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文章信息
- 赵振翔, 朱紫祥, 杨帆, 曹伟军, 李莎莎, 康慧, 杨孝朴, 郑海学
- ZHAO Zhen-Xiang, ZHU Zi-Xiang, YANG Fan, CAO Wei-Jun, LI Sha-Sha, KANG Hui, YANG Xiao-Pu, ZHENG Hai-Xue
- 猪圆环病毒3型衣壳蛋白(Cap)抑制宿主细胞天然免疫应答
- Inhibition effect of PCV3 capsid protein on innate immune response of host cells
- 微生物学通报, 2019, 46(7): 1761-1771
- Microbiology China, 2019, 46(7): 1761-1771
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190156
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文章历史
- 收稿日期: 2019-03-02
- 接受日期: 2019-04-23
- 网络首发日期: 2019-05-20
2. 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原学国家重点实验室 口蹄疫国家参考实验室 甘肃 兰州 730046
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, National Foot and Mouth Diseases Reference Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou, Gansu 730046, China
猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的重要成员之一,是目前报道的最小的无囊膜DNA病毒[1-2]。成熟的病毒粒子是由60个衣壳蛋白质(Capsid protein,Cap)亚基组装成的正二十面体球形颗粒,直径为17 nm−20 nm,病毒的基因组包裹于其中,是由1 767−1 768个碱基组成的单链环状DNA,编码3个主要的开放阅读框(Open reading frames,ORFs):Cap、Rep和ORF3。Cap是PCV唯一的结构蛋白质和主要抗原,Rep是病毒复制相关的酶,而ORF3的功能不清楚[3]。
在2016年前,PCV仅报道有PCV1和PCV2两个基因型[2]。PCV1最初被鉴定为PK-15细胞培养物的污染物[4],而且对猪无致病性[5]。与PCV1不同,PCV2感染猪并引起严重的临床症状,造成巨大的经济损失。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原[6],与猪皮炎和肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)[7]、猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)[8]、繁殖障碍[9]、增生性坏死性肺炎(Proliferative and necrotizing pneumonia,PNP)[10]和肠炎[11-12]等疾病密切相关,均为猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)[13-14]。
2016年10月,加州大学San Francisco分校Phan等和Kansas州立大学的Palinski等几乎在同一时间报道了一个新的PCV基因型,并将其命名为PCV3[15-16]。PCV3是通过PCR和宏基因组测序从发生断奶仔猪多系统衰竭综合征等病症的母猪或仔猪体内检测到的,且发病猪PCV-2检测为阴性。2017年3月,我国在广东省的猪群中首次检测到了PCV3[17]。
天然免疫系统是机体抵御病原微生物入侵的第一道防线。病原分子模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)是其重要的组成部分,PRRs识别病原微生物,启动抗细菌或抗病毒反应,在天然免疫应答中发挥着极其重要的作用[18]。病原微生物感染宿主细胞后,PRRs通过识别病原微生物的病原相关分子模式(Pathogen- associated molecular pattern,PAMPs),促进下游干扰素与细胞因子的分泌,激活大量抗菌或抗病毒蛋白的表达,抑制病原的复制,最终促进细胞对病原微生物的清除[19]。目前人们已经发现并深入研究了RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、NOD样受体(NOD-like receptors,NLRs)和胞质DNA受体等PRRs。其中胞质DNA受体中的cGAS是细胞识别DNA病毒的一类模式识别受体,其通过cGAS- MITA信号通路诱导Ⅰ型干扰素和炎症因子的产生,在抗病毒天然免疫反应中发挥着重要的作用[20]。
