2019, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 崔治中, 苏帅, 罗俊, 钱琨, 庄国庆, 孙爱军, 滕蔓
- CUI Zhi-Zhong, SU Shuai, LUO Jun, QIAN Kun, ZHUANG Guo-Qing, SUN Ai-Jun, TENG Man
- 鸡马立克病毒的研究进展
- Progress in Marek's disease virus
- 微生物学通报, 2019, 46(7): 1812-1826
- Microbiology China, 2019, 46(7): 1812-1826
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190053
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文章历史
- 收稿日期: 2019-01-18
- 接受日期: 2019-05-20
- 网络首发日期: 2019-05-29
2. 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室 农业部动物免疫学重点实验室 河南省动物免疫学重点实验室 河南 郑州 450002;
3. 扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室 江苏 扬州 225009;
4. 河南农业大学牧医工程学院 河南 郑州 450002;
5. 河南科技大学动物科技学院 动物疫病与公共卫生重点实验室 河南 洛阳 471003
2. Key Laboratory of Animal Immunology, Ministry of Agriculture, Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou, Henan 450002, China;
3. Key Laboratory for Avian Preventive Medicine, Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009, China;
4. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan 450002, China;
5. Key Laboratory of Animal Disease and Public Safety, College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471003, China
马立克病毒(Marek’s disease virus，MDV)属于疱疹病毒科。根据病毒的血清学反应，将MDV分为3个血清型MDV1、MDV2和MDV3。其中MDV1是指具有不同致病性(如致肿瘤、免疫抑制、翅腿麻痹及死亡等)的野毒株。MDV2代表一些从临床健康鸡分离到的非致病性病毒，其代表株为SB1。MDV3则是从火鸡分离到的非致病性病毒，又称火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of tuvkeys，HVT)，其代表株为FC126。根据基因组结构，这三类病毒属于该病毒属的3个种，即Gallid herpesvirus 2 (MDV1)、Gallid herpesvirus 3 (MDV2)、Meleagrid herpesvirus 1 (MDV3)。致病性MDV野毒株的致病性强弱差别很大，从弱到强分为弱毒(mMDV)、强毒(vMDV)、超强毒(vvMDV)和特超强毒(vv+MDV)。大多数vvMDV或vv+MDV在给7日龄左右SPF鸡人工接种后，可在接种后90 d内诱发90%甚至100%的死亡率，有一定比例的鸡在1-2个月内急性死亡，而在6-8周及以后死亡的鸡，大多数可在不同内脏出现大小不一的点状或块状肿瘤；而且在CVI988/Rispens疫苗免疫鸡，用vv+MDV攻毒后，仍有20%-30%发病死亡率[1]。
与其它疱疹病毒相比，MDV最显著的特性是细胞结合性，即在细胞培养上不产生游离于细胞培养液中有感染性的病毒粒子(特别是MDV1)。在感染后不同时期的病鸡体内，除羽毛囊上皮细胞外，其它任何脏器或体液中都分离不到游离病毒，病毒严格存在于活细胞内。只有感染MDV的羽毛囊上皮细胞能产生游离病毒，在上皮细胞死亡后仍然存有感染性的病毒粒子。
随着医学疱疹病毒及其它病毒分子生物学的研究进展，在过去40年中对MDV的分子生物学研究也日趋深入。
1 MDV基因组早期研究概述虽然早在1971年就已用核酸生物物理和生物化学方法确定了MDV的基因组是长度约为160-180 kb的线性双股DNA，但由于基因组太长，直到1980年才研究清楚MDV基因组的基本结构。通过分子杂交技术分析数个限制性内切酶片段间的相互同源性关系，阐明了MDV基因组是由6个基本片段组成的，即一个长独特片段(Unique long，UL)和一个短独特片段(Unique short，US)，UL两侧的长末端重复序列(Terminal repeat long，TRL)和长内部重复序列(Internal repeat long，IRL)，US两侧的短末端重复序列(Terminal repeat short，TRS)和短内部重复序列(Internal repeat short，IRS)。正是通过不同疱疹病毒基因组结构的比较，才将MDV重新定位为α疱疹病毒[1]。
