我国南方污水处理厂污水碳氮比一般较低^[1-2]，常出现由于碳源不足导致的污水处理难达标问题^[3]。A/O工艺是目前应用十分广泛的污水处理工艺^[4-7]，但常需要额外投加碳源方可提高污水处理效果。多级A/O工艺是在传统A/O的基础上开发的多级A/O串联工艺^[8]，污水采用多点进水方式进入每一级A/O，可有效提高系统的反硝化能力，同时在各级A/O前端设置厌氧段，为系统除磷提供条件，该工艺目前已经得到了国内外的广泛认可。

冬季污水温度下降，导致水处理构筑物中功能微生物活性降低，污水处理效果进一步恶化，尤其是脱氮效果受影响严重。生物强化技术可通过向处理系统内投加具有目标功能的微生物或营养物等实现系统目标功能的强化^[9]，目前该技术已经被成功应用于实际污水处理工程中^[10-11]。新型菌剂的开发，如好氧反硝化菌剂、反硝化聚磷菌剂为系统脱氮除磷的强化提供了基础。载体填料生物膜的结合应用可有效缓解污泥与菌剂的流失问题，也为抵御低温条件提供了有效手段^[12]。

本研究以湘潭市某生活污水处理厂为依托，开发了一种将载体填料生物膜结合于多级A/O工艺的泥膜共生多级A/O工艺并进行了中试研究，并与污水厂现行的改进A²/O工艺的污水处理效能进行对比，在低温条件下驯化出了具有高效脱氮功能的低温好氧反硝化菌和高效除磷功能的低温反硝化聚磷菌，并针对冬季低温条件下的泥膜共生多级A/O工艺中试设备进行了生物强化，利用高通量测序技术对比研究了生物强化技术对于系统微生物群落结构的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 活性污泥驯化装置

利用图 1所示SBR反应器(直径为0.2 m，高为0.3 m，有效容积为8 L)驯化好氧反硝化及反硝化聚磷活性污泥。好氧反硝化污泥驯化参数：进水5 min，曝气450 min，沉淀20 min，排水5 min。反硝化聚磷污泥驯化参数：进水、厌氧搅拌3 h，沉淀0.5 h，排水、进水、缺氧搅拌4 h，沉淀，排水0.5 h。

1.1.2 主要试剂和仪器及培养基

重铬酸钾、纳氏试剂、酚二磺酸、N-(1-萘基)-乙二胺等，国药集团化学试剂有限公司；牛肉膏、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司。

紫外-可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；生化培养箱，哈尔滨市东明医疗仪器厂；溶解氧测定仪，YSI公司。

FM培养基(g/L)：牛肉膏1.0，蛋白胨5.0，KNO₃ 1.0。

DM培养基(g/L)：丁二酸钠4.70，磷酸氢二钠7.90，磷酸二氢钾0.75，氯化铵0.30，硫酸镁0.10，硝酸钾0.75，微量元素1.00 mL。

牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏10.0，蛋白胨3.0，氯化钠5.0。

缺磷培养基(g/L)：醋酸钠3.23，磷酸氢二钠23.00，硫酸钾17.83，氯化铵152.80，硫酸镁81.12，氯化钙11.00，HEPES缓冲液7.00，微量元素2.00 mL。

富磷培养基(g/L)：醋酸钠3.23，磷酸二氢钾25.00，氯化钙25.68，氯化铵305.52，硫酸镁91.26，PIPES 8.50，微量元素2.00 mL。

1.1.3 泥膜共生多级A/O中试装置

泥膜共生多级A/O工艺中试设备于湘潭某污水处理厂运行，如图 2所示，设备尺寸为580 cm× 220 cm×200 cm (长×宽×高)，有效容积14 m³，共14条廊道，每条廊道尺寸为100 cm×50 cm×200 cm (长×宽×高)，每条廊道底部设有曝气盘，在好氧区和厌氧区填充体积比为20%-30%的填料。控制水流停留时间为10 h，进水流量分配比为3:1，污泥回流比为100%。

1.1.4 实验水质

实验用水为湘潭河东污水处理厂进水，其中化学需氧量(Chemical oxygen demand，COD)为128.35 mg/L，氨氮(NH₄⁺-N)为13.23 mg/L，总氮(Total nitrogen，TN)为16.20 mg/L，总磷(Total phosphorus，TP)为1.16 mg/L。

