副溶血性弧菌是一种嗜盐弧菌，主要寄生在海水、港口水及海产品上，人们主要通过食用被污染的海产品而感染。目前副溶血性弧菌已经成为全世界范围内食源性胃肠道感染的主要病原菌^[1]。副溶血性弧菌基因组包含两套染色体，编码两套三型分泌系统(Type 3 secretion systems，T3SS)，T3SS1和T3SS2 (T3SS2α和T3SS2β)^[2]。T3SS由很多不同的结构蛋白组装而成，其结构为注射针状，病原菌可以直接通过T3SS将毒力效应蛋白注射到宿主细胞胞膜和胞浆内，从而引起细胞损伤。T3SS是副溶血性弧菌主要致病因子之一。

副溶血性弧菌的T3SS2位于小染色体的毒力岛上，与细菌对宿主的肠毒性相关^[3]。T3SS2的效应蛋白主要包括VopV、VopL、VopC、VopO、VopA/P、VopT、VopC、VPA1380。细菌通过这些分泌蛋白的联合作用导致宿主细胞的损伤。但是T3SS毒力作用的发挥依赖于转座蛋白将效应蛋白转移至宿主细胞内，所以转座蛋白也是T3SS引起致病的关键因子。研究表明在副溶血性弧菌中，T3SS2的效应蛋白VopB2不但可以发挥肠毒性作用，同时也是转位蛋白，与效应蛋白VopT的转运及在细胞表面成孔作用相关^[4]。VtrA (V. parahaemolyticus T3SS2 regulator A)和VtrB由毒力岛基因VPA1332和VPA1348编码，为ToxR样转录调节蛋白，它们可以调节毒力岛基因tdh (thermostable direct hemolysin)和T3SS2基因的表达，是T3SS2发挥肠毒性所必需的(VtrA和或VtrB的缺失株肠毒性也缺失)，同时VtrA可以直接调控VtrB的表达^[5-7]。

CalR属于LysR家族的转录调节因子，这类调控因子广泛存在于原核生物中。在副溶血弧菌中CalR由位于大染色体上的calR (VP0350)基因所编码。在副溶血弧菌中，CalR直接抑制T3SS1的表达，同时ToxR作为一种跨膜调节蛋白，可以通过激活CalR的表达间接抑制T3SS1基因的转录，而CalR对ToxR又具有负调控作用^[8-9]。CalR还可以激活T6SS2的表达来加强副溶血性弧菌与Hela细胞之间的粘附作用^[10]。同时CalR通过下调主要毒力因子TDH (thermostable direct hemolysin)基因的转录，从而抑制副溶血性弧菌的溶血素活性^[11]。基于此，可以看出在副溶血弧菌中，CalR是一个非常重要的转录调节因子，所以本文以分泌蛋白VopB2为靶基因，主要研究调控因子CalR是否对T3SS2有调控作用及具体的调控机制。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

副溶血弧菌野生株RIMD2210633 (WT)、calR非极性突变株(ΔcalR^[12])、重组质粒vopB2::pHRP309及vtrA::pHRP309 (庆大霉素抗性)均来自江苏大学国家重点实验室。

1.1.2 主要试剂和仪器

Taq DNA聚合酶、dNTPs以及DNA marker，TaKaRa公司；PCR产物纯化试剂盒，Qiagen公司；Primer Extension System和Fmol^® DNA Cycle Sequencing System，Promega公司；TRIzol Reagent，Invitrogen公司；DNA-free^TM Kit，Amibion公司。

PCR仪，Eppendor公司；实时荧光定量PCR仪，Bio-Rad公司；ND-100核酸检测仪，NanoDrop公司；凝胶成像分析系统，Syngene公司。

1.1.3 培养基

HI肉汤(2.5% Bacto heart infusion)购自BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养

取5 μL甘油菌种接种至5 mL的HI肉汤中(玻璃试管)，37 ℃、200 r/min培养至平台期(12−14 h)，按1:50转接至15 mL新鲜的HI肉汤(50 mL的三角烧瓶)中，37 ℃、200 r/min培养至OD₆₀₀为0.4−0.6 (对数期早期)，收集菌体。

1.2.2 引物

本文所用引物见表 1。

1.2.3 引物延伸实验

用[γ-³²P]-ATP (10 mCi/mL)将同靶基因(vopB2和vtrA)的mRNA互补的特异性引物(表 1) 5ʹ-末端进行放射性标记，分别以等量WT和ΔcalR的总RNA为模板，利用被标记的特异性引物将靶基因的mRNA逆转录为cDNA，经6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳、放射自显影，随后分析结果。可对比测序条带鉴定出靶基因的转录起始位点(+1)，并且分析WT和ΔcalR中的基因转录表达差异。

1.2.4 LacZ实验

分别将vopB2及vtrA的启动子区克隆至pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游，构建LacZ重组质粒，并分别将重组质粒导入WT和ΔcalR中，将WT和ΔcalR在一定的条件下(见1.2.1)培养后，通过比较其β-半乳糖苷酶活性的差异来分析CalR对靶基因的调控关系。

1.2.5 实时定量RT-PCR (qRT-PCR)

用TRIzol法提取WT和ΔcalR的总RNA，使用DNA-free^TM Kit去除基因组DNA污染后，将总RNA逆转录为cDNA。用Bio-Rad的C1000 Thermal Cycler作qRT-PCR分析。以16S rRNA基因的表达量为内参(表 1)，用Bio-Rad CFX_Manger和T-test统计分析目的基因的转录水平。