在随后的十多年里，通过与其它医学疱疹病毒，特别是单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)相关基因的同源性比较鉴定出了几十个MDV基因，包括一部分结构基因和功能基因，如囊膜糖蛋白gB、gC、gD、gE、gI、gK、gL、gM等就用与HSV类似的命名，还有其它一些基因也与HSV类似，分别以基因组片段UL或US加编号(如UL1、US4)或用位于长独特片段、短独特片段中的阅读框架加编号(如LORF1、SORF4)或用细胞内蛋白(Intracellular protein，ICP)加编号(如ICP4)来命名。同时，也发现和鉴定出7个MDV1特异性的基因，如肿瘤基因meq、pp24/pp38磷蛋白基因、1.8kb基因家族、潜在感染相关转录子基因(Latency associated transcripts，LATs)、病毒端粒酶RNA基因(vTR)、病毒脂酶(vLP)和IL8基因(vIL8)。其中pp24/pp38基因是最早发现的MDV特有基因[2]，截至目前还没有从其它病毒甚至其它任何生物体发现类似的基因，除了敲除后影响病毒在细胞培养上的复制速度外，其真正的生物学功能尚不清楚。只是已有研究证明pp24/pp38所形成的异二聚体蛋白可与pp38基因与1.8 kb RNA基因之间的双向启动子相结合显示增强转录的作用[3]。vTR、vLP和vIL8 3个基因实际上都是鸡染色体基因中存在的类似基因，所以在基因的缩写前都带有一个小写“v”以表示病毒基因。
在MDV的基因中最重要也是研究最深入的独特基因是与致肿瘤相关的meq基因，在基因组上该基因有2个拷贝。meq基因中有一个亮氨酸拉链结构(Leucine zipper)，即每7个氨基酸就有一个亮氨酸，这是蛋白质中的一种结构基元(Motif)，这种结构与转录增强子活性相关[4]。细胞内Meq蛋白多是以二聚体的形式存在。meq基因可编码339 aa组成的蛋白质，它的亮氨酸拉链结构类似于当时已知的jun/fos肿瘤基因家族的亮氨酸拉链功能区。此外，还有一个类似于WT-1肿瘤抑制因子基因的多脯氨酸重复区。许多实验，特别是meq基因敲除后的强毒不再具有致肿瘤作用的实验都证明了该基因对MDV致肿瘤发挥关键的作用[5]。
由于MDV基因组很大，且早期DNA人工测序效率不高，第一个MDV全基因组序列直到20世纪末才真正完成[6]。这是以GA株vMDV为对象完成的，该病毒全基因长174 kb，全基因组测序结果也进一步证明了早期用内切酶分析法确定的MDV基因组结构中的6个基本片段。不久后vvMDV Md5株的全基因组也发表了，其比GA株略大，长约178 kb。近几年来，由于细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)克隆技术的应用和全自动DNA测序技术的发展，更多MDV毒株的全基因组完成了测序。
2 MDV基因组感染性克隆的构建及其应用进展虽然早在20世纪80年代就已成功构建了一些基因组较小病毒的感染性克隆，但由于MDV基因组很大，将近180 kb，无法用普通的质粒如pUC18系列建立相应的感染性克隆。直到21世纪初，科学家才有可能逐渐利用粘粒(Cosmid)或BAC等系统构建不同毒力MDV毒株的感染性克隆。这一技术的成功显著推动了MDV全基因组测序、基因功能以及基因工程疫苗等相关研究的进展。
2.1 以粘粒为载体系统的MDV感染性克隆的构建及相关基因功能研究粘粒是由质粒pBR322和λ噬菌体的cos粘性末端构建而成，大小为4.6 kb，但它容量为29-45 kb，即插入如此大小的外源基因仍能在相应的宿主菌中复制。Reddy等[7]将MDV基因组分成相互重叠的5段，克隆进5个独立的重组粘粒中，用这5个重组粘粒DNA同时转染鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)，成功获得Md5株MDV的感染性克隆；他们又进一步构建了敲除pp38基因的重组病毒Md5∆pp38，用于在细胞和鸡体内研究pp38基因与MDV生物学活性的关系；研究证明pp38与淋巴细胞中早期溶细胞感染有关，但不介导肿瘤的形成。Lupiani等[5]利用该重组粘粒系统构建了meq基因缺失株Md5∆meq，证实meq基因并非病毒复制的必需基因，但是对于MDV的潜伏感染和细胞转化活性具有一定的作用。Lucy等进一步研究发现meq基因缺失株MDV在接种SPF鸡后不再诱发肿瘤，这直接证明了meq基因的致肿瘤作用；而且接种了Md5∆meq的鸡能够有效抵抗vvMDV乃至vv+MDV攻毒的致病作用，为后续MDV基因工程疫苗的研究奠定基础[8-9]。
由于用重组粘粒构建MDV感染性克隆是用带有MDV基因组不同片段的多个重组粘粒转染CEF而得到的克隆化重组病毒，不仅构建技术的重复性较差，而且多个重组粘粒在转染细胞形成感染性MDV全基因组时在细胞培养上可能有多个细胞内形成不同的感染性病毒粒子。此外，在多个重组粘粒相互重组形成全基因组的过程中所形成的不同感染性病毒基因组分支不一定完全相同，这会影响此后进一步研究的稳定性。因此，随着BAC克隆技术的推广，粘粒逐渐被取代。
