2019, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 郭策, 刘贝贝, 孙明雪, 边佳琪, 魏士平
- GUO Ce, LIU Bei-Bei, SUN Ming-Xue, BIAN Jia-Qi, WEI Shi-Ping
- 北戴河海洋沉积物中L-半胱氨酸脱硫细菌的多样性及其特性
- Diversity and characterization of L-cysteine desulfurizing bacteria isolated from marine sediments in Beidaihe
- 微生物学通报, 2019, 46(7): 1582-1589
- Microbiology China, 2019, 46(7): 1582-1589
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180659
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文章历史
- 收稿日期: 2018-08-23
- 接受日期: 2019-02-13
- 网络首发日期: 2019-02-19
硫在自然界中分布广泛，主要以硫酸盐、硫酸盐矿物和硫化物存在于海水、岩石和碎屑沉积物这三大硫库中，另外还有一小部分硫以单质和有机态的形式存在于自然界和生物体中，全球硫循环主要受控于三大硫库之间的转换[1]。微生物通过对硫的氧化和还原以及脱硫作用，不但可形成含硫的矿物，而且还可以调节各分室内硫的转化，并影响着全球碳和氧的循环[2]，因此在硫的生物地球化学循环中起着重要的作用。
目前对脱硫细菌的研究主要是应用于煤和石油的脱硫工业[3-5]，而半胱氨酸脱硫细菌对有机硫的脱硫作用也是不容忽视的重要部分，研究表明半胱氨酸脱硫细菌广泛存在于土壤、淡水和海洋环境中[6-7]，在微生物硫循环中起着重要的作用。海洋作为地球上第二大硫库，其硫酸盐在无氧条件下通过硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing bacteria，SRB)的作用被还原为H2S，继而与沉积物中的铁发生反应生成黄铁矿[8]；而海洋中的有机硫，包括维生素、氨基酸、缩氨酸和氨基磺酸类等多种物质，是海洋沉积物中含量仅次于黄铁矿的以结合态硫存在的重要化合物[9]，在有氧条件下，脱硫细菌可将这些有机态硫在酶的催化作用下转化为H2S[5, 10]，调节着有机硫向无机硫的转化。
硫酸盐还原细菌被认为主导着海洋中硫酸盐向H2S的转化，但异养细菌对半胱氨酸的酶促脱硫也有助于H2S的生成。然而在目前已有的研究中，对海洋中有机物脱硫细菌的研究仍相对薄弱。本文对海洋沉积物中半胱氨酸脱硫细菌的多样性进行研究，对全面认识海洋中硫的生物地球化学具有重要的意义。
1 材料与方法 1.1 培养基牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，琼脂15.0，pH 7.0。
半胱氨酸培养基(g/L)：L-半胱氨酸2.0，牛肉膏5.0，蛋白胨5.0，酵母粉3.0，NaCl 2.0，(CH3COO)2Pb·3H2O 0.2，琼脂15.0，pH 7.5。
Na2S2O3培养基(g/L)：蛋白胨15.0，眎蛋白胨5.0，葡萄糖1.0，Na2S2O3 0.08，(CH3COO)2Pb·3H2O 0.2，琼脂15.0，pH 7.0。
以上培养基于1×105 Pa下灭菌30 min，备用。L-半胱氨酸和乙酸铅采用过滤除菌的方法，在上述培养基灭菌后，待温度降到50-55 ℃时加入。
1.2 主要试剂和仪器纳氏试剂，上海植茂环保科技有限公司。立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；超净工作台，江苏佳宝净化工程设备有限公司；细菌培养箱，宁波市科技园区新江南仪器有限公司；超低温冰箱，北京五洲东方科技发展有限公司；恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂。
1.3 样品收集本研究所需样品采集于渤海湾北戴河地区潮间带处(N39°83′88.09″，E119°52′99.09″)的海洋沉积物。采样点的海洋沉积物主要由泥质成分组成，所有样品均为表层沉积物(深度为10 cm)，采集后立即转移至50 mL无菌离心管，储存在4 ℃条件下以备后续分析。
