猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，为单股环状DNA病毒，病毒无囊膜，呈二十面体对称，直径12 nm–23 nm，是当前已知最小的病毒^[1]。PCV主要分为3种血清型：PCV1、PCV2和PCV3。其中PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)等相关疾病的主要病原。20世纪90年代，PCV2感染作为PMWS病因在加拿大被报道后，美国、法国、英国等多个国家证实有PCV2的存在和流行^[2]。之后疫情不断扩散，我国自2000年首次报道存在PCV2感染以来^[3]，PCV2在国内猪群已普遍存在。猪感染PCV2后免疫功能会受到损害，机体抵抗力降低，更易与其他病症如猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征甚至肠道疾病形成混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失，被视为我国养殖业重大危害之一。

PCV2属单股负链DNA病毒，基因组全长1 766-1 768 bp，ORF1和ORF2是最主要的开放阅读框。ORF1位于正链，为最大的开放阅读框，编码参与病毒复制的蛋白(Rep和Rep’蛋白)。ORF2位于负链，编码核衣壳蛋白(Cap)，诱导宿主免疫反应^[4-5]。ORF2基因易突变，对其进行遗传进化分析可反映PCV2全基因组的进化情况，还能用于基因分型。2018年Bao等对PCV2基因型进行了补充，发现我国存在PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f 6种基因型，各基因型间遗传距离介于0.047-0.172，并指出PCV2a、PCV2b、PCV2d是目前国内流行株的3种主要基因型^[6]。根据近年来国内外报道，PCV2的进化与点突变和基因重组的两种机制有关。这两种机制导致了PCV2遗传多样性的产生，进而推动了病毒的全球迅速传播和PCV2流行株复杂化、多元化的趋势。为了解近几年安徽省地区PCV2的遗传变异情况，本研究对2016-2018年间从安徽发病猪群中检测的8株PCV2毒株，进行全基因组的遗传变异分析，这对分析安徽地区PCV2流行病学及遗传变异趋势具有重要意义，也为PCV2疫病的防控和基因型疫苗的研发奠定基础。

1 材料与方法 1.1 病料来源

病料来源于安徽省多个地市，包括合肥、亳州、淮南、马鞍山等地的各个猪场。采集2016-2018年间疑似PMWS感染发病猪的组织器官，包括淋巴结、脾、肺等。

1.2 主要试剂和仪器

pMD^TM18-T载体、DL2000 DNA Marker，rTaqDNA聚合酶、Solution I购自TaKaRa公司；质粒DNA小量试剂盒购自Axygen公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司。

基因扩增仪，高速离心机购自珠海黑马医学仪器有限公司；恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；凝胶成像系统，美国伯乐公司。

1.3 引物设计与合成

参考GenBank中收录的PCV2 DZ205株(NO. FJ644559)基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计2对引物。引物P1和P2为PCV2检测引物，扩增片段长度为475 bp，P3和P4为PCV2全基因引物。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。P1：5′-GAATTGTACATACATGGTTA-3′；P2：5′-CAAGG CTACCACAGTCAGAA-3′；P3：5′-GTACCTTGTTG GAGAGCGGG-3′；P4：5′-TCACAGCAGCAGTAGACAGGTCA-3′。

1.4 病料DNA提取与检测

取适量采集的淋巴结、脾、肺等组织用研钵充分碾磨，并加入含青霉素和链霉素各1 000 IU/mL的PBS (pH 7.4)匀浆。反复冻融3次，6 000 r/min离心5 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱待用。将制备好的样品按照DNA提取试剂盒使用说明书提取DNA，并以所提取的DNA为模板进行PCR检测。PCR反应体系：rTaq DNA聚合酶Mix 10 μL，DNA模板1 μL，P1、P2引物(10 μmol/L)各1 μL，补加ddH₂O至20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，45 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 PCV2全基因组的克隆