2.2 以BAC为载体系统的MDV感染性克隆的构建及相关基因功能研究BAC系统是以F质粒(F-plasmid)为基础构建而成的细菌染色体克隆载体，大小为7.2 kb，可插入并有效携带大小达到150-300 kb的外源基因。2000年，Schumacher等利用BAC系统首次成功构建了含有无致病力MDV全基因组的感染性克隆，随后利用同源重组技术构建了缺失gB基因的重组MDV，并对gB基因功能进行了初步研究[10]。此后，BAC系统广泛应用于疫苗株CVI988/Rispens[11]、HVT[12]、814[13]、SB1[14]以及不同毒力MDV毒株感染性BAC克隆的构建[15-18]。2007年，研究者利用BAC系统构建了超强毒株RB1B的感染性克隆，证实UL13基因是MDV横向传播的必需基因，并且通过全基因组的测序比较，推测MDV是病毒复合体[19-20]。随后，在2011年，Spatz等构建了从欧洲分离的MDV超强毒C12/130的BAC感染性克隆，在不同的感染性克隆中，pC12/130-10拯救的病毒呈现超强毒力；pC12/130-15拯救的病毒呈现弱毒力，通过全基因组测序发现两株感染性克隆基因存在差异，证明了所分离到的超强毒C12/130培养物是具有不同致病性MDV的病毒复合体，但是并没有发现造成两种MDV毒力差别的直接相关基因[21]。2009年，Sun等同样利用BAC系统构建了第一株MDV与REV自然重组病毒GX0101的感染性克隆[16]，并进一步构建了其REV-LTR缺失株GX0101∆LTR，证实REV-LTR的插入能够增强MDV的横向传播能力，这是GX0101在鸡群中从比例极低的状态不断演化成流行毒株的竞争优势。我们实验室在GX0101感染性克隆的基础上敲除掉meq基因，进一步证实meq基因不仅是MDV致肿瘤的主要原因，而且与MDV诱发的免疫抑制以及MDV感染后CD8+ T淋巴细胞数量的下调密切相关[22]。基于GX0101的BAC克隆，Su等在国内首次利用高通量测序技术完成了GX0101的全基因组测序及分析，解析了其基因组结构特性；构建了其meq基因缺失株SC9-1，证实SC9-1完全丧失致肿瘤性，并且能够诱导比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果[23-24]。Lupiani等将REV-LTR插入CVI988/Rispens BAC感染性克隆能够显著增强病毒的复制能力和免疫保护效果[25]。
2.3 BAC感染性克隆技术显著推进了不同毒株MDV全基因组测序截至目前，基于BAC克隆已经完成了7株MDV的全基因组测序，涉及弱毒(CVI988/Rispens)、超强毒(RB1B，GX0101)以及特超强毒(584A)不同毒力的血清I型MDV[20, 23, 26-27]。对于不同毒株基因组序列的差异分析，有助于发现与MDV致病性或其它生物学活性相关的分子基础，并将为今后MDV致病基因研究提供大量有用的信息。
2.4 MDV感染性克隆技术对其它基因功能研究的进展MDV的致病机理一直是研究的热点。近年来，利用MDV BAC感染性克隆，越来越多的基因功能被确定，相关的致病机理也逐渐被揭示。pp14基因是MDV的神经毒性因子，虽然与病毒的致病性以及复制无关，但是能够增强病毒的神经毒力[28]。证实了MDV编码的核糖核酸还原酶基因是病毒复制的必需基因，以及ORF012编码的新型核磷蛋白是病毒复制的必需蛋白[29-30]。对MDV UL5基因的单核苷酸(I682R)点突变后，病毒的致病性以及复制能力减弱，并且能诱导一定的免疫保护[31-32]。利用BAC感染性克隆构建的MDV VP22突变株表明VP22基因诱导DNA损伤进而影响MD肿瘤的形成[33]。最新的研究表明，通过优化MDV BAC感染克隆UL54、UL49、UL30基因的密码子构建的突变株，可以延缓MD的致病进程以及死亡率[34]。ICP27不是MDV复制和致肿瘤的必需基因，但却是横向传播的必需基因[35]。MDV VP23与IRF7相互作用，阻断其与TBK1的结合，从而抑制IRF7的激活，进而抑制DNA传感途径[36]。同时，利用不同MDV突变株感染易感鸡群，通过分析宿主基因表达的差异，有助于从宿主角度进一步揭示MDV的致病机理[37]。
CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9系统作为基因编辑技术研究的热点，在MDV基因功能研究中的应用已经引起人们的关注。利用CRISPR/Cas9系统成功构建了CVI988/Rispens的pp38、meq基因缺失株，表明CRISPR/Cas9系统可以应用到不同血清型的MDV毒株以及MDV1转化的细胞系中，以研究MDV基因在肿瘤细胞中的作用以及MDV的分子致病机制[38]。
随着现代分子生物学技术的发展和应用，MDV感染性克隆技术在基因组结构与功能、病毒与宿主之间的相互作用以及基因工程疫苗等方面的研究更趋成熟，它使MDV庞大的基因组能够稳定地保存、增殖和突变，并且操作简便而安全。
3 MDV的蛋白质组学蛋白质组学(Proteomics)以基因组编码的全部蛋白质为研究对象，从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，从而深入认识有机体的各种生理和病理过程。近年来细菌或酵母双杂交系统、二维凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)、差异凝胶电泳(Differential in-gel electrophoresis，DIGE)、同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)、蛋白质芯片(Protein chip)技术等诸多蛋白质组学技术研究手段纷纷应用于MD的研究，使得我们能够通过MDV蛋白质组学水平阐明细胞游离病毒形成机制、病毒致病及致肿瘤的机理，为MD的控制以及新型疫苗的研发提供新的思路。
