2019, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 黄梦姣, 张芸, 薛春宜, 曹永长
- HUANG Meng-Jiao, ZHANG Yun, XUE Chun-Yi, CAO Yong-Chang
- 应对日益严峻的挑战：中国禽传染性支气管炎研究
- To meet the growing challenge: research of avian infectious bronchitis in China
- 微生物学通报, 2019, 46(7): 1837-1849
- Microbiology China, 2019, 46(7): 1837-1849
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180898
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文章历史
- 收稿日期: 2018-11-12
- 接受日期: 2019-04-03
- 网络首发日期: 2019-05-15
禽传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis，IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。该病毒广泛流行于世界各地，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一[1]。禽传染性支气管炎病毒可感染所有日龄的鸡，主要感染呼吸道上皮细胞和消化道相关组织以及其它组织如肾、输卵管和睾丸等[2]，导致鸡只生长迟缓、发病死亡。肉鸡感染后，其饲料报酬降低、品质下降。此外，蛋雏鸡感染还会造成生殖系统永久非可逆损伤，表现为无产蛋高峰、产蛋数量与质量下降。中国地域辽阔，气候环境差异显著，是世界养禽大国且饲养品种繁多。因此，IBV在中国的流行情况极为复杂，中国禽传染性支气管炎研究具有其自身特色。
禽传染性支气管炎病毒(IBV)为有囊膜、不分节段的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科γ冠状病毒属。病毒基因组大小约为27.6 kb，其结构为：5′-UTR-1a/1ab-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3′UTR。IBV侵入宿主细胞后，从基因组5′端翻译合成复制酶，通过不连续转录机制生成6条亚基因组(即mRNA 1-6)。这6条亚基因组分别编码15种非结构蛋白(nsp2-16)，4种主要结构蛋白如纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)以及4种附属蛋白3a、3b、5a和5b。S蛋白为主要抗原性蛋白，参与病毒与宿主细胞融合[3]，与病毒的组织嗜性[4]以及致病性[5]密切相关。病毒侵入细胞后，S蛋白被蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基。其中，S1蛋白介导病毒与宿主细胞结合[4]，可刺激机体产生中和抗体[5-7]。同时，S1亚基是决定IBV血清型特异性抗原决定簇的主要蛋白[8]。此外，S1基因序列因突变或重组可能造成新基因型的产生，从而造成传统疫苗程序的失败[2]。因此IBV的S1基因序列特征及进化规律常被用于IBV的分子流行病学分析[9]。
IBV基因组容易发生点突变、缺失、插入及毒株间的同源重组，导致基因变异株不断被分离。此外，IBV血清型众多，全世界报道的已有30多种[10-11]。随着IBV的持续变异，新的血清型也不断涌现。在中国，IBV流行毒株随不同时间和地区呈现较大差异。根据不同标准将IBV毒株分为血清型、基因型及保护型等，而不同血清型、基因型间不产生交叉保护或者交叉保护很弱的特点，使得疫苗免疫程序不断受到挑战。因此，尽管该病被报道超过60年，如今对它的防控仍然不完全[12]。长期的流行病学监控，进而选择针对本地区流行毒株的疫苗，以及高效IBV疫苗的研发对IB的防控具有重要意义。