PCV-2致病的一个重要原因是其感染猪后能够引起严重的免疫抑制,而关于PCV3对宿主的免疫抑制研究仍未见报道。Cap作为PCV-3的衣壳蛋白,其对天然免疫应答的调控作用仍不清楚。本研究构建了pCAGGS-FLAG-PCV3-Cap真核表达质粒,对其表达情况进行了验证,并研究了Cap对Ⅰ型干扰素通路活化的影响,证实其能够抑制Ⅰ型干扰素通路的活化,抑制天然免疫应答,发挥免疫抑制作用。本研究为深入研究PCV3发挥免疫抑制的机制提供理论依据,为阐明PCV3的致病机制提供新的研究数据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞和质粒PK-15细胞、HEK-293T细胞(ATCC库),双荧光素酶报告基因质粒pGL-ISRE、Prl-TK及真核表达质粒pCAGGS、pCAGGS-FLAG-PCV3-Cap (融合表达含有FLAG标签的PCV3-Cap蛋白)、pcDNA3.1-HA-cGAS、pRK-HA-MITA、pRK-HA- TBK1、pRK-HA-IRF3、pRK- HA-IRF7 (融合表达含有HA标签的各类宿主蛋白)均由本实验室保存。
1.1.2 抗体小鼠抗FLAG单抗、小鼠抗HA单抗、小鼠抗β-Actin单抗,Sigma公司;HRP山羊抗小鼠IgG,北京博奥龙公司。
1.1.3 主要试剂和仪器DMEM培养基、1%青霉素和链霉素溶液、0.25%胰酶溶液,Gibco公司;胎牛血清,Biological Industries公司;质粒提取试剂盒,Omega公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒、反转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂、GLOMAX化学发光检测仪,Promega公司;Oligo(dT)18引物、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、SYBR Premix Ex Taq、DNA限制性核酸内切酶,TaKaRa公司;Poly(dA:dT)、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000,Invitrogen公司;蛋白酶抑制剂和琼脂粉,Roche公司;QuantiCyto®人IFN-β ELISA试剂盒,欣博盛公司。凝胶成像仪,Bio-Rad公司;ABI梯度PCR仪、CO2恒温培养箱、QuanStudio5定量PCR仪,Thermo公司。
1.2 方法 1.2.1 真核表达质粒的构建参考Porcine circovirus 3 strain 29160毒株(GenBank登录号:KT869077)的Cap基因序列合成Cap基因片段,在PCV3-Cap序列上、下游分别引入酶切位点EcoR I和Xho I,连接于pCAGGS真核表达载体上,测序验证,获得pCAGGS-FLAG- PCV3-Cap真核表达质粒。
1.2.2 Western blotting检测HEK-293T细胞接种至细胞培养皿,细胞密度达到75%−90%时,分别用脂质体转染相应的质粒,36 h后收取并处理细胞样品,加入蛋白上样缓冲液,98 ℃变性10 min,进行SDS-PAGE电泳,随后转印至NC膜,用5%的脱脂奶粉封闭2 h,TBST洗膜后,加入小鼠抗FLAG/HA/β-Actin的一抗,4 ℃孵育过夜,用TBST洗膜3次,每次10 min,HRP山羊抗小鼠IgG二抗室温孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min,加入ECL化学发光液,用蛋白发光印记仪曝光检测。
1.2.3 RNA提取及cDNA合成用Trizol裂解法提取总RNA:将35 mm细胞培养皿中的细胞用PBS洗一次后,加入1 mL Trizol反复吹打裂解,移入1.5 mL无RNase Eppendorf离心管中,室温裂解5 min,加入200 μL氯仿振荡混匀后4 ℃放置5 min,4 ℃、12 000 r/min离心15 min,小心吸取上清至新的无RNase的1.5 mL Eppendorf离心管中,并加入等体积的异丙醇沉淀RNA,−20 ℃放置30 min后,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,弃去上清,用75% DEPC处理水配制的乙醇洗涤离心管,4 ℃、7 500 r/min离心5 min,弃去上清,再次离心3 min,小心吸取上清,晾干,加入20 μL无RNase水溶解RNA,测定RNA浓度。
反转录反应体系(20 μL):5×First buffer 4 μL,DTT (0.1 mol/L) 2 μL,Oligo(dT)18引物(50 μmol/L) 1 μL,Random primer (100 μmol/L) 0.5 μL,RNA酶抑制剂RRI 1 μL,M-MLV反转录酶1 μL,dNTP mixture (10 mmol/L) 1 μL,RNA模板4.5 μL,DEPC水5 μL。