1.1.5 载体填料

实验填料为XQ-Ⅱ型聚氨酯泡沫载体，方形空心，粒径约20 mm-30 mm，密度为0.015-0.03 g/cm³，表面积 > 5 000 cm²/g，单位体积生物可附着量为200-300 g/L。

1.2 方法

1.2.1 高效菌群的驯化培养及性能测定方法

好氧反硝化菌群：采用图 1装置及相关运行条件对湘潭市某污水处理厂生化池的活性污泥进行梯度驯化，逐渐提高进水硝氮(NO₃^--N)和COD浓度，直到污泥对污染物的去除效果稳定。取10 mL上述污泥加入250 mL锥形瓶中，再加入90 mL去离子水及3-5颗玻璃珠，在摇床中充分振荡。取振荡后混合液10 mL加入FM培养基中，于10 ℃、160 r/min条件下培养24 h。连续培养3代后，取培养液1 mL加入盛有100 mL DM培养基的锥形瓶中，于10 ℃、160 r/min条件下对好氧反硝化菌群进行驯化。连续驯化3代之后，好氧反硝化菌群对COD和TN的去除率达到稳定且分别达到95%和80%以上，菌群驯化完成后进行扩大化培养，用于后期生物强化。将驯化好的菌群加入含有100 mL DM培养基的250 mL锥形瓶中于10 ℃、160 r/min条件下培养24 h，考察菌群对各项指标的去除效能。

反硝化聚磷菌群：采用图 1装置及相关运行条件对湘潭市某污水处理厂生化池的活性污泥进行驯化，驯化温度为10 ℃，注水比为0.67，富集期间不排泥，厌氧段进水COD为250 mg/L，缺氧段进水不含有COD，磷的浓度控制在19 mg/L，NO₃^--N浓度控制在60 mg/L，连续驯化直到脱氮除磷率均达到80%以上。取10 mL上述污泥加入250 mL锥形瓶中，再加入90 mL去离子水及3-5颗玻璃珠，在摇床中充分振荡。取振荡后混合液10 mL加入牛肉膏蛋白胨培养基中，于10 ℃、140 r/min条件下培养24 h连续培养3代。培养完成后，取培养液10 mL加入装有100 mL缺磷培养基的锥形瓶中，10 ℃、140 r/min对反硝化聚磷菌群进行隔夜培养。将1 mL/L上述菌液接种于富磷培养基中，置于密闭容器中于30 ℃下培养24 h，并进行吸磷试验。连续培养直到脱氮除磷率均达到80%以上，菌群驯化完成，进一步扩大培养用于后期生物强化。将驯化好的菌群加入含有硝酸钾的富磷培养基(NO₃^--N浓度为60 mg/L)中，于10 ℃、140 r/min条件下培养30 h，测定菌群对NO₃^--N和磷的去除率。

1.2.2 生物强化方法

驯化好的低温好氧反硝化菌和低温反硝化聚磷菌按照生化池生物量的10%投加到生化池中，闷曝2 d使菌群在填料表面挂膜生长。控制厌氧段及缺氧段SV为25%-30%，污泥浓度为5 000 mg/L左右；控制好氧段SV为20%-25%，污泥浓度为3 000 mg/L左右。

1.2.3 水质分析方法

8 000 r/min离心10 min后取上清液进行测定，水质检测依据《水和废水检测分析方法》^[13]进行，测定pH、溶解氧(Dissolved oxygen，DO)、温度、COD、NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N、TN和TP。

1.2.4 高通量测序

从污水处理厂、中试设备强化前后以及好氧反硝化菌群和反硝化聚磷菌群混合各取50 mL样品，10 000 r/min条件下离心10 min，弃上清液后保存在-70 ℃冰箱，由上海美吉生物技术有限公司进行高通量测序。

2 结果与分析 2.1 泥膜共生多级A/O工艺的启动及运行效能

泥膜共生多级A/O工艺的中试设备经过挂膜、系统启动及参数优化后，测定了30 d内系统的COD及氮磷的去除效能。填料过膜前后内部挂膜情况如图 3所示，挂膜前后填料内部孔隙结构完好，且表面负载了大量的微生物。