2 中国IBV毒株分离与鉴定中国首例IB在1972年出现于广东省[13]。早期根据IBV的组织嗜性，将毒株分为嗜肾型、嗜输卵管型、嗜腺胃型及嗜肠型等。在中国，首例嗜肾型IBV于1990年在广西分得[14]。1995年于山东胶东，分离到嗜输卵管型的IBV变异株[15]。1996年在山东青岛地区发病鸡群中分离的毒株即QX株，为嗜腺胃型IBV代表株[16]。嗜肠型IBV毒株则最早在1998年于辽宁省分离得到[17]。随着分子生物学技术的发展，之后分离毒株多以基因型分类。目前国内QX型(GI-19)毒株为优势流行毒株，其次4/91型(GI-13)毒株也一直被分离。而TW型(GI-7)毒株起源于中国台湾，因其独特海岛地理原因，前期也只在中国台湾地区流行，但自21世纪以来该毒株在大陆也开始被分离到，之后不断有基因重组株被分离。
养禽业的全球化扩大了IBV传播范围。QX型(GI-19)毒株最早于1996年从中国青岛地区分离，并于1999年在中国新疆病鸡群中分离到代表毒株LX4株[18]，该毒株可能源于韩国株的变异。韩国于20世纪90年代初期出现KM91株并开始在韩国流行[9]。不久后中国开始分离到与韩国株K069-01相似的毒株CK/CH/LTJ/95Ⅰ株(1995年分离于天津)等[19]，且与中国山东分离到的QX型毒株关系较近[20]。考虑到中国山东与韩国的地理距离，猜测QX型(GI-19)毒株可能来源于韩国，并在中国不断进化形成QX型(GI-19)，成为国内的优势流行毒株并流行于周边国家甚至欧洲。在2001年，东欧发现与QX型(GI-19)相似的毒株[21]。随后英国等西欧国家也开始有类似QX型(GI-19)毒株的报道[22-23]。目前该基因型毒株在全球范围内已成为优势流行毒株[24-30]。
793/B(4/91)型(GI-13)毒株最早于1991年在欧洲出现，随后迅速传播到世界各地[31]。国内部分学者认为2000年前后中国已出现4/91型(GI-13)毒株。1996年于北京分离到的A2株为2000–2010年间的流行毒株[32]。气管环交叉中和试验及4/91疫苗对该毒株的免疫保护实验结果显示其为类4/91型(GI-13)毒株[33]。在2008年对A2株的全基因组测序分析结果表明，其全基因组与Mass株相距较远[32]。此外，对S基因进行系统进化树分析发现，A2株属于QX型(GI-19)[34-37]。国内首次报道的真正意义上的类4/91型(GI-13)毒株应是2003年从山东省发病鸡场分离到的TA03株，血清型鉴定和S1基因序列分析均证明其为793/B(4/91)型IBV，命名为TA03株[38]。自此，4/91型(GI-13)毒株开始在中国不断被分离，成为国内广泛存在的IBV毒株类型[39]。
1958年中国台湾发生IB疫情，因其地理因素影响，IBV分子进化与大陆及周边国家有很大的差异。中国台湾地区分离的IBV毒株被分为两个基因型：TW-Ⅰ型和TW-Ⅱ型[40-41]。1990年之前分离的多为TW-Ⅱ型，通常表现为呼吸道症状；1990年后TW-Ⅰ型出现并广泛传播，通常表现为致肾病变型[42]。在大陆地区，TW型IBV分离株主要是TW-Ⅰ型，TW-Ⅱ型IBV分离较少[40-41]。
IBV基因组易发生突变和重组，从而导致抗原漂移和转换。Yang等于2005年完成了四川致肾病变型分离株SAIBK株的全基因组测序和分析[43]，表明该毒株源于YX10株(GI-19)、YN株(GI-19)以及Mass型(GI-1)毒株重组。Feng等分离出由YX10株(GI-19)和4/91株(GI-13)重组而来的CK/CH/GD/QY16 (QY16)株[44]。Liu等分别于2011年从H120免疫的鸡场中分离到由ck/CH/LDL/ 09/022株(GI-19)和4/91类毒株(GI-13)重组的ck/CH/LZJ/111113变异株[45]，Zhang等2014年从H120免疫的鸡场中分离到由4/91类毒株(GI-13)和H120毒株(GI-1)多重重组的变异株ck/CH/LHLJ/ 140906[46]，且该变异株为新的血清型毒株。Xu等对2016–2017年分离得到的IBV毒株进行分析后得到I2217-2/16等7株IBV变异株，并发现QX型(GI-19)、TW-Ⅰ型(GI-7)以及4/91型(GI-13)间毒株的重组是造成新变异株出现的主要原因[47]。