参照王国庆等[21]的方法设计反应条件:25 ℃ 10 min,37 ℃ 60 min,72 ℃ 15 min,4 ℃保存备用。
1.2.4 双荧光素酶基因报告系统将HEK-293T细胞接种至24孔板中,细胞密度达到75%−90%后,每组样品设立3个平行孔,每孔中分别转染萤火虫荧光素酶报告质粒ISRE (Interferon-stimulated responsive element)-luc 100 ng、海肾荧光素酶内参报告质粒PRL-TK 10 ng和pCAGGS空载体或不同剂量的pCAGGS-FLAG- PCV3-Cap真核表达质粒(200、400、800 ng),并保证每孔细胞接收相同的质粒(不够的用空载体补齐)。转染24 h后,再次转染1 μg/孔的Poly (dA:dT),20 h后利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光强度,所有结果至少重复3次。
1.2.5 实时荧光定量PCR将HEK-293T细胞或PK-15细胞接种至35 mm细胞培养皿中,细胞密度达到75%−90%后,将pCAGGS空载体和pCAGGS-FLAG-PCV3-Cap真核表达质粒分别转染细胞,24 h后根据实验需要转染Poly(dA:dT),20 h后收取细胞样品,提取细胞的总RNA,按照反转录酶体系将RNA反转录成cDNA,用对应的定量引物进行PCR检测(表 1)。
基因 Gene |
引物序列 Primers sequence (5′→3′) |
Human-GAPDH | F: CGGGAAGCTTGTGATCAATGG |
R: GGCAGTGATGGCATGGACTG | |
Human-IFN-β | F: GACATCCCTGAGGAGATTAAG |
R: ATGTTCTGGAGCATCTCATAG | |
Human-ISG15 | F: TGGACAAATGCGACGAACC |
R: CCCGCTCACTTGCTGCTT | |
Human-ISG54 | F: ACGGTATGCTTGGAACGATTG |
R: AACCCAGAGTGTGGCTGATG | |
Human-MXA | F: TCTTCATGCTCCAGACGTAC |
R: CCAGCTGTAGGTGTCCTTG | |
Porcine-GAPDH | F: ACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA |
R: GATCGAGTTGGGGCTGTGACT | |
Porcine-IFN-β | F: CTAACAAGTGCATCCTCCAAA |
R: AGCACATCATAGCTCATGGAAAGA | |
Porcine-ISG15 | F: GATCGGTGTGCCTGCCTTC |
R: CGTTGCTGCGACCCTTGT | |
Porcine-ISG54 | F: CACCTCTGGACTGGCAATAGC |
R: GTCAGGATTCAGCCGAATGG | |
Porcine-MXA | F: GGCGTGGGAATCAGTCATG |
R: AGGAAGGTCTATGAGGGTCAGATCT |
RT-PCR反应体系(20 μL):SYBR Premix Ex Taq 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,DEPC水8.2 μL,cDNA 1 μL,总体积20 μL。
RT-PCR反应条件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 34 s,共40个循环,同时进行熔解曲线分析,采用2−△△Ct分析不同基因相对表达量。
1.2.6 ELISA实验将HEK-293T细胞接种至35 mm细胞培养皿中,细胞密度达到75%−90%后,将pCAGGS空载体和pCAGGS-FLAG-PCV3-Cap真核表达质粒分别转染细胞,24 h后根据实验需要转染Poly(dA:dT),20 h后收取细胞培养上清,ELISA检测IFN-β的分泌量。具体操作步骤如下:(1)根据实验需要准备所需的板条;(2)空白孔加标准品和通用稀释液,其余相应孔中加标本或不同浓度的标准品(100 μL/孔),用封板胶纸封住反应孔,37 ℃温箱孵育90 min;(3)洗板5次;(4)空白孔加生物素化抗体稀释液,其余孔加入生物素化抗体工作液(100 μL/孔),用封板胶纸封住反应孔,37 ℃温箱孵育60 min;(5)洗板5次;(6)空白孔加酶结合物稀释液,其余孔加入酶结合物工作液(100 μL/孔),用新封板胶纸封住反应孔,37 ℃温箱避光孵育30 min;(7)洗板5次;(8)加入底物显色液(TMB) 100 μL/孔,37 ℃温箱避光孵育15 min;(9)加入终止液100 μL/孔,混匀后即刻测量OD450值。
