EB病毒也称为人疱疹病毒4型，它的感染可导致单核细胞增多症，并且与霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤以及鼻咽癌、胃癌相关^[1]。EB病毒可潜伏感染，很难被免疫系统清除。EB病毒编码了多重机制使得其感染的细胞可以逃过免疫细胞如杀伤性T细胞的清除。此前有研究表明EB病毒编码的蛋白BNLF2a可以结合到抗原转运蛋白TAP (Transporter associated with antigen processing)上，进而抑制TAP的抗原转运功能，从而避免EB病毒的抗原被递呈到细胞表面^[2-3]。

TAP在MHC Ⅰ类分子抗原呈递中起关键性作用，其将胞浆内经过蛋白酶体降解后产生的抗原多肽转位到内质网(Endoplasmic reticulum，ER)的内腔中，并在此与MHC Ⅰ类分子结合，肽-MHC复合物随后运输到细胞表面，被CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)识别，诱导机体的细胞免疫清除感染的细胞和肿瘤细胞^[4-6]。

TAP蛋白属于ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白超家族B族，其通过结合和水解ATP来提供能量，跨膜转运不同种类的溶质^[7-8]。TAP蛋白是由TAP1和TAP2组成的异源二聚体，每个亚基由N-末端跨膜结构域(Transmembrane domains，TMD)和C-末端核苷酸结合结构域(Nucleotide binding domains，NBD)组成。NBD位于胞质中，其主要作用是催化ATP的水解并为肽段的转运提供能量。基于结构和生物化学数据，NBDs在ATP的存在下二聚化，其中2个ATP分子在二聚体界面处络合^[9-10]。NBDs在ATP结合和水解中具有不同功能的保守基序，并且这两个复合ATP结合位点在功能上是非等效的。ATP结合使两个NBD二聚化，NBDs的二聚化加上多肽的结合诱导TMD从内向外的构象转换，从而将抗原多肽从胞质侧转移到ER腔内，肽转运和ATP水解紧密耦合，ATP水解又会使TAP复合物重新回到面向细胞内打开的状态^[11]。在ATP结合的NBD二聚体中，两个D-loop在二聚体界面处相互接触。

有报道表明EB病毒的BNLF2a可以通过抑制ATP和抗原多肽结合到TAP上，从而抑制TAP的转运功能^[2-3]。可是BNLF2a如何同时抑制ATP和抗原多肽结合到TAP上？BNLF2a是否抑制TAP的构象变化，抑制TAP后是否使其停留在TMD向细胞质打开的构象或是TMD向内质网腔打开的构象？这些进一步的分子机制还不清楚。鉴于此，本研究选择将TAP蛋白D-loop进行点突变，通过半胱氨酸二硫键交联，首次用此方法研究BNLF2a对TAP构象的影响。为病毒逃逸抗原呈递的具体机制提供了进一步的阐释，为ABC转运蛋白的构象变化研究建立了重要方法。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

pFastBac Dual载体(10712024)，Thermo Fisher Scientific公司；细胞Con A琼脂糖珠子、甲基-β-D-吡喃甘露糖苷、铜/菲啰啉(1 mmol/L CuSO₄/4 mmol/L 1, 10-Phenanthroline，Cu/Phen)、N-马来酰亚胺(N-ethylmaleimide，NEM)，Sigma公司；荧光素标记的和无标记的多肽PRYQKSTEL，上海淘普生物科技有限公司；anti-TAP1抗体(ab83817)、anti-TAP2抗体(ab180611)，Abcam公司；anti-Flag抗体(14793S)，Cell Signaling Technology (CST)公司；Western及IP细胞裂解液、BCA法定量试剂，碧云天生物技术公司；Protein A & G Agarose，Santa Cruz公司；转染试剂BaculoGold Transfection Kit，BD公司；96孔真空过滤板(0.65 μm of polyvinylidene difluoride membranes)，Millipore公司；荧光定量酶标仪(λ_ex/em=485/520 nm)，BMG Labtech公司；Dounce Tissue Grinders (tight)，WHEATON公司。高速冷冻离心机，Eppendorf公司；蛋白电泳仪、化学发光成像系统，Bio-Rad公司；Bio-Tek酶标仪，Applied Biosystems公司；生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 突变株的构建与表达 TAP1和TAP2的突变序列由通用公司合成同时做了密码子优化，所有半胱氨酸替换成丝氨酸等其它氨基酸，仅留下TAP2的213位半胱氨酸以保持TAP的活性。TAP1和TAP2 D-loop上的丝氨酸被突变成半胱氨酸，然后克隆到pFastBac Dual载体中。BNLF2a序列由通用公司合成并在N端融合了Flag标签，然后克隆到pFastBac1载体中。