3种不同IBV基因型/血清型毒株LDL/150434 Ⅰ、LDL/150434 Ⅱ和LDL/150434 Ⅲ在一只鸡的气管样本中检测到；分离株LDL/150434 Ⅰ为H120疫苗株的再分离；LDL/150434 Ⅱ是H120与ck/CH/LDT3/03样病毒重组事件的新变种；LDL/150434 Ⅲ与2009年以来在中国大陆流行的nr TW Ⅰ型(GI-7)毒株存在遗传相关性，但存在明显差异[48]。由重组而产生的变异株不断涌现，给IBV的监测和防控带来极大挑战。此外，Han等分别从中国不同省份病鸡群中分离得到基因型为Arkansas (Ark)型(GI-9)的毒株I0712/11和I0108/17。研究表明中国Ark型分离株来源于Jilin疫苗株，且自传入中国以来通过点突变独立进化；中国分离到的Ark病毒有可能是由于美国ArkDPI11样毒株的引种，该预测需进一步检测证实[49]。
3 IBV分子流行病学研究IBV血清型、基因型众多，流行范围广，持续的流行病学监控对IB的防控具有重要意义。目前美国的优势流行毒株为Arkansas株(GI-9)及其持续进化形成的Ark-like株(GI-9)[50]，其他的流行毒株包括Delaware型(GIV)、Conn型(GI-1)和Mass型(GI-1)[20]。澳大利亚IBV分离株根据S1基因序列、基因组3′端以及血清学反应被分为亚群1 (经典株)、亚群2和亚群3(新毒株)。亚群1包括澳大利亚首次分离的IBV毒株Australia/Nl/62和疫苗株Australia/VicS/62[51]；亚群2从1988年开始出现，包括Australia/subgroup 2/N1/88、Australia/subgroup 2/Q3/88和Australia/subgroup 2/V18/9株[52]；亚群3从2002年开始出现，来源于亚群1和亚群2的毒株重组[52-53]，包括Australia/subgroup 3/N1/03和Australia/subgroup 3/N2/04等。欧洲早期的IBV毒株包括Mass型毒株、英国的B/D274/84株和E/D3896/84株以及新西兰的D207/79株和Dl466/79株[54]。1991年793/B毒株(GI-13)在欧洲出现，随后传播至亚洲、中东、南美等多地。Italy-02株(GI-21)几乎存在于欧洲各个国家，但自2004年开始Italy-02株(GI-21)开始在欧洲减少(除西班牙以外)，而QX型(GI-19)开始在欧洲广泛流行[30]。此外，QX型(GI-19)也在中国周边国家流行。韩国在2003–2006年间的分离毒株显示其主要流行3种基因群：Korea(K)-Ⅰ、K-Ⅱ和K-Ⅲ (LDL)[55]；K-Ⅱ被划入LX4群(GI-19)。日本基本存在4个基因群：Japan(JP)-Ⅰ、JP-Ⅱ、JP-Ⅲ和JP-Ⅳ；Japan(JP)-Ⅰ、JP-Ⅱ和JP-Ⅳ为日本独立的基因型，JP-Ⅲ被划入LX4群(GI-19)[56-58]。
中国地域辽阔，各地气候环境存在较大差异，南北方饲养品种和饲养模式都不一样，因此IBV在不同时间和不同地区的流行特点也不同。在2007年之前，我国IBV的基因型往往被分到7-9个基因型，此时IBV多为地方性流行，并没有全国性的优势流行毒株。Han等对中国在1995–2009年间分离的220个分离株S1基因进行遗传进化分析，将IBV分为9个基因群：LX4 (GI-19) (54.1%)、LSC/99I (GI-22) (12.3%)、Mass (GI-1) (8.6%)、LDT3/03、LDL/97I (GI-16)、BJ、LHLJ/95I、N1/62和4/91 (GI-13)型，以及不属于上述基因型的变异重组株[59]。Liu等于2005年对国内在1995–2004年分离的26株IBV与中国26株参考株及5个其它毒株进行比较分析后，将IBV分为8个基因型。基因Ⅰ型为QX型(GI-19)；20世纪90年代分离的6株IBV属于基因Ⅱ型；4株分离株属于基因Ⅲ型，且与韩国株显示较近的关系；Mass型(GI-1)和TW型(GI-7)为独立的2个基因型；HN99和CK/CH/LHN/00I两株分离株可能是疫苗的再分离株，被划为基因Ⅵ型；另4株组成与其他基因型距离较远的基因Ⅶ型[19]。表明IBV基因的变化不仅来源于野毒株自然变异，也来源于活疫苗的引用，各基因型毒株如QX型、LSC/99Ⅰ型、LDL/97Ⅰ型和Mass型在国内流行[19]。
