度分别为0.02和0.40 mg/L，吕心涛[20]研究发现，FNA才是NOB真正的基质底物，当FNA浓度为0.702 mg/L时，富集NOB活性被完全抑制，Wang等[21]发现当FNA浓度达到0.24 mg/L时NOB活性被完全抑制。
现有文献资料关于FNA对硝化菌活性的影响大多是在曝气条件下进行研究，鲜有关于缺氧条件下FNA对硝化菌活性影响的报道，若在缺氧条件下能够实现FNA对NOB的强烈抑制效果，且对AOB无抑制或较弱抑制作用，进而实现短程硝化，则可以达到快速实现短程硝化的目的，该技术对通过旁侧抑制实现城市污水短程硝化-厌氧氨氧化具有实际的理论指导意义。基于上述背景，本试验采用2个平行的序批式反应器(Sequencing batch reactor，SBR)，考察在好氧和缺氧条件下，FNA对AOB和NOB活性的影响。
1 材料与方法 1.1 试验装置、废水特性及接种污泥采用材质为有机玻璃构成的SBR反应器，有效容积为1.8 L，采用磁力搅拌器进行搅拌。整个试验过程DO值、pH值和温度(T值)均通过WTW便携式探头进行测定。缺氧条件(本试验的缺氧是指在系统中的DO不足以维持好氧菌的正常活动，即DO浓度小于0.2 mg/L)和好氧条件抑制时，控制DO值分别为0-0.2 mg/L和2.0 mg/L左右，过曝气试验时，DO值均在2.0-5.0 mg/L范围内。
试验用水取自北京市某污水处理厂初沉池出水，水质情况见表 1。通过投加NaNO2 (100 g/L)调节NO2--N浓度，pH值通过0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH来调节。接种污泥取自北京市某污水处理厂二沉回流污泥，具有良好的全程脱氮和去除有机物能力，回流污泥MLSS维持在5 400-6 500 mg/L范围内。
| 指标 Index |
范围 Range |
平均值 Average value |
| pH | 7.2-7.5 | 7.4 |
| COD (mg/L) | 128.4-530.2 | 315.4 |
| NH4+-N (mg/L) | 33.9-65.4 | 47.1 |
| NOx--N (mg/L) | 0.0-0.7 | 0.01 |
| TN (mg/L) | 34.2-65.5 | 47.7 |
| PO43--P (mg/L) | 1.6-7.1 | 3.7 |
DNA提取试剂盒，MP公司；PCR反应试剂盒(Promega GoTaq Green Master Mix)，Promega公司；定量PCR反应试剂盒，TaKaRa公司。NanoDrop One、实时定量PCR扩增仪、离子色谱，Thermo Fisher Scientific公司；便携式pH、DO、温度测定仪，WTW公司；分光光度计，上海普析通用公司。
1.3 试验方法抑制试验：取自北京市某污水处理厂二沉池回流污泥，调节MLSS为8 300 mg/L左右，并均分为两份分别倒入有效容积为1.8 L的SBR反应器中进行好氧FNA和缺氧FNA抑制，分别编号为R1和R2。R1和R2的DO值分别为约2.0 mg/L和小于0.2 mg/L，温度均为15-20 ℃，pH值均为6.0±0.1，初始FNA浓度均为1.12±0.40 mg/L，抑制时间均为48 h，抑制始末各指标变化情况见表 2。
| 指标 Index |
时间 Time (h) |
R1 | R2 |
| pH | 0 | 6.02 | 6.02 |
| 48 | 6.01 | 6.244 | |
| Temperature (℃) | 0 | 15 | 15 |
| 48 | 15 | 15 | |
| NH4+-N (mg/L) | 0 | 48 | 47.2 |
| 48 | 33.5 | 65 | |
| NO2--N (mg/L) | 0 | 413 | 401 |
| 48 | 408 | 380 | |
| NO3--N (mg/L) | 0 | 16 | 17 |
| 48 | 40 | 14 | |
| FA (mg/L) | 0 | 0.017 | 0.017 |
| 48 | 0.012 | 0.039 | |
| FNA (mg/L) | 0 | 1.16 | 1.12 |
| 48 | 1.17 | 0.64 |
过曝气试验：对上述抑制完成后的污泥用自来水进行清洗，直至污泥中NO2--N被清洗完全，分别取清洗后的污泥，R1和R2对应编号分别为S1和S2，控制MLSS为3 000 mg/L，初始NO2--N浓度为30 mg/L左右，DO浓度为2.0-5.0 mg/L，温度在15-20 ℃，每个周期进水(3 min)、曝气(70-90 h)、静沉(15 min)、排水(3 min)，进行过曝气试验。
1.4 分析项目及检测方法整个试验过程中MLSS、NH4+-N、NO3--N、NO2--N均采用标准方法[22]进行检测，pH值、DO值和T值均采用便携式WTW-Multi 3420测定仪进行测定。