1.2.2 sf9昆虫细胞转染及杆状病毒扩增与表达 将1.5×10⁶个sf9细胞种板于6孔板中，27 ℃孵育1 h后，细胞贴壁。10 μg pFastBac Dual-TAP转染sf9细胞(根据BaculoGold Transfection Kit说明书操作)。将6孔板置于27 ℃，孵育4 h后弃掉转染试剂，加入3 mL新鲜的SF900 Ⅱ培养液，于27 ℃继续培养7 d，最后产生重组杆状病毒。其病毒量被扩增了三代后，用于感染sf9细胞，3 d后收集过表达TAP或突变体的细胞。采用相同的方法包装编码BNLF2a的杆状病毒并表达蛋白。

1.2.3 膜蛋白的提取 将细胞置于20 mL的冰浴PI混合缓冲液的冰上，用Dounce Tissue Grinders (tight)裂解细胞。然后，将裂解后的细胞于4 ℃、1 000 r/min离心12 min，弃去细胞碎片及核。取上清，4 ℃、20 000 r/min离心30 min，取沉淀即为粗膜重悬于3 mL PBS缓冲液中，并分装保存于-80 ℃。另外，用BCA法测定总蛋白浓度。

1.2.4 肽结合检测 将含TAP的膜抽提物(25 μg总蛋白)与1 μmol/L荧光素标记的多肽RRYQKSTEL在50 μL的结合缓冲液(5 mmol/L MgCl₂ in PBS，pH 7.4)中4 ℃孵育15 min。在96孔真空过滤板中加入100 μL冰预冷的结合缓冲液洗膜蛋白2次，去除未结合的肽。通过γ-计数仪量化膜相关放射性。阴性对照采用200倍的未标记肽(RRYQKSTEL)竞争结合含TAP的膜抽提物。

1.2.5 肽转运检测 将含TAP的膜抽提物(150 μg总蛋白)重悬于50 μL的结合缓冲液[包含3 mmol/L ATP或2单位的三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)]中，加入1 μmol/L的荧光素标记的多肽RRYQNSTC(F)L，32 ℃孵育5 min，然后加入终止缓冲液(含10 mmol/L EDTA的PBS，pH 7.4)，置于冰上终止转运反应。随后离心，将膜蛋白溶解于裂解缓冲液(50 mmol/L Tris/HCl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl₂，1 mmol/L MnCl₂，1% Nonidet P-40，pH 7.4)，冰上裂解20 min，加入Con A琼脂糖珠子，4 ℃过夜，回收N-core糖基化的多肽及转运的多肽，然后用裂解缓冲液洗涤，糖基化的多肽将会被裂解缓冲液中的200 mmol/L甲基-β-D-吡喃甘露糖苷洗脱下来，用荧光定量酶标仪定量。

1.2.6 半胱氨酸交联 将含TAP的膜蛋白(0.5 mg总蛋白)与铜/菲啰啉(Cu/Phen)在100 μL PBS (pH 7.4)中4 ℃孵育0-16 min，加入10 mmol/L N-马来酰亚胺(N-ethylmaleimide，NEM)以终止反应。用500 μL的反应缓冲液(包含10 mmol/L EDTA)洗涤膜蛋白，4 ℃、20 000 r/min离心8 min收集膜蛋白。将膜蛋白重悬于SDS样品缓冲液(含有10 mmol/L NEM)中，通过非还原性6% SDS/PAGE进行分析，并用TAP1抗体和TAP2抗体进行免疫印迹。

1.2.7 免疫共沉淀 取1 mg膜蛋白，加入1%的Digitonin溶解90 min，20 000 r/min离心30 min，取上清加入20 μL Protein A & G Agarose (已用Western及IP细胞裂解液洗涤3遍)，同时加入2 µg anti-TAP2抗体，4 ℃、8 r/min摇动孵育过夜。4 ℃、20 000 r/min离心1 min，弃上清，用Western及IP细胞裂解液洗涤Protein A & G Agarose 3遍。加入20 μL 2×SDS样品缓冲液，100 ℃水浴10 min，12 000 r/min离心10 min。取上清，并通过非还原性6% SDS/PAGE进行分析，并用TAP1抗体进行免疫印迹。