到了2008年，QX型(GI-19)在我国开始成为流行毒株。LX4株(GI-19)于1999年被首次分离以来，到2009年其S1基因发生了轻微的变化[59]。国内很多地方的免疫鸡群发生由该型病毒引起的腺胃或肾脏病变，并迅速传播到欧洲，该毒株对应的欧洲原型株L-1148最早发现于2003年[60]。Li等对中国广西1985–2008年间26株IBV进行了血清型和基因型的变异研究。根据对S1高变区I (HVR I)的序列分析，将26株分离株与已发表的18株IBV分为5个基因型：LX4 (GI-19)、4/91 (GI-13)、JP、Gray (GI-3)和Mass (GI-1)；且LX4型(IG-19)为当时广西地区的流行毒株[61]。Liu等在2008年对国内37株IBV分离株进行分析，表明LX4型(GI-19)为当前流行毒株[62]。Zou等对2008–2010年间从四川分离到的19株IBV毒株进行序列分析表明，除TW-Ⅰ型(GI-7)和Mass型(GI-1)等，LX4型(GI-19)为最主要基因型[63]。根据2011–2012年间对中国西南地区分离到的19株野生毒株的序列分析，将这些毒株分为3个群：QX型(GI-19)、SAIBK型(GI-22)、TW97/4型(GI-7)，且都为嗜肾型IBV[64]。在2012–2016年间分离到24株IBV，被分为4个基因型：QX (GI-19) (37.5%)、TW (GI-7) (16.7%)、Mass (GI-1) (8.3%)和J2 (GI-16，即LDL/97I类毒株) (4.2%)[65]。2016年到2017年12月期间的流行病学调查表明：当时我国QX型(GI-19)分离株的数量依然最多；此外，4/91型(GI-13)、类LDT3型、Mass型(GI-1)、TW-Ⅰ型(GI-7)也广泛存在[47]。
对1995–2005年间分离的110株LX4型IBV毒株进行的起源和进化研究发现，基因重组可能是LX4型(GI-19) IBV毒株出现的原因。其中大部分新产生毒株因为不能适应鸡只在2005年中期消失，而适应鸡只的LX4型(GI-19)毒株开始在2005年后不断进化，成为在国内快速传播和流行的毒株[66]。此外，Zhao等对中国1994–2014年间107株IBV毒株的全基因组以及1 022个S基因的序列进行分析，发现IBV基因大约平均以每年每个位点10–5的频率发生碱基的替换，且QX型(GI-19)随着时间推移所占比例越来越大[67]。
在华南地区，李林林等对2004–2008年的IBV毒株S1基因进行系统进化分析后发现，分离株主要聚类于QX型(GI-19)、4/91型(GI-13)和HN08型(GI-22，即北方地区所称的LSC/99Ⅰ型，四川等中部地区所称的SAIBK型)，与疫苗毒株之间的进化关系较远[34]。Ji等在2008–2009年间对IBV进行流行病学调查发现绝大部分IBV分离株属于A2分支(GI-19)和HN08分支(GI-22)[36]。2011–2012年间和2013–2015年间流行病学分析显示QX型仍为优势流行毒株[39, 68]；此外，TW Ⅰ型逐渐成为优势基因型[39, 69]。以上研究表明，在华南地区不同基因型的IBV毒株共同存在且一直处于进化阶段。
国外对QX基因型毒株的流行也进行了全面和大规模研究。Franzo等采用贝叶斯系统动力学方法重建QX基因型(GI-19)的流行病学模式和种群历史来了解这种病毒的国际传播动态。该分析基于1993–2015年间从18个国家收集的807株S1片段序列，证明该基因型早在首次鉴定前就起源于中国；经过长时间的局部传播，它开始以连续的浪潮向其他欧洲、亚洲和中东国家传播；此外，欧洲内部蔓延的速度要比洲际间快，这可能反映了这些国家之间更密切的地理和经济关系；对当地即意大利境内QX毒株进行环流重建发现，不同地点之间显示出更为复杂的连接网络，这证明在家禽高度密集的地区，对IBV传播的控制更为困难[70]。
目前我国存在的IBV毒株中，QX型(GI-19)毒株数量上仍占据优势，预测该毒株流行趋势在近几年不会衰减。TW型(GI-7)在国内也逐渐开始流行，且数量呈每年递增趋势，对该基因型的监测也应值得关注。4/91型(GI-13)毒株在我国也广泛存在，该基因型毒株的分离比例处于较为稳定的状态，且易与其他毒株发生重组[44-46]，与4/91型毒株联合的多价活疫苗应斟酌后使用。