定量PCR (qPCR)：用1×PBS清洗污泥样品3次，14 000×g离心2 min去除上清液，置于-20 ℃保存。采用试剂盒对DNA进行提取，提取后的DNA通过NanoDrop One测量核酸浓度及纯度。PCR反应采用试剂盒，反应体系(25 μL)：GoTaq Green Master Mix 12.5 μL，正、反向引物(10 mmol/L)各1 μL，DNA模板0.5-2.0 μL，ddH2O补足25 μL。PCR反应条件见表 3。采用特异性引物对AOB amoA功能基因隶属于NOB菌群的Nitrospira和Nitrobacter以及全菌的16S rRNA基因进行qPCR扩增。反应在QuantStudioTM 7 Flex System实时定量PCR仪上进行，采用试剂盒进行反应，PCR体系(25 μL)：SYBR缓冲液12.5 μL，正、反向引物(10 mmol/L)各1 μL，ROX 0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O补足25 μL。通过质粒连接、转化、扩大培养、质粒纯化获得质粒。
| 菌群及目的基因 Flora and target gene |
引物名称 Primers name |
引物序列 Primers sequence (5′→3′) |
扩增长度 Amplification length (bp) |
PCR条件 PCR program |
参考文献 References |
| AOB amoA gene | amoA-1F amoA-2R |
GGGGTTTCTACTGGTGGT CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC |
491 | 95 ℃ 15 min; 45 cycles (95 ℃ 1 min, 54 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min) |
[23] |
| Nitrobacter 16S rRNA gene | Nb1000F 1387R | TGCGACCGGTCATGG GGGCGGWGTGTACAAGGC | 394 | 95 ℃ 10 min; 35 cycles (95 ℃ 1 min, 62 ℃ 2 min, 72 ℃ 2 min) |
[24] |
| Nitrospira 16S rRNA gene | NSR1113F 1264R |
CCTGCTTTCAGTTGCTACCG GTTTGCAGCGCTTTGTACCG |
165 | 95 ℃ 10 min; 35 cycles (95 ℃ 1 min, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min) |
[24] |
| Bacterial 16S rRNA gene | 1055F 1392R |
ATGGCTGTCGTCAGCT ACGGGCGGTGTGTAC |
323 | 95 ℃ 10 min; 45 cycles (95 ℃ 30 s, 50 ℃ 1 min, 72 ℃ 20 s) |
[25] |
标准曲线的建立：用NanoDrop One分光光度计测定质粒的浓度。将纯化后的质粒以10倍比梯度稀释用作qPCR标准品。反应在QuantStudioTM 7 Flex System实时定量PCR仪上进行，采用试剂盒进行反应，PCR反应体系和条件同上。
FNA、FA、rNH4+-N和rNO2--N计算公式分别见公式(1)、(2)、(3)和(4)：
|
(1) |
式中，FNA表示游离亚硝酸浓度，mg/L；[NO2--N]表示亚硝酸盐氮浓度，mg/L；T表示温度值，℃；pH表示混合液酸碱度。
|
(2) |
式中，FA表示游离氨浓度，mg/L；[NH4+-N]表示氨氮浓度，mg/L；T表示温度值，℃；pH表示混合液酸碱度。
|
(3) |
式中，rNH4+-N表示比氨氮氧化速率，mg N/(g VSS·h)；[NH4+-N]s表示曝气开始时氨氮浓度，mg/L；[NH4+-N]e表示曝气结束时氨氮浓度，mg/L；MLVSS表示混合液挥发性悬浮固体浓度，mg/L；tn表示曝气时间，h。
|
(4) |
式中，rNO2--N表示比亚硝酸盐氮氧化速率，mg N/(g VSS·h)；[NO2--N]s表示曝气开始时亚硝酸盐氮浓度，mg/L；[NO2--N]e表示曝气结束时亚硝酸盐氮浓度，mg/L；MLVSS表示混合液挥发性悬浮固体浓度，mg/L；tn表示曝气时间，h。