1.2.6 凝胶阻滞实验(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)

PCR扩增vopB2的启动子区(表 1)，用[γ-³²P]- ATP标记DNA片段的5′-末端来制备特异性的DNA探针。将不同浓度的His-CalR与约为50 ng/μL的DNA探针在10 μL结合反应体系中室温孵育20 min，随后使用4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带，−20 ℃下放射自显影后，分析结果。

2 结果与分析 2.1 CalR负调控vopB2的转录

首先利用引物延伸实验研究vopB2的转录起始位点，并通过测序比对出其转录起始位点，如图 1A所示：vopB2的转录起始位点有两个，分别为位于起始密码子ATG上游130 bp的A和ATG上游28 bp的A，且在ΔcalR中产物丰度明显高于WT，这表明CalR能抑制vopB2的转录；图 1B所示为验证CalR调控vopB2的实时定量RT-PCR结果，可以看出ΔcalR中vopB2的mRNA表达水平明显升高，约为WT表达量的6倍；图 1C所示为LacZ报告基因融合实验，该实验更进一步验证了CalR对vopB2的调控关系，可以看出在ΔcalR中检测到的β-半乳糖苷酶活性(Miller units)明显高于WT，而且差别具有统计学意义(P < 0.01)，这进一步说明CalR抑制vopB2的转录。上述实验综合证明CalR负调控vopB2的转录。

2.2 CalR能够直接结合到vopB2的启动子区

采用体外的EMSA实验进一步研究CalR是否对vopB2启动子区DNA具有直接的结合作用，结果如图 2所示：当His-CalR的用量达到2.78 pmol时即与vopB2形成复合物条带，其泳动速度明显慢于游离的靶基因片段，并随着His-CalR浓度的增加，游离带越来越弱，而阻滞带越来越明显，阴性对照16S rRNA基因不具有结合反应。此结果说明CalR能直接结合到vopB2的启动子区。

2.3 CalR不调控vtrA的转录

Kodama等^[5]的研究结果表明VtrA蛋白能激活Vp-PAI内基因的表达。据此假设CalR是否能通过调节vtrA的转录来抑制T3SS2基因的表达。

首先采用引物延伸实验研究CalR对vtrA基因的调控关系，结果显示(图 3A) vtrA的转录起始位点为A，位于起始密码子ATG上游283 bp，且WT和ΔcalR中vtrA基因的mRNA表达量没有差异。进一步在体外进行的LacZ报告基因融合实验结果显示(图 3B)：ΔcalR中测得的β-半乳糖苷酶活性与WT基本相同，无显著性差异，这同样说明CalR不调控vtrA基因的转录，综合结果表明CalR不能通过调控vtrA的转录来调控T3SS2的表达。

3 讨论与结论

本文利用分子生物学实验研究了CalR对vopB2的转录调控机制。引物延伸和qRT-PCR实验结果表明vopB2有两个转录起始位点，且CalR抑制vopB2的转录活性；LacZ报告基因融合实验表明CalR抑制vopB2的启动子区活性；而EMSA实验结果进一步表明CalR能直接结合到vopB2的启动区，综合所有实验说明CalR通过直接抑制vopB2的转录活性，从而抑制副溶血弧菌的肠毒性作用。Kodama等^[5]的研究表明VtrA和VtrB可以激活毒力岛内基因的转录，同时VtrA又能激活vtrB的转录。据此我们提出疑问：CalR是否可以通过抑制vtrA的转录表达来间接抑制vopB2的转录，然而引物延伸和LacZ报告基因融合实验均表明CalR不调控vtrA的转录表达，说明CalR不能通过影响vtrA的转录来调控T3SS2的转录活性。

副溶血性弧菌有两套T3SS，其中T3SS1位于大染色体上，其(G+C)mol%含量与基因组一致，来自于垂直遗传且存在于所有的副溶血性弧菌中，与细菌对宿主的细胞毒性相关。但是T3SS1引起细胞毒性的具体机制还有争议，Ono等报道T3SS1是通过加速细胞凋亡来引起细胞毒性的^[13]；Burdette等报道T3SS1是通过一种特殊形式的自噬现象引起细胞毒性^[14]；但是Zhou等认为T3SS1是通过细胞肿胀而非自噬或者凋亡引起细胞毒性的发生^[15]。T3SS2位于小染色体的毒力岛上(Vp-PAI)，其基因簇的(G+C)mol%含量为39.8%，明显低于基因组的平均(G+C)mol%含量(45.5%)，而且只存在于临床致病菌株中，提示其最有可能是通过水平转移获得的，与细菌对宿主的肠毒性相关^[3]。副溶血性弧菌感染所引起的主要症状为恶心、呕吐、腹泻等胃肠炎症状^[16]。所以在副溶血性弧菌的T3SS中，T3SS2为主要的致病因子，研究T3SS2的分子调控机制至关重要。

在副溶血弧菌中，对CalR功能的研究还处于起始阶段。课题组前期研究表明CalR作为一个全局调控子不仅介导了T3SS1和T6SS2相关基因的转录，还参与了TDH基因的转录^{[8, 10-11]}，所以本文主要研究了CalR对T3SS2基因vopB2的具体调控机制，丰富了副溶血性弧菌的转录调控网络，更进一步揭示了副溶血性弧菌的分子致病机制。