1.2.7 免疫共沉淀实验(Co-IP)将HEK-293T细胞接种至10 cm细胞培养皿中,细胞密度达到75%−90%后,将pcDNA3.1-HA-cGAS、pRK-HA-MITA真核表达质粒分别与pCAGGS-FLAG-PCV3-Cap真核表达质粒共同转染HEK-293T细胞。36 h后吸掉培养基,加入裂解液(50 mmol/L pH 8.0 Tris,150 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA,1% NP-40,2 mg/L Aprotinin,2 mg/L Leupeptin,1 mmol/L Phenylmethanesulfonyl fluoride),冰上孵育30 min并收集液体,12 000 r/min离心10 min。取适量上清加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,煮沸10 min后离心进行Western blotting,剩余上清加入FLAG或HA抗体4 ℃旋转摇床孵育过夜,再加入G蛋白琼脂糖珠,4 ℃旋转摇床孵育4 h,用裂解液洗3次后加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液煮沸,进行Western blotting检测。
2 结果与分析 2.1 PCV3-Cap真核表达载体的构建将合成并且测序正确的pCAGGS-FLAG- PCV3-Cap质粒利用EcoR I和Xho I内切酶进行双酶切鉴定,利用1%琼脂糖凝胶核酸电泳检测到一条大小约为700 bp的插入序列,而空载体未检测到插入序列(图 1)。将提取的质粒再次送样测序,测序验证序列正确插入,获得pCAGGS-FLAG- PCV3-Cap真核表达质粒。
2.2 PCV3-Cap真核表达质粒的表达验证将2 μg pCAGGS空载体或pCAGGS-FLAG- PCV3-Cap质粒分别转染HEK-293T细胞,转染36 h后收取细胞,利用FLAG单抗进行Western blotting检测,结果检测到大约35 kD大小的蛋白条带(图 2),与预期大小相符合,表明PCV3-Cap蛋白成功表达。
2.3 PCV3-Cap蛋白对Ⅰ型干扰素通路活化的影响为研究Cap对天然免疫应答的影响,利用双荧光素酶基因报告系统检测PCV3-Cap蛋白对Ⅰ型干扰素通路活化的影响。分别将200、400、800 ng的pCAGGS-FLAG-PCV3-Cap质粒与100 ng ISRE-luc报告质粒和10 ng PRL-TK内参质粒共转染HEK-293T细胞,用相应空载体确保每一个孔细胞接收相同量的质粒,转染24 h后,再次转染1 μg/孔的Poly(dA:dT),20 h后利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光强度。结果如图 3所示,PCV3-Cap蛋白可以显著抑制Poly(dA:dT)诱导的ISRE启动子的活化,说明PCV3病毒蛋白Cap能够抑制Ⅰ型干扰素通路的激活。
为鉴定PCV3-Cap蛋白抑制Ⅰ型干扰素通路活化靶向的节点分子,利用双荧光素酶基因报告系统检测分析了PCV3-Cap蛋白对cGAS通路节点分子诱导的ISRE活化的影响。将400 ng的pCAGGS-FLAG-PCV3-Cap真核表达质粒、100 ng ISRE-luc报告质粒、10 ng PRL-TK内参质粒分别和100 ng的节点分子cGAS-MITA、TBK1、IRF3或IRF7真核表达质粒共转染HEK-293T细胞,用相应空载体确保每一个孔细胞接收相同的质粒,转染24 h后利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光强度。结果如图 4所示,PCV3病毒蛋白Cap通过cGAS-MITA通路中cGAS-MITA抑制Ⅰ型干扰素的激活。
2.4 PCV3-Cap蛋白对Ⅰ型干扰素及相关细胞因子表达的影响为进一步研究Cap是否通过抑制Ⅰ型干扰素、促炎性因子及干扰素诱导的抗病毒基因(Interferon- stimulated genes,ISGs)的表达发挥免疫抑制效应。将HEK-293T细胞或PK-15细胞接种至35 mm细胞培养皿中,细胞密度达到75%–90%后,将pCAGGS空载体和pCAGGS-FLAG-PCV3-Cap真核表达质粒分别转染细胞,转染24 h后,再次转染3 μg/孔的Poly(dA:dT),20 h后收取细胞样品,提取细胞的总RNA,在将RNA反转录成cDNA后进行实时荧光定量PCR检测;同时收取细胞培养上清进行ELISA检测。如图 5所示,表明在HEK-293T细胞(A−D)和PK-15细胞(E−H)上,PCV3-Cap蛋白能够显著抑制Ⅰ型干扰素、干扰素诱导的抗病毒基因ISG15、ISG54及MXA的表达。
同时,如图 6所示,ELISA检测结果表明在HEK-293T细胞上,PCV3-Cap蛋白能够显著抑制Poly(dA:dT)诱导的Ⅰ型干扰素IFN-β的分泌。