由图 4A可知，在系统运行的30 d内，进水COD浓度在大部分时间都很低，约为100 mg/L左右，污水处理厂出水和中试设备出水COD浓度均稳定在20 mg/L左右，可稳定达到一级A标准。由图 4B可知，污水处理厂出水NH₄⁺-N可稳定在2 mg/L左右，中试设备处理效果普遍较污水处理厂处理效果好，可稳定在1 mg/L左右并达到一级A标准。由图 4C可知，中试设备NO₃^--N明显低于污水处理厂出水，说明中试设备反硝化效果较好。由图 4D可知，中试设备TN能稳定在9 mg/L以下，可稳定达到一级A标准，明显优于污水处理厂的TN去除效果，污水处理厂TN浓度一部分时间内仅能达到一级B标准。由图 4E可知，中试设备出水TP浓度较污水处理厂TP相对稳定且浓度较低，约0.70 mg/L左右，可达到一级B出水标准。

由表 1可知，中试设备与污水处理厂现有工艺相比，NH₄⁺-N、NO₃^--N、TN、TP去除效果差异明显。综上所述，中试设备对COD、NH₄⁺-N、NO₃^--N、TN、TP的去除效果均较好，NH₄⁺-N、NO₃^--N、TN、TP的去除均优于污水处理厂的处理工艺。

2.2 高效菌群脱氮除磷效能

2.2.1 好氧反硝化菌群的脱氮效能

驯化的好氧反硝化菌群脱氮效能如图 5所示。结果表明，0-6 h内浓度基本不变，NH₄⁺-N浓度稳定降低，TN去除率较低。反应6 h后，NO₃^--N浓度大幅度降低，TN去除率迅速提高，这是因为随着系统中好氧反硝化菌群菌量提高，好氧反硝化速率大于异养硝化速率，NO₃^--N的转化量大于生成量，不断转化为氮气排出系统，TN去除率也得以提升。反应12 h后，系统中可用碳源耗尽，限制了同化作用、好氧反硝化作用的进一步进行，NH₄⁺-N和NO₃^--N浓度趋于稳定，TN去除率达到最大值84.21%。

2.2.2 反硝化聚磷菌的除磷效能

由图 6可知，反硝化聚磷菌群对磷的去除率最高可达85.75%。调整期(0-3 h)系统中菌量较少、活性较低，除磷效果不理想。进入对数生长期(3-18 h)后，反硝化聚磷菌大量繁殖，该阶段系统中菌量充足、活性较高且有机碳源充足，反硝化聚磷菌过量吸收磷以合成新的细胞，因此磷浓度不断降低、除磷率陡增。18 h后，系统中剩余有机物含量已不足以继续支持聚磷菌的生长，除磷率不再提高，最终稳定在83.15%。同时，研究结果表明该反硝化聚磷菌群对NO₃^--N具有较高的去除率，可达到81.22%。

2.3 基于生物强化技术的泥膜共生多级A/O工艺效能研究

冬季水温约为10 ℃左右时，中试设备及污水处理厂的污染物去除效能均受到了不同程度的影响，导致出水水质下降，采用2.1中驯化出的低温好氧反硝化菌和低温反硝化聚磷菌对中试设备进行生物强化。生物强化后中试设备与污水处理厂污染物处理效能结果如图 7所示。由图 7A可知，中试设备经生物强化后出水COD得到了一定的改善，但效果不明显，可稳定在20 mg/L左右，明显优于污水处理厂出水，出水可稳定达到一级A标准。由图 7B可知，在低温条件下NH₄⁺-N去除效果变差，可能由于硝化细菌对温度变化较为敏感，经过生物强化后，第9天出水NH₄⁺-N浓度仅为0.37 mg/L，远优于污水处理厂的NH₄⁺-N去除效果。由图 7C可知，在低温条件下，中试设备和污水处理厂出水中NO₃^--N浓度均较高，且污水处理厂原有工艺出水NO₃^--N浓度波动较大，中试设备经过生物强化后NO₃^--N浓度下降且较为稳定，最终稳定在9 mg/L左右。由图 7D可知，在低温条件下污水处理厂和中试设备TN去除均下降，且污水处理厂TN处理效果波动较大，中试设备经过生物强化后TN去除效果得到了明显的改善，可稳定在11 mg/L左右。由图 7E可知，温度降低对于TP的去除影响较小，但中试设备经过生物强化后TP去除效果逐渐升高，最终趋于稳定，最终TP浓度稳定在0.5 mg/L左右，明显优于污水处理厂处理效果。