1.4 细菌的分离将采集于北戴河地区的10 g海洋沉积物样品加入90 mL无菌水中，混匀，梯度稀释至10-5 g/mL。分别取50、100 μL稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，28 ℃倒置培养3-5 d。根据细菌菌落颜色、形状、大小、质地等特性，分别挑取不同的单菌落进行纯培养；将以上细菌分别悬浮在含有20%甘油的1 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于-70 ℃保藏备用。
1.5 L-半胱氨酸脱硫细菌的筛选将以上保藏的细菌菌株活化，然后接种在半胱氨酸培养基平板的中央，以不接种细菌的半胱氨酸培养基平板为对照。由于产物中存在H2S气体，为保证培养皿的密闭性，需使用Parafilm密封，30 ℃密闭培养5-10 d。观察并记录接种不同菌株的培养基变黑情况。
1.6 L-半胱氨酸脱硫细菌的多样性分别选取能使培养基变黑且变黑强度与特征不同的细菌，提取其基因组DNA，然后采用细菌16S rRNA基因的通用引物27F (5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACCTTGTTA CGACTT-3′)进行PCR扩增[11]。PCR产物经纯化后送至北京康盈创新生物技术公司进行DNA双向测序。将所获得的约1.4 kb的细菌16S rRNA基因序列提交至GenBank以获得登录号，并且在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上进行BLAST分析与比较。选取与提交序列相似性较高的已知菌株的16S rRNA基因序列做参比，与分离筛选得到的脱硫细菌的16S rRNA基因序列一并使用BioEdit和MEGA 4.0等软件构建系统发育树，以确定各菌株的分类关系与进化信息。
1.7 细菌脱硫能力的检验取试管若干，分别加入10 mL融化的半胱氨酸培养基，灭菌后制成斜面。选取上述有代表性的培养基变黑强度和特征不同的细菌，分别接种于斜面培养基上[12]，且每株细菌均制备3个平行样品，并以L-半胱氨酸、乙酸铅和细菌为变量制备对照组。为保证实验环境的密闭性，试管口用棉塞密封，30 ℃恒温培养。分别于第3、5、7天观察并记录不同试管中半胱氨酸培养基变黑的长度，以此判断不同细菌脱硫能力的强弱。
1.8 细菌脱氮能力的检验将已鉴定的脱硫细菌分别接种于装有5 mL半胱氨酸液体培养基的试管中，以不接种细菌的半胱氨酸培养基试管作对照。试管口均用棉塞密封，30 ℃、180 r/min培养5 d。分别吸取2 mL菌液置入便于观察的小玻璃瓶中，再加入100 μL纳氏试剂。静置后与对照组对比，观察其颜色变化。纳氏试剂与氨反应会生成淡红棕色络合物，可根据颜色变化强弱判断细菌是否具有脱氨能力[13]。
2 结果与分析 2.1 细菌的分离与L-半胱氨酸脱硫细菌的筛选从海洋沉积物中共分离得到细菌97株，依次编号并保存。脱硫细菌在酶的作用下可将L-半胱氨酸中的硫脱掉，产生H2S，继而与半胱氨酸培养基中的乙酸铅反应形成PbS黑色固体，以此来筛选脱硫细菌。经筛选，从97株细菌中共获得62株脱硫细菌。根据脱硫细菌在平板上的特征与现象，将其分为四类(图 1)：(1)培养基以接种细菌部位为圆心形成明显黑圈(图 1A)，属于这类的细菌有6株，分别为SH25、SH35、SH46、SH68、SH69、SH72；(2)培养基表面完全变黑，可见明显气体扩散痕迹(图 1B)，属于这类的细菌有12株，分别为SH14、SH18、SH19、SH23、SH42、SH43、SH44、SH74、SH80、SH86、SH87、SH91；(3)仅接种细菌部位培养基变黑，培养基其它位置不变色(图 1C)，属于这类的有44株，以SH08、SH16、SH78、SH83等为代表；(4)培养基和接种部位都不变黑(图 1D)，属于这类的细菌有35株，以SH34、SH57、SH82、SH90等为代表。
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| 图 1 脱硫细菌在半胱氨酸培养基上的特征 Figure 1 Characteristics of desulfurizing bacteria inoculated on the cysteine medium Note: A: SH72; B: SH86; C: SH78; D: SH82. |