2.5 PCV3-Cap蛋白对cGAS和MITA表达的影响cGAS-MITA为PCV3-Cap蛋白抑制Ⅰ型干扰素通路活化的潜在靶点,为了进一步研究PCV3-Cap蛋白对cGAS和MITA的调控机制,研究了PCV3-Cap蛋白对cGAS和MITA的表达影响。将pCAGGS空载体和pCAGGS-FLAG-PCV3-Cap真核表达质粒分别与pcDNA3.1-HA-cGAS和pRK-HA-MITA真核表达质粒共同转染细胞,转染36 h后收取细胞,利用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测cGAS和MITA蛋白及mRNA的表达水平。结果如图 7所示,PCV3-Cap蛋白对cGAS和MITA蛋白及mRNA表达均没有抑制作用,表明PCV3病毒蛋白Cap抑制Ⅰ型干扰素的表达不是通过抑制cGAS和MITA的表达实现的。
2.6 PCV3-Cap蛋白与cGAS和MITA相互作用检测为进一步挖掘PCV3-Cap蛋白抑制cGAS和MITA介导的Ⅰ型干扰素通路活化机制,采用免疫共沉淀实验检测PCV3-Cap蛋白与cGAS及MITA的相互作用。将pCAGGS空载体和pCAGGS- FLAG-PCV3-Cap真核表达质粒分别与pcDNA3.1- HA-cGAS和pRK-HA-MITA真核表达质粒共同转染细胞,转染36 h后收取细胞,进行Western blotting检测。如图 8所示,免疫共沉淀结果表明,PCV3-Cap蛋白不与cGAS发生相互作用(图 8A),但能够与MITA发生相互作用(图 8B),说明PCV3病毒蛋白Cap可能通过与MITA相互作用,进而抑制天然免疫信号通路的活化。
3 讨论猪圆环病毒(PCV)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,其中PCV1不致病,PCV2已经被证实可以通过cGAS-MITA信号通路抑制天然免疫反应[22]。PCV3已成为世界养猪产业面临的一个新的威胁,但其致病力、流行病学、分子生物学研究等处于初步研究阶段。关于PCV3感染的机制至今仍然未有报道,本研究通过构建PCV3衣壳蛋白(PCV3-Cap)的真核表达质粒,开展了PCV3-Cap蛋白对天然免疫应答的调控研究。结果证实PCV3-Cap具有抑制Ⅰ型干扰素通路活化的功能,其能够抑制IFN-β、ISG15、ISG54、和MXA等细胞因子的表达,说明PCV3-Cap会造成细胞的天然免疫应答抑制,这也暗示了感染PCV3的仔猪为何会经常伴随着猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪肺炎支原体、细菌性败血症和肺炎等其他疾病的发生。张冰晨[22]研究发现PCV2病毒可以抑制cGAS-MITA通路,分别在未感染和感染PCV2的猪睾丸细胞ST中加入cGAMP刺激,发现感染了PCV2的细胞相对于未感染细胞中的IFN-β表达显著降低,对IRF3磷酸化水平的检测也发现,PCV2感染会抑制IRF3的磷酸化,导致下游级联反应减弱,从而使干扰素表达水平降低,进而表明PCV2对cGAS-MITA通路存在抑制作用,但其分子机制并不清楚。近期研究已成功拯救了猪PCV3型病毒,并证实其感染4−8周龄小猪后可引起典型的临床症状,而在病原与KLH共同接种动物后,KLH并不能有效增强免疫保护作用。虽然在感染猪只体内检测到了大量干扰素的表达,但此时病毒已经大量复制,突破了天然免疫的限制,引发了严重的病变。因此,病原可能在早期限制了天然免疫应答,促进病原大量复制,后期即使干扰素表达水平上升,也不能完全限制病毒的复制[23]。
本研究通过双荧光素酶报告系统筛选发现,Cap通过cGAS-MITA通路抑制干扰素报告基因的表达,进一步发现Cap不会抑制cGAS和MITA在蛋白和mRNA水平的表达,通过Co-IP实验发现Cap不与cGAS发生相互作用,而与MITA发生相互作用。有研究报道显示病毒蛋白通过作用于MITA进而抑制MITA-TBK1-IRF3复合体或者MITA二聚体、寡聚体的形成,从而抑制天然免疫反应,逃避抗病毒免疫[24-26];也有报道显示病毒蛋白通过抑制MITA的K63泛素化从而逃避天然免疫反应[27]。Cap是通过抑制MITA-TBK1- IRF3复合体的形成,还是通过抑制MITA泛素化从而抑制天然免疫反应还需要进一步深入研究。
虽然关于PCV3感染后其病毒DNA抑制Ⅰ型干扰素表达的机制仍不清楚,但本实验初步证实PCV3-Cap通过作用于cGAS-MITA通路中的MITA抑制Ⅰ型干扰素通路的活化,进而抑制天然免疫抗病毒反应,这为深入开展PCV3致病机制研究奠定了理论基础,为PCV3防控提供了新的视角。
4 结论本文首先构建了PCV3-Cap的真核表达质粒并验证其成功表达,通过双荧光素酶报告系统筛选发现Cap蛋白能够抑制Ⅰ型干扰素通路的激活,并且是通过cGAS-MITA通路中的cGAS-MITA实现的;进一步实验发现Cap抑制Ⅰ型干扰素的表达不是通过抑制cGAS和MITA的表达实现的,而是通过与MITA相互作用抑制天然免疫信号通路的活化。
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