3.1 应用细菌或酵母双杂交系统对MDV蛋白组学的研究早期，Niikura等利用大肠杆菌双杂交系统筛选MDV和鸡体相互作用的蛋白质，其中鉴定到鸡生长激素(Growth hormone，GH)、LY6E、MHCⅡ分子β微球蛋白和CD74分子、生长相关翻译控制的肿瘤蛋白(Growth related translationally controlled tumor protein，TPT1)、补体成分C1q结合蛋白(C1QBP)、视网膜母细胞瘤结合蛋白4 (Retinoblastoma-binding protein 4，RBBP4)和烯醇化酶(α-Enolase，ENO1)等几种鸡源蛋白与多种MDV编码蛋白相互作用[39]，然而这些蛋白的相互作用仍有待体内实验来证实。Niikura等2004年的研究验证了他们同一研究课题组之前的两个发现：一是利用酵母双杂交试验鉴定鸡生长激素GH和MDV编码的SORF2蛋白之间有相互作用[40]；二是利用大肠杆菌双杂交试验显示鸡LY6E和MDV编码的US10蛋白之间的相互作用[41]。除了体外相互作用，研究还发现GH和SORF2蛋白在MDV感染的细胞中共表达；MHC B2/B15单倍型鸡中GH基因的多态性与MDV转化病变组织的数量相关更加突出了这两种蛋白相互作用的重要性[40]。类似地，LY6E基因多态性与MDV感染鸡的存活时间和腺胃肿瘤发病率相关[41]。这些发现初步显示了蛋白组学方法在解析MD不同遗传抗性品系鸡机制中的作用。
3.2 应用非凝胶的“鸟枪”蛋白质组学对MDV的分析研究基于非凝胶的“鸟枪”蛋白质组学分析是研究MDV与宿主相互作用和MDV转化细胞生理学的另一种方法。Buza等2007年报道了利用差异去污剂分馏(Differential detergent fractionation，DDF)结合二维液相色谱电喷雾串联质谱(2D-LC-ESI-MS/MS)方法综合分析MDV转化细胞系UA-01的蛋白质组，鉴定了3 870种来自细胞的蛋白多肽和21种MDV蛋白[42]。生物信息学模型揭示了与UA-01癌症细胞表型一致的几个主要生物学过程。此外，该研究还鉴定了整合素和细胞外信号调节激酶/促分裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)途径是MDV转化细胞中最主要的活化途径，提示这些蛋白分子在肿瘤转移中的重要性[42]。同一课题组2008年利用相同的技术手段全面分析比较了静息、超抗原活化和MDV转化的3种CD4+ T细胞之间的蛋白质组[43]。与静息和活化的T细胞相比，MDV转化细胞特有的途径显示出强烈的可溶性因子介导的反应，包括细胞因子、生长因子和激素的表达。超抗原活化和MDV转化的CD4+ T细胞糖异生途径的缺失表明在这些细胞中可能诱导能量产生替代途径，以满足细胞的能量需求。
3.3 强阳离子交换色谱和微毛细管反相液相色谱-串联质谱的应用Ramaroson等2008年利用强阳离子交换色谱和微毛细管反相液相色谱-串联质谱分析了Md5 MDV感染CEF 5 d后的蛋白质表达。在这种定性比较中，分别从对照组和MDV感染组的CEF中鉴定到1 460和1 676个非磷酸化蛋白质，其中两组共表达的蛋白质有1 009种[44]。该研究还鉴定了342和483磷酸化的蛋白质多肽，分别来自对照组和MDV感染组的样品，其中41种蛋白质是共同表达的。对于MDV编码蛋白而言，CEF感染5 d后鉴定了86种MDV蛋白的表达[45]。虽然这些结果只是定性比较，但这种方法显示该技术适用于定量分析，并且分析包含了那些具有极端等电点的蛋白质，而这些蛋白质可能被基于凝胶的比较蛋白质组学所排除。
3.4 二维蛋白电泳和差异凝胶电泳在MDV蛋白组学研究上的应用近年来，有相关研究报道了利用二维蛋白电泳(2-DE)和差异表达蛋白质谱鉴定研究MDV发病不同阶段宿主体内蛋白的动态表达情况[46-48]。在这些研究中，Thanthrige-Don等解析了鸡脾脏蛋白质组中517±84个蛋白质点，其中61个蛋白斑点质谱鉴定为48种蛋白质是MDV感染组和对照组鸡之间差异表达的蛋白。基于生物信息学分析显示MDV感染影响细胞各种生物学过程，包括抗原加工和呈递、泛素蛋白酶体蛋白降解、细胞骨架形成、细胞代谢、信号转导和翻译调节等。MDV感染的法氏囊中鉴定的24个差异蛋白主要与肿瘤生物学、蛋白折叠、信号转导、免疫、细胞增殖和凋亡有关，其中肿瘤相关蛋白病毒感染后第14天和第21天显著上调[46]。Chen等采集了MDV超强毒RB1B株感染后21 d的羽髓样本，二维电泳图谱以及差异蛋白质谱分析发现攻毒组和对照组之间表达差异大于两倍的蛋白点有41个，其中攻毒组表达上调的蛋白点25个，下调的蛋白点7个，新出现的蛋白点有9个；这些蛋白涉及到物质代谢、细胞骨架成分、细胞增殖及免疫相关等，差异最明显的蛋白是代谢相关蛋白(40%)和细胞增殖蛋白(25%)[47]。随后，Hu等利用二维电泳和质谱分析技术对RB1B株感染的鸡胸腺蛋白质组进行了动态分析，共鉴定出119个差异表达的蛋白质，这些差异蛋白点主要集中在感染MDV后21、28和35 d；GO注释结果显示这些蛋白涉及包括代谢、免疫、细胞凋亡和死亡、应激以及肿瘤等各个方面，其中有7类蛋白共20个差异蛋白点(包括巨噬细胞游走抑制因子、热休克蛋白90等)与免疫、肿瘤发生、发展和转移等直接相关[48]。Thanthrige-Don等[49]利用差异蛋白质组学方法，分析了MDV强毒株JM-16感染遗传抗性B21品系和易感B19品系鸡脾脏中的差异蛋白表达；鉴定了20种差异表达的蛋白质，包括抗氧化剂分子伴侣，以及参与细胞骨架形成、蛋白质降解、抗原呈递、信号转导、蛋白质翻译和延伸、RNA加工以及细胞增殖，结果提示这些生物过程可能导致鸡对MD的不同遗传抗性。2012年，Chien等利用ERLIC/IMAC/LC-MS/MS分析技术定量分析了不同MDV毒株感染CEF的蛋白质组和磷酸化蛋白质组，分别鉴定到1 002种蛋白和539种磷酸化蛋白与病毒感染相关，其中eIF4E和4E-BP1蛋白值得关注[50]。这些蛋白质组学结果为全面解析MDV致病和致肿瘤机制提供了新的证据。