4 IBV检测技术研究IBV临床症状与多种呼吸道疾病相似，临床中常与新城疫病毒等混合感染[71]，IB的确诊需依靠实验室检测技术，其诊断方法主要包括病毒的分离与鉴定、血清学方法和分子生物学方法。
病毒的分离主要为鸡胚传代，通过检查尿囊液是否对红细胞有凝集性，判断有无流感病毒和新城疫病毒的污染，同时做侏儒胚实验和NDV干扰实验来鉴定样品中是否含IBV病毒。
血清学方法主要为ELISA检测方法。ELISA检测方法简便快速且敏感性好而被广泛应用于IBV的抗原抗体检测，OIE也将其确定为标准方法。本实验室分别用H120和M41制备病毒样颗粒作为包被抗原，建立了间接ELISA抗体检测方法。用该方法分别检测新城疫病毒、H1N1和H5N1流感病毒的阳性血清，结果均为阴性；而且该检测方法对IBV病毒血清的检测结果显示批内重复实验和批间重复实验的变异系数均值(CV%)均小于8%，说明该方法特异性较强，同时具有良好的重复性。
分子生物学技术包括RT-PCR、RT-LAMP以及qRT-PCR等。RT-PCR的方法一般是根据IBV某基因的保守区域设计引物，检验能否逆转录扩增出目的基因判别是否含有IB病毒，是一种较为常用的方法。RT-PCR常与RFLP即限制性酶切多态性分析技术联合使用，研究表明RFLP分型结果与血清型能较好符合[72-73]。RT-LAMP即逆转录环介导等温扩增技术，因能恒温扩增、用时较短且能肉眼观察鉴定而被广泛用于田间试验。本实验室对IBV的1a基因保守区域设计LAMP引物及简并引物建立RT-LAMP方法，既保证了种间特异性，又保证了种内特异性。与一步法RT-PCR同步实验进行比较发现，RT-LAMP灵敏性更高且更为特异，适用于田间和简易实验室检测。qRT-PCR即荧光定量RT-PCR多用于检测病毒拷贝数。Okino等建立了一种基于SYBR Green I RT-qPCR对S1基因高变区熔解温度分析的方法，快速检测不同基因型IBV毒株并鉴定其是否为Mass基因型。该方法可快速鉴定尿囊液甚至是组织中Mass基因型毒株[74]。
5 IBV疫苗开发IBV血清型复杂，且不同血清型间交叉保护效果弱。目前市场上使用的IBV疫苗主要是减毒活疫苗和灭活疫苗，随着分子生物学技术的日益发展，新型基因工程疫苗的研制也成为研究热点，主要包括核酸疫苗、活病毒载体疫苗以及亚单位疫苗等。
IBV减毒活疫苗能刺激机体产生良好的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫[75]，临床上获得了广泛应用。减毒活疫苗适用于群体免疫，常用于种鸡和蛋鸡的首免以及肉鸡的免疫，具有使用方便、生产成本低等特点。目前国内常用活疫苗有H120、H52、Ma5、M41、28/86、W93等Mass血清型以及2011年中国农业部批准的新型减毒活疫苗LDT3-A株和2017年批准的4/91型疫苗NNA株。
H120和H52是我国引进的荷兰株疫苗，对我国流行的多数血清型IBV有较好的免疫效果，因此成为国内使用最广的两种疫苗。H120常与新城疫病毒La Sota株制成二联苗用于初生雏鸡，不同品种均可使用。H52毒力较H120强，只适用于接种1月龄以上的鸡，专供后备蛋鸡和种鸡的加强免疫接种，也常与新城疫病毒La Sota株制成二联苗。Ma5株毒力弱，可用于1日龄以上育雏鸡和产蛋鸡。M41毒力较强，在实践中主要用于育成鸡复免用，同时常与新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法式囊病毒或减蛋综合症病毒制成三联或四联灭活苗。28/86株毒力低，对肾型病变保护率较高，可用于任何日龄的鸡。W93为我国自主研制的Mass血清型疫苗[76]。Liu等于2003年从广东水鸭中分离到一株典型肾型IBV毒株tl/CH/LDT3/03[77]，并于2011年获得以此毒株研制的减毒活疫苗LDT3-A的注册证书。目前，LDT3-A株疫苗是国内与QX关系最近的商品化疫苗株。2017年12月刚获得注册证书的NNA株为类4/91型疫苗。4/91型减毒活疫苗在2017年前虽然尚未得到官方批准使用，但在生产中的应用已经十分普遍，可用来预防鸡群发生深层肌肉病变和产蛋率下降。