以检测为PCV2阳性的病料样品基因组DNA为模板，进行PCV2全基因组扩增。PCR反应体系：rTaq DNA聚合酶Mix 10 μL，DNA模板1 μL，P3、P4引物(10 μmol/L)各1 μL，补加ddH₂O至20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，73 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明书对PCR产物纯化回收，并与pMD^TM18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种于氨苄抗性的LB平板上(含氨苄100 μL/mL)。37 ℃培养过夜后，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定。对PCR检测结果呈阳性的菌液提取质粒并鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒命名为pMD^TM18-T-PCV2，送至南京擎科生物科技有限公司测序。

1.6 PCV2基因序列分析

使用DNAStar等软件对检测所得8株PCV2安徽株的基因序列与国内外20株GenBank上登录的PCV2参考毒株基因序列，进行相似性比较，并通过MEGA 7.0软件的邻接法构建系统发育树，再对ORF2基因编码的氨基酸序列进行分析。

2 结果与分析 2.1 PCV2的PCR检测结果

以受检病料DNA为检测模板，并设置阴性对照，使用引物P1和P2进行PCR检测。检测结果显示，25份病料中，有8份样品扩增出约475 bp大小的目的片段(图 1)，与预期长度一致，为PCV2阳性样。

2.2 PCV2全基因组的扩增及测序结果

将检测为PCV2阳性的样品DNA作为扩增模板，设置阴性对照，使用引物P3和P4对PCV2进行全基因扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在1 000-2 000 bp处有特异性条带，大小约1.7 kb，与预期一致(图 2)。将扩增的全基因克隆测序的结果显示：得到的8株PCV2安徽株全基因序列中，有1株为1 768 bp，其余7株均为1 767 bp。

2.3 PCV2全基因组序列分析

2.3.1 PCV2全基因组核苷酸相似性比较

使用DNAStar中的MegAlign软件对检测毒株和参考毒株进行相似性比对分析。结果(图 3)显示，8株安徽株之间核苷酸相似性为93.3%-99.4%，与国内外20株参考毒株核苷酸相似性为92.8%-99.0%。

2.3.2 ORF2以及推导出的氨基酸相似性比较

使用DNAStar中的MegAlign软件对检测毒株与参考毒株比较ORF2及ORF2推导出的氨基酸相似性。结果显示：8株PCV2安徽株之间的ORF2及ORF2推导的氨基酸相似性为88.9%-99.6%和86.8%-100%，与参考毒株ORF2及ORF2推导的氨基酸相似性为85.8%-99.6%和82.5%-100%。

2.3.3 遗传进化分析

系统发育树结果(图 4)表明，8株PCV2安徽株可以分为三大分支(PCV2a、PCV2b和PCV2d)。其中有5株属于PCV2d (2017年4株，2018年1株)，2株属于PCV2b (2018年2株)，1株属于PCV2a (2016年1株)，未发现其他亚型。

2.3.4 ORF2基因编码的氨基酸序列分析

将检测所得的8株安徽株与国内外20株GenBank上登录的PCV2参考毒株ORF2基因编码的氨基酸序列进行分析，结果显示：PCV2各基因型ORF2氨基酸序列上的位点具有其独特性。PCV2a基因型的ORF2氨基酸序列中特异性氨基酸位点主要集中在第80V，PCV2b基因型的ORF2氨基酸序列中特异性氨基酸位点主要集中在第89R和210E，PCV2c基因型的ORF2氨基酸序列中特异性氨基酸位点主要集中在第52S、54V、58N、60S、61Q、64P、78Q、106F、107A、108R、200H、203Q、206T、207N、208A和210A，PCV2d基因型的ORF2氨基酸序列中特异性氨基酸位点主要集中在第53I、68N、134N、169R和215I，PCV2e基因型的ORF2氨基酸序列中特异性氨基酸位点主要集中在第47S、187I、191K，PCV2f基因型的ORF2氨基酸序列中特异性氨基酸位点主要集中在第233T。根据PCV2各基因型的ORF2氨基酸序列上特异性位点的不同，可在分子水平上区分PCV2的基因型。由图 5可见，有部分ORF2的特异性氨基酸位点恰好落在5个抗原表位区内，这可能会使PCV2各基因型表现出不同的抗原性和致病性。