尽管转录组分析初步揭示了可能涉及病毒发病机制和免疫的重要基因和途径，但是基因转录谱会受到其表达蛋白的反馈调控。此外，转录组分析还存在一些不足，这其中包括基因表达与相应蛋白质表达水平的不一致，以及不能提供关于蛋白质翻译后的修饰(例如磷酸化或乙酰化)信息，这些修饰在病毒致病过程中可能发挥重要的作用。蛋白质组学以其高通量优势为探寻基因功能的奥秘提供了一种新的思路和研究手段[51]。蛋白质组学技术有助于扩展我们对MDV与宿主相互作用的认识，同时为理解病毒发病机制和免疫提供了新的研究思路。未来利用蛋白质组学技术的研究方向重点是发现MDV基因组内新的蛋白，尤其与病毒致病相关的新基因、新蛋白、分析游离病毒粒子的组成和功能、鉴定不同易感鸡品系的保护性抗原或多肽、鉴定病毒与宿主之间的相互作用。
4 MDV基因组编码的有调控作用的RNA 4.1 关于有调控作用的非编码RNA最新研究发现，病毒基因组中也编码很多非编码的RNA基因，参与调控病毒复制、感染与致病过程。MicroRNA (miRNA)是一类长度约为21-24 nt的非编码小分子RNA，在转录后水平参与调控一系列重要的生命过程，包括胚胎发育、细胞分化、凋亡、造血、疾病和肿瘤发生等。miRNA已被广泛报道于人类、动物、植物以及大的DNA病毒基因组中。目前已发现鉴定的病毒miRNA有数百种，绝大部分由疱疹病毒编码，也有一些属于多瘤病毒属和逆转录病毒属[52-53]。目前，这些病毒miRNA中的绝大部分已经得到实验鉴定，但绝大多数miRNA的功能尚不清楚。
4.2 不同血清型编码MDV的miRNAMDV1编码的miRNA首次报道于2006年，随后在MDV2和HVT基因组中相继报道[54-58]。MDV1、MDV2和HVT均编码miRNA，虽然这些miRNA在基因序列上没有同源性，但它们的基因座位在病毒基因组中具有高度保守性。同一病毒编码的大部分miRNA都位于MDV反转重复序列区域(TRL/IRL)，并形成典型的miRNA基因簇[59]。MDV1共编码14个miRNA前体基因，加工生成的26个成熟体miRNA在MDV1的TR/IR中形成3个miRNA基因簇：分别被命名为Meq基因簇(包括miR-M2、miR-M3、miR-M4、miR-M5、miR-M9和miR-M12)、Mid基因簇(miR-M1、miR-M11和miR-M31)和LAT基因簇(miR-M6、miR-M7、miR-M8、miR-M10和miR-M13)[54, 56]。MDV2共编码18个miRNA前体基因，加工生成36个成熟miRNA分子，其中绝大部分都位于病毒基因组TRL/IRL中聚集形成一个很大的基因簇，仅有miR-M17单独位于IRS/TRS中ICP4的ORF中[55]。MDV3共编码17个miRNA前体基因，加工生成28个成熟miRNA分子，绝大部分miRNA同样都位于TRL/IRL中，基因组织形式与MDV2 miRNA非常相似，形成一个大的miRNA基因簇[57-58]。
4.3 与致病性MDV1相关的miRNA功能由于3种不同血清型MDV中仅有MDV1具有致病及致瘤性，因此MDV1编码的miRNA功能首先成为研究热点。研究发现，在病毒感染的CEF细胞和T淋巴瘤细胞系MSB-1以及MD肿瘤组织中，均存在MDV1 miRNA的大量表达。但MSB-1和MD肿瘤组织中miRNA的表达水平均高于MDV1感染的CEF细胞样品[56]。不同毒力MDV1编码的miRNA表达水平量也存在差异，如vv+MDV毒株615K诱导的脾脏肿瘤中Meq基因簇miRNA的表达水平比vvMDV毒株RB1B诱导的脾脏肿瘤中的表达高数倍，而LAT基因簇miRNA的表达水平则未发现明显差异[60]，预示Meq基因簇的miRNA在MDV的致瘤机制方面可能具有更重要的作用。根据vvMDV毒株GX0101感染鸡体内的MDV1 miRNA动态表达谱，可将26个成熟体miRNA分为早期表达和晚期表达两大类，他们具有明显的组织特异性和时空差异性，与MDV1感染、致病及致瘤的进程密切相关[61-62]。
由于miRNA靶基因的发现及鉴定非常困难，目前仅有少数几个MDV1 miRNA的功能有较多的研究报道。为了深入研究这些miRNA的功能，有学者通过建立MDV感染细胞的cDNA文库、结合生物信息学方法对潜在调控的靶基因进行了预测[60]。Meq基因簇编码的病毒miRNA最受关注，尤其是其中的miR-M4-5p在MD肿瘤细胞系及实质肿瘤中被认为是表达丰度最高的miRNA之一。目前miR-M4-5p已被证实是宿主miRNA-155 (miR-155)的同功分子[63]，而后者已被公认是一个原癌基因。利用BAC克隆和Rec E/T重组技术将miR-M4-5p从vMDV毒株pRB1B-5或vvMDV毒株GX0101的病毒基因组中敲除，结果发现基因缺失的RB1B失去转化感染T细胞的能力，致瘤性完全丧失[64]，而GX0101中缺失miR-M4-5p虽然仍具有一定的致病性，但被感染鸡的肿瘤发生率也显著下降[65]，这两项研究充分说明miR-M4-5p虽然不是MDV1致瘤的唯一决定因子，但其与MD肿瘤发生极其相关。