针对临床上广为流行的QX型毒株，国内目前没有商品化的活疫苗。Karimi等对H120和Ma5疫苗早期对抗QX毒株的疗效进行了观察，结果表明H120和Ma5均不能诱导对QX早期攻毒的适当交叉保护，建议采用其他形式和不同基因型的疫苗免疫1日龄雏鸡[78]。为了更好地防控该病的发生，国内学者通过不同方法尝试制备安全有效的QX型弱毒苗候选株，对雏鸡进行安全性和有效性试验，均得到良好的保护效果[11, 79-80]。Feng等采用传统的鸡胚传代获得QX型YX10株的致弱毒株YX10p90株，该毒株不引起7日龄SPF鸡的发病和死亡，对QX型毒株YX10p5可产生几乎完全的保护[11]。此外，Zhao等也采用鸡胚传代获得QX型YN株的致弱毒株aYN株，致弱株相较于亲本株致病力更弱，能诱导机体产生更高的抗体滴度[80]，Yan等又通过在鸡胚中连续传代130代制备减毒QX型IBV株SZ130，并对其安全性进行了检测，所有SZ130株免疫组均无临床症状或严重病变，组织病毒复制率降低，纤毛摆动停滞减轻[81]。Xia等采用在鸡胚肾细胞(CEK)中将QX型毒株Sczy3传至100代得到SczyC100株，该毒株经过致病性和毒力回归测试表明可用于1日龄SPF鸡，SczyC100与H120和4/91对QX型和TW-Ⅰ型毒株的攻毒保护表明，Sczy3C100有效降低发病率、死亡率、组织损伤和鸡气管病毒载量[82]。本实验室利用极限稀释法获得一株QX型毒株ZYY的致弱毒株ZYYR，对其致病力、安全性、遗传稳定性等进行了一系列评估。极限稀释法利用高稀释度将病毒粒子稀释，使单个病毒粒子进入单枚鸡胚内，从而在这种压力选择下筛选出最适合在鸡胚内生长的单一的、稳定遗传的、高滴度的病毒粒子。该方法可快速筛选出可能的疫苗候选株，大大缩短了弱毒株的培育时间。致弱毒株ZYYR以106.5 EID50/羽接种1日龄SPF鸡，发现不引起死亡和病变。对QX型强毒株HSJ株和Mass型经典强毒M41株均具有攻毒保护[79]。
2016年对一株自然重组的TW-Ⅰ型CH/LDL/140520毒株的血清型、抗原性、致病性的研究表明，已有的疫苗株或减毒株对此株IBV无完全气管保护力[83]。针对TW (GI-7)型毒株在国内的流行趋势，对TW-Ⅰ型毒株是否产生免疫保护应成为疫苗研究新的判断标准。
IB灭活疫苗是由完整的IBV颗粒经理化方法灭活后制备的疫苗，安全性好且易于保存，主要在种鸡、蛋鸡开产时使用。灭活疫苗单独使用不能提供良好的免疫保护能力，因此常用在活疫苗之后用来加强免疫。IBV往往与新城疫病毒、禽流感病毒等组成多联灭活苗。
核酸疫苗由编码能引起保护性免疫反应的IBV抗原的基因片段和载体构建而成，在构建多价疫苗方面具有突出的优势，如Yang等构建的IBV多价DNA疫苗[84]。活病毒载体疫苗是利用分子生物学遗传工程技术将保护性抗原基因整合进病毒载体基因组中，构建成表达IBV抗原的重组活载体疫苗。
亚单位疫苗是指通过选取病原微生物的主要免疫原性蛋白基因，利用不同的表达系统如大肠杆菌、杆状病毒和酵母在体外进行高效表达，然后提取目的蛋白用来制备成亚单位疫苗。目前有关IBV基因工程亚单位疫苗的研究报道主要围绕IBV的主要免疫原性蛋白S1蛋白和N蛋白开展研究[85-89]。这些研究显示，S1基因和N基因均能够在体外得到高效表达，但是存在着部分或完全不能糖基化和磷酸化等问题，制备的疫苗需要经过多次加强免疫后才具有免疫保护作用，并且攻毒保护水平并不高，作为商品化疫苗的应用前景不够理想。在大肠杆菌中表达具有IBV多抗原表位的多肽，并通过肌肉注射方式免疫SPF鸡的攻毒实验结果表明，该多肽疫苗可对免疫鸡提供80%的保护率[90]。利用杆状病毒表面展示技术表达S1蛋白的免疫试验结果表明，疫苗可以刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，可对免疫鸡提供83%的保护[91]。本实验室根据前期研究的发现，即H3N2流感病毒HA蛋白的跨膜区具有独特的结构，若将该跨膜区替换到H1、H5或H9亚型的HA蛋白上能提高相应HA蛋白的稳定性和免疫原性，利用昆虫杆状病毒表达系统分别表达IBV S1蛋白、S1-H3 (TM)融合蛋白和S1-HA2融合蛋白，结果表明，用这些重组蛋白免疫SPF鸡，与灭活疫苗组和rS1蛋白组相比，融合蛋白(rS1-H3 (TM)和rS1-HA2)能诱导机体产生更高的IgG抗体，能更有效地活化T淋巴细胞，且攻毒保护效果良好。此外，增加rS1-HA2亚单位疫苗的免疫剂量可以提高试验鸡的抗体滴度和攻毒保护效力，而且该疫苗安全性好[92]。