将PCV2a、PCV2b、PCV2d三种基因型ORF2氨基酸序列中的5个抗原表位区A (57–91)、B (121–137)、C (183–191)、D (206–215)、E (230–233)分别与国内外相应的亚型进行比较(图 5)。发现本研究中的PCV2d基因型ORF2氨基酸序列在第59位有统一的变异，其他表位区保持高度一致；PCV2a、PCV2b基因型ORF2氨基酸序列中的5个抗原表位区中存在部分变异(表 1)。这些变异对于病毒抗原性的影响还需进一步研究。

3 讨论与结论

自1991年发现PCV2以来，PCV2已经成为最流行的猪病毒之一，各种针对PCV2的疫苗被研发制作并投入使用^[7]。直到几年前，PCV2还被认为是一种被成功控制的突发病原体，但随着不断有PCV2疫苗免疫失败的报道出现，人们逐渐认识到对PCV2的防控并不简单^[2]。特别是对于PCV2a型，在引入疫苗后，已经检测到一种促进病毒衣壳改变而远离疫苗特异性抗原决定簇的定向选择。有报道称，与病毒衣壳相关的抗原表位，其变异导致了免疫逃逸^[8]。鉴于PCV2的普遍性和不断变异和进化，解读其分子进化和流行病学是一项艰巨的任务。

本研究首先对安徽地区的送检病料进行检测，PCV2的感染率为25.8%，说明PCV2已在安徽猪群中普遍存在。将检测为PCV2阳性的样品DNA进行全基因的克隆与分析，结果显示：获得的8株PCV2毒株之间核苷酸、ORF2及ORF2推导氨基酸的相似性分别为93.3%-99.4%、88.9%-99.6%、86.8%-100%。与国内外参考毒株核苷酸、ORF2及ORF2推导氨基酸的相似性为92.8%-99.0%、85.8%-99.6%、82.5%-100%，均无明显差异，表明安徽地区PCV2毒株与国内外参考株之间存在较高的相似性。再绘制遗传进化树比对，发现所得的8株PCV2安徽株含1株PCV2a (2016年1株)，5株PCV2d (2017年4株，2018年1株)，2株PCV2b (2018年2株)。最后对ORF2基因编码的氨基酸序列进行分析，发现各基因型在Cap蛋白氨基酸序列上具有其独特变异位点：同基因型在某些氨基酸位点上具有相同的氨基酸残基，但却与其他基因型在相同位置的氨基酸残基不同，这对划分PCV2基因型起到一定程度的指导意义。PCV2中ORF2基因主要负责编码PCV2的Cap蛋白，该蛋白是重要的结构蛋白，能刺激机体产生中和抗体。Cap蛋白具有5个主要的抗原表位，如果该蛋白存在单一氨基酸变异，可能会使PCV2表型发生改变，导致致病力增强^[9]。本研究通过对比PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f这6种基因型Cap蛋白的5个抗原表位，发现6种基因型的氨基酸变异位点和各亚型特异性氨基酸位点在5个抗原表位区内都有分布，这些氨基酸的变异是否会造成PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f这6种基因型毒株的抗原性的变化和致病力的增强，还需要进一步研究。

因大量使用疫苗后导致PCV2进化模式的改变，使得对PCV2流行病学进行持续性监测变得非常关键。结合本研究和中国各地区对PCV2多种基因型流行趋势的分析^[10-12]可以发现，PCV2d基因型已经逐渐取代PCV2b基因型成为在安徽省流行的PCV2优势毒株，这对可能出现的疫苗逃逸突变体作出迅速反应有重要的意义。对PCV2各基因型ORF2编码氨基酸的分析，为安徽地区PCV2的防控和疫苗的开发提供了有利数据。此外，本研究进行遗传进化分析时引用了新发现的PCV2f基因型^[6]，增加了分析所得数据的可靠性和全面性。