进一步研究发现，miR-M4-5p不仅靶向调控MDV1病毒基因UL28和UL32的表达，与病毒的复制和包装有关，还调控众多宿主靶基因如GPM6B、RREB1、c-Myb、MAP3-K7IP2、PU.1、C/EBP及hnRNPAB[66-67]。最新研究发现，通过靶向下调LTBP1的表达，miR-M4-5p还可以抑制TGF-β1的胞外分泌及活化，从而抑制TGF-β信号通路的传递，最终激活宿主原癌基因c-Myc的过表达而促进肿瘤发生[68]。除了miR-M4-5p之外，敲除Meq基因簇内的其它miRNA[69]，发现这些miRNA与MDV1的致病及致瘤也密切相关，其中该基因簇编码的miR-M3-5p可通过靶向抑制TGF-β信号通路关键信号分子SMAD2的表达，进而保护被感染细胞免于凋亡，为病毒的复制和增殖提供生存空间[70]。
Mid基因簇的miR-M31-3p与宿主鸡的gga-miR-221拥有相同的种子序列[60]，可能具有相似的功能。gga-miR-221调控细胞周期的关键抑制因子p27Kip1蛋白的表达，该蛋白的下调表达可促进肿瘤细胞的生长及增殖。将miR-M31-3p从GX0101的基因组中敲除可以降低病毒的致病性和致瘤率[71]，很好地佐证了miR-M31-3p可能参与调控MD肿瘤发生的推论。然而，当基因缺失miR-M11-5p或整个Mid基因簇miRNA，GX0101的致病性和致瘤率却会显著增强，预示miR-M11-5p在MD肿瘤发生的过程中可能扮演抑癌因子的角色。
LAT基因簇miRNA位于病毒潜伏感染相关转录本(LATs)的第一个LAT内含子中，与LATs具有相同的转录起始点，随着LATs的转录、剪切、加工生成miRNA成熟体分子。LATs在病毒潜伏感染的后期、肿瘤转化细胞系及实体肿瘤中大量表达。从转录方向看，LAT基因簇miRNA可能是ICP4的反义RNA。已有研究发现该基因簇的miR-M7-5p靶向调控ICP4和ICP27的蛋白表达，与MDV潜伏感染的建立或维持有关[72]。
虽然在病毒miRNA调控MDV感染、致病及致癌的调控机制方面已经取得了一些重要的研究进展，但同一基因簇miRNA的功能是否相似或不同，不同基因簇miRNA之间在潜伏感染、诱发肿瘤或抑制癌变之间的平衡与调控，都有待于进一步深入研究[73]。最新研究发现，MDV基因组中还编码长链非编码RNA[74]，而且宿主细胞的外泌体也可以转运病毒非编码RNA[75]，但目前对他们的功能还所知甚少。此外，宿主miRNA也参与调控MDV的感染及致病，它们与病毒miRNA共同调控宿主的网络及机制仍有待揭示。最近，简便高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术正开始应用于家禽疱疹病毒的基因功能研究[38]，尤其是我们对MDV1编码miRNA的基因编辑已取得成功，这将有利于促进对非编码RNA调控MDV致病或致癌的分子机制研究。
5 MDV基因工程疫苗研究进展简介MD是第一个能用疫苗有效预防控制的病毒性肿瘤病，实际上，在过去近50年中，全球养鸡业从应用疫苗预防MD的生产实践中获得了极大的经济效益。3个血清型的MDV都可用做MD疫苗，但以与致病性MDV同属MDV1的CVI988/RISPENS株的效果最好。虽然突破CVI988/Rispens免疫保护作用的现场投诉也时而发生，但最近20多年来，CVI988仍一直是被全球养鸡业公认预防MD最好的疫苗。CVI988是20世纪70年代初从健康鸡分离到的一株弱毒MDV1，经在CEF细胞上连续传代进一步致弱后用作疫苗。为了研发比CVI988保护力更好的疫苗，美国农业部禽病和肿瘤学研究所前所长、美国科学院院士Witter曾从20世纪80年代开始就尝试MDV1的不同毒株在CEF细胞上连续传代致弱的病毒对MD的保护性免疫作用，在近20年的研究中，没有发现任何一株病毒能提供比CVI988/Rispens更好的保护性免疫，他认为除了用基因工程方法研发新的MD疫苗外，用常规病毒学的方法已不可能得到比CVI988/Rispens更好的疫苗了。因此，从20世纪末开始，科学家们开始尝试用基因工程的方法研发新的MD疫苗，包括将MDV不同野毒株敲除不同潜在的致病基因后用作疫苗。
5.1 以禽痘病毒为载体表达MDV基因的基因工程疫苗20世纪90年代早期研究者们开始利用禽痘病毒(Fowl pox virus，FPV)作为载体表达MDV编码的多种蛋白，并比较了它们的免疫效果。例如，重组的FPV表达MDV1 gB可以100%保护SPF鸡，但对母源抗体阳性鸡只能保护23%强毒MDV感染鸡。重组FPV表达MDV1编码的gC、gD、UL47或者UL48对于母源抗体阳性鸡没有保护力。另外，表达MDV1编码的gC、gD、UL47或者UL48重组FPV对表达gB的重组FPV没有增强免疫效力的作用。但是，用FPV-gB和HVT作为多价苗免疫时具有增效作用。相比于FPV表达单个基因的免疫效果，FPV表达gB、gE和gI或者gB、gE、gI和UL32 (分别是72%和70%)时具有显著的免疫增效作用[76]。尽管这些疫苗具有显著的免疫保护性能，但是由于鸡体存在FPV抗体抑制疫苗的免疫效果，因而没有商品化的价值，而且这些疫苗的免疫效果也不比CVI988/Rispens好。
5.2 通过敲除特定致病基因构建MDV基因工程疫苗候选株近些年来，多个实验室利用感染性克隆技术构建了敲除某个特定基因的重组病毒，这不仅可用于识别和研究参与MDV复制、免疫抑制、致瘤和致病的基因及其功能，也可以通过鸡体试验分别判定这些基因缺失病毒做为疫苗候选株的潜在可能性。