病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)是含有病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制。VLPs作为一种新型基因工程疫苗，与传统疫苗相比具有免疫原性强、不依赖于鸡胚、安全性高等许多优势。本实验室利用杆状病毒表达系统将表达IBV-H120毒株M蛋白及S蛋白的杆毒感染昆虫细胞后，可自主组装成IBV-VLPs；将该VLPs分别在SPF BALB/c小鼠和SPF鸡上进行免疫实验，产生的IgG抗体水平与灭活疫苗组相当；在细胞免疫方面，VLP实验组的免疫效果显著优于灭活疫苗组[93]。将表达IBV-H120 S1蛋白及流感病毒H5N1 NA跨膜区(含胞内区)的融合蛋白NA/S1的重组杆状病毒r-NA/S1和表达流感病毒H5N1 M1蛋白的重组杆状病毒r-M1一起感染昆虫细胞SF9，获得由M1和融合蛋白NA/S1包装而成的嵌合VLP-M1-NA/S1，动物免疫保护试验表明该VLPs相对于灭活疫苗，能在SPF鸡中引发更高的中和抗体水平，在小鼠中引发更高的IL-4水平[94]。
通过反向遗传学操作进行疫苗制备也在被尝试。有研究报道，IBV辅助蛋白缺失株相较于野毒株在体内外实验中均毒力降低[95]，且IBV辅助蛋白缺失株相较于野毒株对Ⅰ型干扰素更为敏感[96]。van Beurden等通过一种新的基于靶向RNA重组的反向遗传学系统来操作IBV株H52的基因组[97]，拯救出的3ab或5ab基因缺失的重组减毒株可预防鸡传染性支气管炎[98]。重组(r) rIBV-D3ab、rIBV-D5ab、rIBV-D3ab5ab株与重组野生型毒株rH52具有相同的病毒效价，与rH52和野生型H52相比，rIBV-d3ab、rIBV-d5ab和rIBV-d3ab5ab在感染1日龄鸡时，气管纤毛摆动停滞被减轻。
此外，研究者也尝试加入不同佐剂来提高IBV疫苗免疫效力。黄芪多糖由黄芪中提取，可作为免疫促进剂或调节剂。国内学者尝试将黄芪多糖作为DNA疫苗的佐剂，结果表明使用黄芪多糖作为佐剂可剂量依赖性提高IBV特异性抗体滴度，诱导淋巴细胞增殖以及IL-1b、IL-2、IL-8、TNF-α的mRNA上调[99]。体外实验表明，经黄芪多糖处理后，感染CEK细胞的IBV滴度明显降低，且呈剂量依赖性[100]。此外，国外有研究报道采用壳聚糖纳米颗粒通过离子交联法包裹灭活IBV疫苗可诱导黏膜免疫应答，提供有效攻毒保护[101]。国内学者也做出用季胺化壳聚糖纳米颗粒作为粘膜佐剂制备NDV和IBV联合减毒活疫苗的尝试[102]。
目前对IBV疫苗研制的报道虽然不少，但符合市场需求的仍然为减毒活疫苗和灭活疫苗。活疫苗存在毒力返强、易与野生毒株发生重组以及疫苗研制速度跟不上毒株变异速度的问题，不能从根本上防控该病；灭活疫苗单独使用达不到足够的保护效果。该病的防控将是一个持久战，安全有效的弱毒疫苗亟待开发，如何提高研制速度从而及时有效控制当时的优势流行毒株显得尤为重要。
同时，IBV灭活疫苗单独使用不能提供足够的免疫保护，其机制尚不清楚。研究宿主与病毒的相互作用机制，制备广谱高抗原性的亚单位疫苗的研制也许会成为突破口。其次，禽类对IBV疫苗应答的水平和持续时间取决于许多因素，包括禽类的年龄、母体抗体(MDA)水平、禽类的免疫能力、攻毒毒株的毒性和类型以及疫苗接种和攻毒之间的间隔，当然还有疫苗的免疫原性。对疫苗进行评估时所有因素都应该被考虑，应建立全面系统的疫苗评估体系。
6 IBV免疫程序研究目前国内对IB的防控除采取严格的生物安全措施外，主要通过疫苗免疫接种来预防和控制该病，但不合理的免疫程序导致免疫失败的情况时有发生。目前，为有效防治IBV的发生，国内多将弱毒疫苗滴鼻和灭活疫苗注射结合起来使用。如在种鸡和蛋鸡开产前，接种鸡传染性支气管炎油乳剂灭活苗可使整个产蛋期都获得抗体保护，同时在产蛋期每间隔8–10周接种弱毒疫苗进行局部加强免疫，对鸡传染性支气管炎的发生有较好的预防作用。