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根据L-半胱氨酸脱硫细菌在平板上的筛选结果，得到第一类脱硫细菌(SH25、SH35、SH46、SH68、SH69、SH72)、第二类脱硫细菌(SH16、SH74、SH86)、第三类脱硫细菌(SH08、SH42、SH78)共12株，将其序列提交至GenBank，获得登录号MH778136-MH778147。连同它们在GenBank中相似性达到99%以上的16S rRNA基因参比序列共同构建系统发育树(图 2)。由图 2可知，以上L-半胱氨酸脱硫细菌分别属于4个属，SH08属于红球菌属(Rhodococcus)；SH25、SH68、SH72、SH74属于赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)，SH46、SH69属于动性球菌属(Planococcus)，SH16、SH35、SH42、SH78、SH83、SH86属于芽孢杆菌属(Bacillus)。由此可见，分离得到的L-半胱氨酸脱硫细菌在细菌分类上分布广泛，主要以芽孢杆菌科为主；另外，对在平板上脱硫特征相似的菌株进一步分析表明，它们在属种上没有特异性，如：脱硫出现明显黑圈的第一类脱硫细菌在赖氨酸芽孢杆菌属、动性球菌属和芽孢杆菌属都有分布。
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| 图 2 脱硫细菌和参照菌株的16S rRNA基因系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences from desulfurizing bacteria and reference strains 注：括号内序号为序列的GenBank登录号；分支点上的数字表示1 000次重复后得到的置信值；标尺表示100个核苷酸中有2个被替换. Note: Numbers in parentheses are GenBank accession numbers; Numbers at the branch points indicates bootstrap values obtained after 1 000 replicates; The scale bar corresponds to 0.02 substitutions per nucleotide position. |
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为了精确评价各个菌株对L-半胱氨酸脱硫的能力，排除其它因素的干扰，分别以接种菌株和不接种菌株(SH72)、加入L-半胱氨酸和不加L-半胱氨酸、加乙酸铅和不加乙酸铅6个组合进行了实验(表 1)。结果显示：6种实验组合都没有出现培养基变黑的现象，因此，培养基变黑可以排除其它因素的影响，从而有效地判断是否有L-半胱氨酸脱去的硫与醋酸铅发生了反应。
| 试验 Test |
L-半胱氨酸 L-Cysteine |
乙酸铅 Lead acetate |
菌株 Strain |
培养基颜色变化 Medium discoloration |
| C1 | + | + | - | - |
| C2 | + | - | - | - |
| C3 | + | - | + | - |
| C4 | - | + | + | - |
| C5 | - | + | - | - |
| C6 | - | - | + | - |
| 注：+：阳性；-：阴性. Note: +: Positive; -: Negative. | ||||
将12株脱硫细菌分别接种在含有乙酸铅的L-半胱氨酸培养基斜面中，经30 ℃培养，分别于第3、5、7天观察记录结果(表 2)，由表中可以看出，实验所选择的12株细菌的脱硫能力可分为强、中、弱三类(图 3)。SH68、SH72、SH78、SH74、SH69脱硫能力较强，培养至第7天时，整个培养基几乎全部变黑。SH46、SH86、SH16、SH25脱硫能力中等，培养至第7天时，培养基变黑深度达到整个培养基长度的2/3。SH83、SH42、SH35、SH08脱硫能力较弱，培养至第7天时，培养基变黑深度只限于表层的1/5培养基长度。培养结束后，拔出棉塞，所有接种脱硫细菌的试管均有明显的臭鸡蛋气味，使用湿润的乙酸铅试纸检验均可观察到试纸变黑现象，由此断定试管产生了H2S气体。
| 菌株编号 Strain number |
培养时间(天) Incubation time (d) | ||
| 3 | 5 | 7 | |
| SH68 | 2.65±0.06 | 3.50±0.02 | 5.50±0.00 |
| SH72 | 2.34±0.03 | 3.26±0.05 | 5.50±0.00 |
| SH78 | 2.18±0.01 | 3.20±0.02 | 5.50±0.00 |
| SH74 | 2.12±0.02 | 3.14±0.05 | 4.80±0.03 |