5.2.1 pp38基因的敲除MDV编码38 kD的磷酸化蛋白，通常在早期感染的细胞和淋巴瘤细胞系及肿瘤细胞中表达。敲除vvMDV Md5毒株的pp38基因实验表明，pp38是MDV早期溶细胞感染复制相关的基因，但其不影响MDV在羽毛嚢上皮细胞中的感染；虽然pp38基因缺失株MDV的毒力显著降低，但是仍能转化T细胞生成肿瘤，所以不是一个理想的疫苗候选株[7]。
5.2.2 vIL8基因的敲除MDV编码一个类化学因子vIL8，与细胞编码的CXC化学因子如白介素-8 (IL-8)高度同源；从MDV基因组中敲除vIL8会导致病毒毒力降低，研究表明vIL8与病毒早期溶细胞感染相关，但对于潜伏期感染没有影响[77]。免疫保护性实验表明vIL8敲除毒株对于MDV母源抗体阳性鸡抵抗特超强毒株感染具有中等保护作用，但vIL8敲除毒株仍然保留致病作用，不能作为商品化疫苗使用[78]。
5.2.3 vTR基因的敲除端粒酶主要是由反转录酶和一个RNA亚单位(端粒酶RNA，TR)组成的核蛋白。MDV基因组包含两个序列完全一样的病毒编码的RNA亚单位，从病毒基因组中敲除vTR基因可使病毒的致瘤性降低，但不影响病毒在体内的早期复制过程。研究表明MDV vTR模板链序列的突变可能使病毒完全失去致瘤性，突变病毒具有与CVI988一样的抵抗超强毒RB1B株的免疫保护力[79]，但其后续的研究进展尚不清楚。
5.2.4 meq基因的敲除利用粘粒和BAC技术，分别以超强毒株和特超强毒株为对象构建meq敲除毒株，研究表明meq敲除毒株完全失去致瘤性，但仍然具有早期溶细胞感染能力[5, 18]，有可能作为疫苗的候选株，并已证明它们可提供较好的保护免疫。
5.3 敲除meq基因的Md5Δmeq和SC9-1具有比CVI988/Rispens更好的免疫效果动物实验表明，利用粘粒技术将vvMDV Md5敲除meq基因后构建的基因工程疫苗候选毒株Md5Δmeq，在实验室条件下对有无母源抗体的鸡都能诱发比CVI988/Rispens疫苗更好的保护性免疫效果，不仅对超强毒株Md5的攻毒如此，对特超强毒648A株的攻毒也是如此[8]。但是，Md5Δmeq在SPF鸡可诱发中枢免疫器官显著萎缩及增重减慢，这是阻碍其成为商品化疫苗候选株的一个重要的生物安全问题，而该毒株在CEF连续传40代致弱后虽不会再引起免疫器官萎缩，但对MDV母源抗体阳性鸡的免疫保护力降低[6, 80]，使其很难进一步商品化。
我们实验室在GX0101株BAC克隆的基础上[16]构建了敲除meq基因的重组病毒GX0101Δmeq；再将GX0101Δmeq病毒中的卡那霉素抗性基因敲除，构建了符合我国转基因生物安全标准的基因工程疫苗候选株SC9-1 (GX0101ΔmeqΔkal)，在SPF鸡的实验表明GX0101Δmeq和SC9-1都能对超强毒Md5攻毒表现出比CVI988/Rispens更好的保护性免疫效果[24]；而且，在经CEF连续传若干代后，SC9-1不仅不会诱发中枢免疫器官萎缩，而且对其它灭活疫苗免疫后的抗体反应不会产生不良影响。此外，更严格的生物安全试验表明，该株疫苗即使利用鸡胚免疫接种也不会诱发免疫抑制。SC9-1疫苗不仅对SPF鸡表现良好的保护性免疫，对其它不同品种的规模化饲养鸡也同样显示出更好的免疫效果[24]。该株疫苗已获得了农业部农业转基因生物安全证书，并且通过了农业部兽医生物制品审评委员会的临床试验，获得了新兽药证书。
5.4 人工插入REV-LTR序列的CVI988/Rispens在MDV基因组插入反转录病毒启动子/增强子序列会引起病毒致弱。例如RM1是REV-LTR插入致病株JM/102W而致弱的毒株。RM1与CVI988/Rispens相比，其早期溶细胞复制得到了增强，在抵抗特超强毒株感染时具有很好的免疫保护效果。但是，RM1也引起免疫器官萎缩。为了验证LTR的功能，利用BAC将LTR插入超强MDV基因组使病毒致弱，再经体外细胞传代使得病毒完全失去致病性，但同时免疫保护力降低而不能作为疫苗商品化应用[81]。
Lupiani等利用基因重组技术将RM1中的REV-LTR整合到CVI988/Rispens疫苗株，构建了重组病毒CVRM，与CVI988/Rispens相比增加了体外增殖能力，不引起鸡体免疫器官萎缩且免疫保护力优于CVI988/Rispens[25]。
值得注意的是，SC9-1株MDV的亲本毒GX0101就是在2001年从病鸡分离到的一株带有REV-LTR的天然重组病毒，当将其中的REV-LTR序列敲除后，病毒在感染鸡体内的复制能力和病毒血症水平都显著降低[17]。
5.5 以MDV为疫苗载体表达其它病毒的免疫原性基因早在20世纪80年代，研究者就开始尝试应用HVT做为载体表达新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)和禽流感病毒(Avain influenza virus，AIV)的相关抗原基因。20世纪90年代早期开始用MDV1作为表达IBDV、NDV、AIV和传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)的载体。由于MDV受母源抗体干扰作用较小，而且鸡体一旦感染MDV就终身带毒，可持续产生免疫刺激作用，这显示出MDV作为载体表达其它病毒抗原的潜在优势。其中表达IBDV的VP2重组HVT疫苗已作为商业化疫苗在国内外被广泛应用，而且相对于市场上其它疫苗显示出很强的市场竞争优势，这鼓励了许多疫苗公司和研究机构试图研发用于防控其它病毒病的重组MDV疫苗。