使用活疫苗时要注意疫苗在常温坏境中毒力下降快，疫苗稀释后必须在30 min内滴完[103]。活疫苗免疫最好采用滴鼻或点眼的免疫方法，有利于局部抗体的产生。有研究指出，用Ma5+IBV变异株组合疫苗免疫，能有效保护QX株对鸡群的感染[60]。本实验室设置不同免疫程序对SPF鸡进行免疫，结果表明相较于单独H120二免、单独IBV变异株二免的免疫程序，使用IBV变异株/H120二价活疫苗免疫SPF鸡，攻毒后内脏和气管中病毒平均拷贝数最低，泄殖腔拭子拷贝数较低，其总拷贝数最低，保护效果最好。因此，不同基因型IBV活疫苗组合使用可以显著提高对鸡只的免疫效果。Karimi等设置两种免疫程序，第1天和第14天(滴眼)分别接种H120和793/B疫苗，第1天和第14天分别接种H120+793/B (滴眼)和793/B疫苗，结果表明对1日龄鸡使用793/B型IBV疫苗对QX基因型的保护作用增强[104]。
此外，IBV灭活疫苗因免疫后引起机体体液免疫反应低下，攻毒保护效果不佳，一般不单独使用。本实验室在研究灭活疫苗的免疫效果与抗原量的相关性时，采用超速离心浓缩病毒以制备不同抗原含量的IBV灭活疫苗免疫SPF鸡，发现攻毒保护率和抗体滴度与抗原量呈正相关。因此，在适当程度下增大灭活疫苗的使用量可提高保护效果。
总而言之，疫苗免疫应严格按照免疫程序，同时建议采用不同基因型疫苗株组合免疫，以使疫苗免疫达到最佳效果。此外，我们发现增加灭活疫苗使用量可提高免疫保护效果。
7 IBV综合防控措施传染性支气管炎为病毒性疾病，发生后无特效药物治疗，采取综合防制措施对于减少或消除IB的发生十分重要。养殖场应适时接种疫苗，免疫接种前制定详细的免疫计划，应严格按照最合适的免疫程序进行免疫，并长期对鸡群进行IBV监测。IBV的防控更重要的是从源头上阻断传染源，坚持全进全出的饲养模式；健全生物安全管理体系；改善饲养环境，注意控制鸡舍内温度、湿度，注意通风换气，及时清理鸡舍内的粪便、废料等，防止有害气体浓度过大刺激呼吸道；供给营养丰富均衡的饲料，并在日粮中适当增加维生素、矿物质和其他营养物质的含量，以提高机体对疾病的抵御能力；建立健全鸡场的卫生消毒制度，定期对鸡场、鸡舍、鸡笼、器具等进行消毒并且带鸡消毒。对发病鸡群注意保暖、通风换气、带鸡消毒、适当增加多维用量、适度使用抗生素控制继发感染等可有效减少发病鸡死亡。
鸡群发生IBV感染后国外往往不进行治疗，但是，因为中药能够调节、促进机体的免疫功能，具有非特异性抗病原微生物作用，残毒较低或无残毒，不易产生抗药性，且中药治疗成本较低，临床治疗效果较好，因此我国的兽医工作者运用中兽医理论结合现代疫病疗法，对中药防治鸡传染性支气管炎进行了大量的研究工作。赵玉玲采用由荆芥、防风、薄荷、羌活、独活、柴胡、前胡、甘草、桔梗、川芎、枳壳、茯苓等组成的荆防败毒散对自然发生传染性支气管炎的病鸡进行治疗，高剂量组用药48 h后，病情能得到有效控制，治疗5 d后鸡群康复，治愈率达93%[105]。王萌等于IBV症状出现24 h后，治疗组连续5 d给予由板蓝根、大青叶、黄芩、连翘、鱼腥草等11味中药制成的水煎液，实验结果表明，随药物剂量的增大，可诱导IFNα和IFNβ持续产生，降低发病率，提高治愈率[106]。杨明凡等应用由黄芩、连翘、金银花、板蓝根、玄参、大青叶等组成的复方中药制剂防治鸡传染性支气管炎，采用攻毒前5 d在饲料中添加中药复方制剂和攻强毒后2 d开始在饲料中添加该复方制剂，预防率可达100%，治愈率达93.3%[107]。此外，给发病鸡口服中药“肾肿消”，治愈率高达96%，并且口服黄芪、红花、板蓝根等中药能够有效预防和治疗T株[108]。
在我国，中药被广泛地应用于鸡肾型传染性支气管炎的治疗。此外，国内也常将中药治疗结合常规西医治疗以起到标本兼治的效果，可以有效减少养鸡业的损失。
8 结语禽传染性支气管炎病毒血清型众多、流行时间长，其不同基因型毒株同时存在的情况下，新的变异株不断出现，为该病的防控带来了严峻挑战，对该病的防控将是一场持久战。加强流行病学监测、了解病毒流行规律是控制该病的基础。采用2种不同血清型弱毒活疫苗组合免疫可以增加免疫保护谱，对多种流行毒株具有保护作用，但同时要考虑疫苗株重组的风险。在加强生物安全措施的前提下，采用科学的免疫程序可以有效控制传染性支气管炎的流行，减少经济损失。
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