2 结果与讨论 2.1 抑制始末指标变化规律图 1为好氧和缺氧条件下抑制始末NH4+-N、NO2--N、NO3--N、FNA、FA浓度和pH值的变化情况。在好氧条件下，抑制始末pH值和FNA浓度均未明显变化，而NH4+-N浓度由48 mg/L降至33.5 mg/L，NO2--N浓度由413 mg/L降至408 mg/L，NO3--N浓度由16 mg/L升至40 mg/L，说明在好氧条件下FNA浓度为1.16 mg/L时，经过48 h的抑制，AOB和NOB活性均未被完全抑制。在缺氧条件下，抑制始末NH4+-N浓度由47.5 mg/L升高至65 mg/L，分析认为这可能是由于在缺氧抑制过程中DO浓度始终小于0.2 mg/L，活性污泥发生水解导致系统中NH4+-N浓度升高，而NO2--N和NO3--N浓度均未显著下降，分别由401、17 mg/L降至380、14 mg/L，pH值由6.020升高至6.244，分析认为这是由于在缺氧条件下FNA浓度为1.16 mg/L时对反硝化菌活性具有一定的抑制作用造成的，这也与Wang等[21]研究认为缺氧条件下FNA浓度为0.2 mg/L时可抑制反硝化菌活性且该抑制可逆的观点基本一致。同时Liu等[26]研究认为在DO为0.16 mg/L时AOB和NOB活性并未有明显差异，且随着试验的进行NOB活性大于AOB活性，并不能实现短程硝化，因此排除在本试验条件下DO对试验结果的干扰。
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| 图 1 抑制条件下NH4+-N、NO2--N、NO3--N、pH、FNA和FA的变化规律 Figure 1 Evolution of ammonia, nitrite, nitrate, pH, FNA and FA in the system under inhibition conditions |
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同时，在整个好氧抑制过程中，FA浓度始终小于0.017 mg/L，而Anthonisen等[18]研究发现FA对AOB和NOB的抑制阈值分别为10-150 mg/L和0.1-1.0 mg/L，Katsou等[27]认为当FA浓度为0.19-1.52 mg/L时NOB活性降低35%-65%，说明本试验FA浓度并不能对硝化菌活性产生影响，排除FA浓度对本试验结果的干扰。在整个缺氧抑制过程中，FA浓度始终低于0.039 mg/L，Qian等[28]通过缺氧条件控制FA浓度为5 mg/L处理活性污泥后，NAR仅为10%，因此本试验下的FA浓度并未参与对硝化菌的抑制过程。在好氧抑制阶段FNA浓度在1.16-1.17 mg/L范围内，而缺氧抑制初始FNA浓度为1.12 mg/L，抑制48 h后FNA浓度降为0.64 mg/L。研究发现，在好氧条件下FNA浓度为0.02 mg/L时对NOB活性产生抑制作用[19]，Park等认为在有氧条件下FNA浓度为0.92 mg/L时对NOB活性产生强烈抑制[29]，而在缺氧条件下FNA浓度为0.24 mg/L时NOB已停止活动[21]，因此本试验条件下，在整个好氧和缺氧抑制过程中，FNA浓度始终在对NOB存在抑制的浓度范围内。
2.2 硝化菌活性变化规律图 2为空白组、好氧抑制48 h、缺氧抑制48 h后的AOB、Nitrospira、Nitrobacter的丰度变化情况。图 3显示了空白组的rNH4+-N和rNO2--N的变化规律、好氧条件下抑制48 h后过曝气99 h时的rNH4+-N和rNO2--N变化规律，以及缺氧条件下抑制48 h后过曝气99 h时的rNH4+-N和rNO2--N变化规律。
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| 图 2 不同抑制条件下，AOB、Nitrospira、Nitrobacter丰度变化规律 Figure 2 Change in abundance of AOB, Nitrospira and Nitrobacter under different inhibition conditions |
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| 图 3 不同抑制条件下，过曝气99 h后rNH4+-N和rNO2--N变化规律 Figure 3 The variation of rNH4+-N and rNO2--N under different inhibition conditions |
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在经过好氧抑制48 h后，与空白组相比，AOB、Nitrospira、Nitrobacter丰度均未明显变化，分别由4.890 9×108、3.002 9×109、4.245×108 copies/g VSS降4.864 6×108、2.898 7×109、4.186 6×108 copies/g VSS。好氧抑制48 h后的活性污泥过曝气至99 h时，其rNH4+-N和rNO2--N均未明显降低，分别由3.5、4.828 mg N/(g VSS·h)降至3.3、4.668 mg N/(g VSS·h)，这与AOB、Nitrospira、Nitrobacter丰度变化结果基本一致，说明在好氧条件FNA浓度约为1.16 mg/L时，经过48 h的抑制，AOB和NOB活性均未受到明显抑制。这与好氧条件下FNA浓度为0.92 mg/L时对NOB活性产生强烈抑制[29]的结论并不一致，分析认为一方面是由于试验MLSS不同导致单位菌量受到抑制的药剂量不同造成的，另一方面是整个抑制试验时间不同造成的，本试验只进行约48 h的抑制，远不足文献[29]报道抑制时间。