早期认为2个或者更多HVT载体疫苗表达外源基因的混合物可成为控制多种禽病的有效措施，而研究发现同时使用2个重组HVT载体会引起相互干扰，从而降低了免疫保护力，可能是不同重组HVT载体在宿主内的增殖速度不同引起的[82-83]。取而代之的方法是利用一个载体表达多个外源基因，或者将HVT和MDV1、MDV2载体疫苗结合使用表达外源基因。
5.6 利用CRISPR/Cas9技术构建重组MDV疫苗利用BAC进行MDV基因工程疫苗研发的技术和流程已经非常成熟，目前在世界范围内广泛应用。但是，BAC的操作过程繁琐，需要构建穿梭载体、经过几次阳性克隆筛选以及病毒的拯救等，费时且耗力。CRISPR系统是微生物抵抗病毒及外源遗传因素入侵的天然免疫机制，其中2型CRISPR/Cas9系统，包括RNA介导的Cas9核酸内切酶(来源于链脓球菌)、一条单链引导RNA和反式作用RNA共同组成基因编辑器[84]。CRISPR/Cas9在细胞基因组修饰和动物模型构建中取得了重大成功，也被用于几个大的DNA病毒基因组修饰，包括1型HSV、腺病毒、伪狂犬病毒、牛痘、鸭瘟病毒等[85]。Tang等利用CRISPR/Cas9成功地在HVT基因组中插入了IBDV的VP2基因构建成HVT-VP2，重组病毒在CEF上连续传20代次后分析结果显示，插入的VP2 DNA序列随着病毒的增殖没有变化且蛋白表达稳定，而且VP2的插入没有改变病毒的复制特性[85]。这是第一个用CRISPR/Cas9构建HVT重组病毒的报道，与传统的同源重组和BAC技术构建HVT重组病毒相比，CRISPR/Cas9具有成本低廉、操作简便和有效及无外源基因干扰等特点。
6 MDV研究的期待和展望科学研究的动力源自科学家对某些自然现象的兴趣。出于现实，科学家的研究目标和列题也必须从社会的需求出发，对于作为应用学科的预防兽医学更是如此，也就是说研究结果必须对社会有用。大多数研究成果应该能不同程度地用于或服务于生产，如果是基础研究，要考虑到其后续研究的潜在可能性或对今后深入研究的推动作用。通观MDV研究的50多年历史，早期的研究成果多数对疫病的诊断和防控以及深入认识MDV和MD的性质也是有用的。至于近20年MDV的分子生物学研究，其结果多数只是将现代分子生物学的不同阶段发展起来的新技术、新概念在MDV上再重复应用一遍而已，多数只是添了一点所谓科学数据，发表的论文被“引用”，但不是被“应用”。在当前科学研究的对象和领域越来越多，而我们的研究资源和人力精力又总是有限，在考虑对MDV开展进一步研究时要慎重地选择今后的研究目标和方向。
为了提高对MDV基础研究的价值，应该首先考虑研究MDV在病毒，特别是疱疹病毒中显示的特殊生物学性状及其相关基因和基因产物的分子生物学机制。其中最关键的显然是MDV的致肿瘤作用及相关的meq肿瘤基因和表达产物。在过去20年中，虽然在这方面已取得了许多重要的进展，但对其进一步深入研究的潜力还很大，特别是如何应用近10年来发展起来的新技术和新概念综合起来研究。
另一个最值得关注的MDV特性是其细胞结合性，即除了在羽囊上皮中可形成有感染性的细胞游离病毒粒子外，在现有的细胞培养和已检测过的鸡体细胞中都不能形成有感染性的细胞游离MDV1病毒粒子，病毒的传染性有赖于活细胞间的直接接触感染。这是MDV有别于其它疱疹病毒的一大特点，阐明这一特性的分子机制不仅是病毒学领域的基础性研究，而且也具有很高经济价值的应用前景。近几十年来在国内外最广泛使用的CVI988/Rispens疫苗及其它1型疫苗，都是细胞结合疫苗，即必须在液氮中保存，这不仅给生产应用带来很大的不便，也显著增加了疫苗的成本。从20世纪80年代以来，科学家们一直试图解决这个问题，但几乎没有任何进展。我们现在能否尝试把现代基因组学、蛋白组学、调控性小RNA、感染性克隆和CRISPR技术和概念综合应用起来解决这个问题，而不是用某一项新技术或新概念来回答这个问题。一旦解决了这个问题的分子机制，就可以考虑用类似于CRISPR技术来对某些细胞做基因编辑，从而形成能为MDV复制并产生游离病毒的细胞系用于MDV疫苗的大生产。
当然，MDV的基因工程疫苗应该是今后一段时期内最受关注的研究。由于用HVT作为载体表达IBDV VP2基因的基因工程疫苗有效用于预防鸡传染性法氏囊病，在国内外市场取得了巨大成功，激励了许多企业和研究机构纷纷开展同类的研究。但是，因为HVT本身作为MD的疫苗已不能有效地预防控制vvMDV诱发的肿瘤，表达其它病毒抗原的重组HVT就更不能有效预防MD。在应用HVT载体疫苗后，还必须同时使用MDV1疫苗来预防控制对鸡群同样危害性很大的MD，因此必须考虑能否用MDV1疫苗病毒作为载体来表达所感兴趣的其它病毒抗原基因。这样的研究也在一些实验室尝试中。最后必须要意识到，并不是每一个按设计构建好的重组病毒都能用作商业化疫苗的，实际上目前在市场上广泛应用的表达IBDV vp2的重组HVT疫苗也是从众多重组病毒中通过鸡体实验筛选出来的。
还有一个小的仅属于经典病毒学的研究目标是，明确中国鸡群有没有能够突破CVI988/Rispens疫苗的保护性免疫的vv+MDV流行株。虽然早在20世纪90年代，欧美就已报道了vv+MDV的多个野毒株，但中国一直没有真正证实有vv+MDV的流行。虽然这只是一个经典病毒学问题，但必须要用足够数量的动物实验来证明，而不是仅仅根据用过疫苗的鸡群仍发生肿瘤并分离到MDV就能轻易下结论的。
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