| SH69 | 2.04±0.02 | 3.18±0.02 | 4.52±0.02 |
| SH46 | 1.81±0.00 | 2.62±0.01 | 3.68±0.01 |
| SH86 | 1.70±0.01 | 2.47±0.04 | 3.35±0.08 |
| SH16 | 1.67±0.01 | 2.65±0.02 | 3.61±0.01 |
| SH25 | 1.50±0.02 | 2.50±0.03 | 3.58±0.04 |
| SH42 | 0.78±0.01 | 1.02±0.01 | 1.50±0.05 |
| SH35 | 0.76±0.01 | 0.90±0.01 | 1.18±0.01 |
| SH08 | 0.76±0.00 | 0.90±0.01 | 0.90±0.01 |
| 注：每根试管中培养基长度为5.5 cm. Note: The length of medium in each tube was 5.5 cm. | |||
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| 图 3 脱硫细菌脱硫能力的比较 Figure 3 Comparison of the abilities of desulfurizing bacteria 注：CK：未接种细菌的培养基. Note: CK: The medium without inoculation. |
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根据文献可知，微生物对半胱氨酸的脱硫可分为两类，一是在半胱氨酸脱硫酶的作用下生成丙氨酸和过硫化物中间体，继而与其它硫受体相结合转化为不同含硫辅因子[10, 14]；二是在半胱氨酸脱巯基酶的作用下生成丙酮酸、硫化氢和氨[15]。为进一步确认以上脱硫细菌脱硫的代谢类型，用脱硫细菌的发酵产物采用纳氏试剂进行游离氨的检测。结果显示：这12株脱硫细菌均产生淡红棕色络合物(图 4)，由此断定其产物中存在代谢所产生的氨，因此，该菌株中催化脱硫的酶均为半胱氨酸脱巯基酶。
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| 图 4 纳氏试剂对释放的氨的检测 Figure 4 Assay of released ammonia by Nessler's reagent 注：CK：未接种细菌的培养基. Note: CK: The medium without inoculation. |
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本研究利用牛肉膏蛋白胨培养基从海洋沉积物中共分离得到97株细菌，利用半胱氨酸培养基从中筛选出脱硫细菌62株，占细菌总数的63.92%。根据L-半胱氨酸脱硫细菌在平板上的特征，选了有代表性的12株细菌进行16S rRNA基因序列的分析，结果显示：这12株细菌分别属于赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、动性球菌属(Planococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和红球菌属(Rhodococcus)。其中属于芽孢杆菌属中的细菌数量与种类最多，包含5株细菌，但此类细菌的脱硫能力不一致；其次为赖氨酸芽孢杆菌属，包含4株细菌，且其脱硫能力都比较强；动性球菌属包含2株细菌，脱硫能力均处于中等；红球菌属仅有1株细菌，且脱硫能力较弱。在研究过程中，曾尝试使用Na2S2O3斜面培养基对以上株细菌进一步检验，结果显示培养基不变色。由此可见，以上细菌均可分解有机硫，但不能还原无机态硫。据Clarke[16]报道，相比于以无机硫为底物的培养基，在含有机硫的培养基中产生H2S的细菌种类更为丰富。但考虑到硫酸盐还原细菌大多属于厌氧菌，只有少部分为兼性厌氧菌，且与无机硫反应产生H2S的过程需要还原环境。而在本研究中，分离细菌以及无机物脱硫实验的过程并未提供厌氧环境。这也是分离的细菌中缺乏无机脱硫细菌的重要原因。