由表 2可知，中试设备进行生物强化后与污水处理厂现有工艺相比，COD、NH₄⁺-N、NO₃^--N、TN、TP去除效果差异明显，说明利用低温好氧反硝化菌和低温反硝化聚磷菌可对中试设备进行生物强化，能较好地改善中试设备NH₄⁺-N、NO₃^--N、TN、TP的去除效果。

2.4 泥膜共生多级A/O工艺微生物群落结构解析

从微生物群落结构的角度比较了生物强化后中试设备的生化池污泥(强化样品)、未进行生物强化的中试设备生化池污泥(设备样品)、好氧反硝化菌群和反硝化聚磷强化菌剂混合样品(菌剂样品)和水厂生化池污泥(水厂样品)的微生物群落结构差异，结果如图 8所示，强化样品中的优势菌属为Pseudomonas、Aeromonas和Saprospiraceae_ uncultured，设备样品中的优势菌属为Saprospiraceae_ uncultured和Planctomyces，而Saprospiraceae_ uncultured、Planctomyces和Flavobacterium在水厂样品中占比较大。菌剂样品显示，通过富集驯化得到的生物强化菌剂中的主要菌群为Pseudomonas，大部分好氧反硝化菌和反硝化聚磷菌属于该菌属^[14-15]，中试设备经过生物强化后Pseudomonas占据了一定优势，而在中试设备未强化前及水厂样品中该菌属含量均很低。同时，在生物强化菌剂中也含有较多的Accumulibacter，该菌属为典型的聚磷菌^[16]，在水厂样品、设备样品及强化样品中含量分别为0.97%、2.57%和3.51%。从一定程度上表明，中试设备经生物强化后脱氮除磷效果得到了明显提升，这两类菌群起到了积极作用。Aeromonas中包含很多具有反硝化作用的菌种且较耐低温^[17]，在中试设备中该菌属占据一定优势，含量为3.31%，而在水厂样品中该菌属含量极低，可以证明中试设备脱氮作用较水厂工艺效果好，该菌属起到了一定作用。另外，中试设备经过生物强化后，该菌属含量提高至5.38%。说明生物强化后中试设备中脱氮除磷功能菌占比均得到了提升。

整体来看，经过生物强化后系统中微生物群落结构发生了一定的演替现象，具备脱氮除磷效能的功能菌群数量有所提升，对低温环境的适应性更佳，改善了原系统对污水的处理效果。

3 讨论与结论

为解决低温、低碳氮比生活污水处理效果差的问题，本研究开发了一种泥膜共生多级A/O工艺并进行了中试研究。该工艺结合了多级A/O工艺和生物膜技术的优势，常温条件下该组合工艺与污水处理厂现行改进A²O工艺相比，NH₄⁺-N、NO₃^--N、TN、TP的处理效果均有明显的提升。与Cao等^[18]研究相一致，Cao等采用改进的四级A/O工艺处理常温低营养城市生活污水，也取得了很好的处理效果，在一定程度上说明常温条件下多级A/O工艺对于低碳氮比生活污水的处理具有较好的效果。但研究发现在低温条件下多级A/O工艺处理效果与传统A²O工艺一样会受到影响，而生物强化技术作为一种功能强化技术，可为解决低温带来的污水处理效能下降问题提供契机，因此，本研究筛选了具有高效脱氮功能的低温好氧反硝化菌和高效脱氮除磷功能的低温反硝化聚磷菌，并将其通过挂膜方式在泥膜共生多级A/O工艺中试设备中进行生物强化。本研究中泥膜共生多级A/O工艺中试设备中载体填料的选择，除考虑到生物膜本身的优点外，还考虑到聚氨酯泡沫载体的空隙率大、传质性能好、比表面积大、生物亲和性好、亲水性好、易于流化等优点^[19-21]，在提高系统生物量的同时，可有效缓解生物强化菌的流失^[22-23]。本研究中生物强化结果表明，生物强化引起了系统内脱氮除磷功能菌群占据优势，有效改善了系统污染物的去除效能，这一现象与以往研究具有相似之处。Guo等^[24]为了实现污水厂污水处理工艺在低温条件下的快速启动与稳定运行，采用生物强化技术在15 d内完成了启动并运行稳定，而且研究发现投加的菌剂在系统中均处于优势种群的地位，赵立军^[11]通过投加生物菌剂成功实现了哈尔滨太平污水厂的低温启动且出水效果良好。因此，基于生物强化技术的泥膜共生多级A/O工艺是处理低温、低碳氮比城市生活污水的有效方式，具有广阔的应用前景。