在缺氧抑制48 h后，与空白组对比发现，AOB丰度并未明显降低，由4.890 9×108 copies/g VSS减至3.754 4×108 copies/g VSS，但Nitrospira和Nitrobacter丰度均明显下降，分别由3.002 9×109、4.245×108 copies/g VSS降至1.666 5×108、5.163 8×107 copies/g VSS，均降低至少一个数量级，且过曝气至99 h时，rNH4+-N和rNO2--N值分别由3.5、4.828 mg N/(g VSS·h)降至2.7、0.007 mg N/(g VSS·h)，rNO2--N降低尤其明显。AOB、Nitrospira、Nitrobacter丰度变化规律与rNH4+-N和rNO2--N值变化规律均可说明在缺氧条件FNA浓度为1.16 mg/L时，抑制48 h后AOB活性受到轻微抑制，而NOB (Nitrospira和Nitrobacter)活性受到强烈抑制，这与Wang等[21]研究在缺氧条件下FNA对NOB活性具有强烈抑制作用的结果一致。
2.3 过曝气硝化反应类型变化规律图 4A和图 4B分别描述了好氧抑制48 h和缺氧抑制48 h后，过曝气时系统内NH4+-N、NO2--N、NO3--N和NAR变化规律，需要说明的是系统分别在0、99、162和256 h时静置、排水、进水，由于系统在过曝气初始时控制NO2--N浓度约为25 mg/L，因此计算NAR时需减去初始NO2--N浓度值。
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| 图 4 过曝气下，系统内NH4+-N、NO2--N、NO3--N和NAR变化规律 Figure 4 Evolution of ammonia, nitrite, nitrate and NAR in the system under aeration |
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由图 4A可以看出，整个过曝气阶段系统中NH4+-N浓度持续下降，NO3--N浓度持续升高，NO2--N浓度在过曝气初始阶段出现NO2--N升高的趋势，这是由于在过曝气初始阶段控制NO2--N浓度约为25 mg/L，且随着曝气的进行，NH4+-N被氧化为NO2--N造成的。过曝气至48 h时，NAR由33.2%逐渐降低至0，说明好氧条件FNA浓度为1.16 mg/L，抑制48 h时，对NOB活性具有轻微的抑制作用，并不能实现短程硝化。
缺氧FNA抑制48 h后，随着过曝气时间的增加，NH4+-N浓度持续下降且降解速率逐渐增加，说明随着过曝气时间的延长，AOB活性快速恢复，表明在缺氧条件下，FNA对AOB活性的抑制具有可逆性，这与Ma等[30]研究结果相似。过曝气0-268 h内，NO2--N浓度并未明显下降且NO3--N浓度未明显升高，NAR始终在98%以上，说明系统维持稳定的短程硝化效果，这与Wang等[31]通过缺氧FNA旁侧抑制实现主流城市污水短程硝化+厌氧氨氧化具有相似性。而过曝气至292 h时，NO2--N浓度出现下降，由46.3 mg/L降至44.5 mg/L，同时NO3--N浓度升高，由0.5 mg/L升高至2.7 mg/L，NAR降至94.3%，并随着曝气时间的增加，NO2--N浓度大幅度下降，NO3--N浓度大幅度升高，过曝气至324 h，NAR降至21.2%，表明过曝气至292 h时，系统短程硝化开始出现破坏现象，持续至324 h时，系统由短程硝化转变为全程硝化。
缺氧条件下，FNA对AOB和NOB均具有抑制效果，分析认为一方面是由于FNA使微生物DNA碱基配对发生紊乱，破坏DNA合成，最终导致微生物死亡[28]；另一方面是由于在缺氧、酸性条件下，FNA抑制过程中产生了对微生物具有毒害作用的中间或衍生产物，主要包括[5]亚硝酐(N2O3)、二氧化氮(NO2)、一氧化氮(NO)等小分子物质与还原态硫醇反应形成亚硝基硫醇，而亚硝基硫醇对微生物具有灭活效应。
3 结论(1) 好氧条件下FNA (初始FNA为1.16 mg/L)处理活性污泥48 h，AOB和NOB活性均未被抑制。
(2) 缺氧条件下FNA (初始FNA为1.16 mg/L)对反硝化菌活性具有抑制作用。
(3) 控制初始FNA浓度为1.16 mg/L在缺氧条件下处理活性污泥48 h后，NOB活性被抑制强度远大于AOB活性被抑制强度，且AOB活性很快恢复，过曝气0-292 h内NAR维持在94%以上。
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