本研究筛选得到的12株细菌均为革兰氏阳性菌。分析其生物学分类可以发现，除SH08隶属于放线菌门(Acfinobacteria)外，其他11株细菌均隶属于厚壁菌门(Firmicutes)，这与北戴河地区微生物分布有关。北戴河沉积物中存在丰富的细菌类群，其中以变形菌门(Proteobacteria)为优势种，α-变形杆菌亚门(Alphaproteobacteria)、γ-变形杆菌亚门(Gammaproteobacteria)、δ-变形杆菌亚门(Deltaproteobacteria)以及厚壁菌门(Firmicutes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、绿藻门(Chlorobi)和拟杆菌门(Bacteroidetes)皆有分布[17]。目前尚未在蓝藻门、绿藻门和拟杆菌门中发现脱硫细菌。而变形菌门中发现脱硫细菌多为无机脱硫细菌，如：δ-变形杆菌亚门中的脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、除硫单胞菌属(Desulfuromonas)；γ-变形杆菌亚门中的柠檬酸杆菌属(Citrobacter)等。因此本研究中筛选得到的半胱氨酸脱硫细菌主要为厚壁菌门。
半胱氨酸脱硫细菌是有机物脱硫细菌中的一类，在自然界中常见于生物体内和土壤、河流、湖泊、地下水及它们相应的沉积物中。目前研究最多的是来源于生物体内的病原菌或其粪便中的半胱氨酸脱硫细菌，Guarneros等[18]发现肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的大肠杆菌(Escherichia coli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，以及Basicl等[19]发现人体口腔中大多数梭杆菌属(Fusobacterium)细菌都能够分解半胱氨酸产生H2S。Morra等[6]在土壤中添加加富的L-半胱氨酸，结果显示半胱氨酸在土壤微生物的作用下可产生明显的H2S，但未明确其脱硫细菌的种类。Stilinović等[20]通过平板计数法，发现在多种淡水环境及其对应沉积物中存在大量能产生H2S的半胱氨酸脱硫细菌；Ekimova等[7]通过构建半胱氨酸脱巯基酶基因文库的方法，分别从淡水、海洋和土壤等环境中发现大量的半胱氨酸脱硫细菌，其中以甲基杆菌属(Methylobacterium)为主，另外还包括了部分芽孢杆菌属(Bacillus)。而本研究从海洋沉积物也发现大量半胱氨酸脱硫细菌的存在，但与前人在不同环境下分离的半胱氨酸脱硫细菌有所不同，主要包括了赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、动性球菌属(Planococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和红球菌属(Rhodococcus)。Bahugunal等[21]的研究表明，赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和红球菌属(Rhodococcus)中的某些细菌均可脱去石油中的有机硫，而本研究中所获得的这些菌株均能脱去半胱氨酸中的硫，至于能否脱去石油中的有机硫还有待于进一步研究。
脱硫细菌对有机硫的脱硫作用是在酶的催化下进行的，目前有关脱硫细菌对石油的脱硫机制的研究较多，主要有还原C-S键断裂、氧化C-C键断裂和氧化C-S键断裂3种途径[3-4]。还原C-S键断裂类型是在厌氧条件下，通过脱硫细菌(Desulfovibrio sp.)还原石油中含硫化合物的C-S键生成H2S；而氧化C-S键断裂类型是在有氧条件下，通过对C-S键的氧化生成硫酸盐，采用此途径脱硫的细菌有红球菌属(Rhodococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄单胞杆菌属(Xanthomonas)和分枝杆菌属(Mycobacterium)等脱硫细菌[3]。而细菌对半胱氨酸的脱硫作用主要受两种酶的催化，分别为半胱氨酸脱硫酶(Cysteine desulfurase)和半胱氨酸脱巯基酶(Cysteine desulfhydrase)。半胱氨酸脱硫酶分子中具有保守的赖氨酸和半胱氨酸残基，在催化半胱氨酸脱硫时，赖氨酸和半胱氨酸残基攻击L-半胱氨酸上的巯基，形成与酶结合的半胱氨酸过硫化物中间物，该过硫化物中间物可作为供硫体转化为含硫辅因子，继而参与多种生命活动[10, 14]。半胱氨酸脱巯基酶则是催化L-半胱氨酸生成丙酮酸，并伴随H2S和氨的释放[14]。经检验，本实验从海洋沉积物中所分离得到的脱硫细菌均为含半胱氨酸脱巯基酶细菌，L-半胱氨酸在该酶的作用下生成H2S。经后续实验检验SH08、SH42、SH68、SH72、SH74、SH86均有较好的重金属离子耐受性，可与环境中存在的Pb、Cd等重金属离子发生沉淀反应，不但可去除水体环境中的重金属离子[22]，而且生成的PbS和CdS可作为纳米颗粒材料应用于光电化学领域[23-24]。
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