2 结果与分析 2.1 TAP蛋白同源的ABC转运蛋白的结构分析

TAP转运蛋白的晶体结构虽然还未被解析出来，但是一些与TAP同源性较高的三型ABC转运蛋白的晶体结构已经被解析，例如耐药功能相关的小鼠的P-glycoprotein (PDB ID：3G5U)^[12]和细菌的Sav1866 (PDB ID: 2HYD)^[13-15]。对上述两种蛋白的构象进行了分析发现，当ABC转运蛋白Sav1866处于TMD向细胞外打开时，NBD形成二聚体，NBD二聚体界面的D-loop上两个丝氨酸，其距离为2.6 Å (图 1A)。当ABC转运蛋白P-glycoprotein处于TMD向细胞质打开时，NBD不互相结合形成二聚体，NBD二聚体界面的D-loop上两个丝氨酸，其距离为27.9 Å (图 1B)。为了研究TAP是处于NBD分离还是NBD二聚化的构象，通过重新合成TAP1和TAP2基因，TAP的半胱氨酸被替换成丝氨酸等其它氨基酸，仅留下TAP2的213位半胱氨酸以保持TAP的活性，并且D-loop上的丝氨酸被突变成半胱氨酸。合成后的TAP突变体被构建到pFastBac Dual载体上。三型ABC转运蛋白在转运过程中需要在向细胞外打开和向细胞内打开的两种构象交替变化。假设D-loop是TAP的NBD的二体界面，则可以通过在D-loop引入的半胱氨酸是否能形成二硫键来检测其构象。

2.2 TAP突变株的表达

采用编码TAP1和TAP2突变体的pFastBac Dual和编码N端融合Flag标签的BNLF2a的pFastBac1分别转染昆虫细胞系sf9，从而包装编码TAP1和TAP2突变体和BNLF2a的杆状病毒，并进一步扩增病毒。为了验证TAP突变株是否能正常表达，使昆虫细胞系sf9感染编码TAP1和TAP2或编码TAP1和TAP2突变体的杆状病毒。48 h后，收集细胞，按1.2.3的方法提取含有TAP的膜，通过10% SDS/PAGE (20 μg蛋白/道)聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹分析，使用TAP1抗体和TAP2抗体和Flag抗体进行检测。如图 2所示，表达和不表达BNLF2a，突变株与野生株相比，TAP1和TAP2均有表达，因此，此突变株满足本实验的需求，可用于后续转运活性和交联实验。

2.3 BNLF2a抑制TAP突变株的多肽结合活性和转运活性

此前的研究表明BNLF2a可以抑制抗原多肽结合到TAP上从而抑制TAP的多肽转运功能。在本研究构建的TAP突变体中，BNLF2a是否也有类似的机制，抑制TAP结合抗原多肽？为了研究这一问题，用2.2中表达或不表达BNLF2a的生物膜进行了多肽结合实验。结果如图 3A所示，表达了BNLF2a之后，不管是野生型TAP还是突变型TAP，多肽结合的能力都降到原来的20%左右。那么，BNLF2a能否通过抑制TAP的多肽结合活性进而抑制TAP的多肽转运活性呢？为了研究这一问题同样进行了多肽转运实验。实验结果如图 3B所示，表达了BNLF2a之后，野生型及突变型TAP的多肽转运活性均降到原来的20%-30%。因此，BNLF2a能通过抑制TAP突变株的抗原多肽结合活性进而抑制其转运活性。

2.4 TAP突变株ATP结合结构域的二聚化

在ATP结合的NBD二聚体中，2个D-loop在二聚体界面处相互接触，距离很近，这为2个突变后的D-loop实现半胱氨酸交联提供了基础。结果如图 4所示，突变株在Cu/Phen的作用下，在约180 kD大小处可见能被TAP1抗体检测的交联产物。当用100 mmol/L DTT作用后，二硫键被切开而回复为单体，交联产物消失。为了证明该交联产物是TAP1和TAP2的异源二聚体，而不是TAP1和其它蛋白发生的交联，在交联后用TAP2的抗体进行了免疫共沉淀，该交联产物可以被TAP2沉淀下来并且能被TAP1抗体识别。因此证明该产物是TAP异源二聚体。综上所述，D-loop确实在TAP1和TAP2的NBD的二聚体界面上，突变株的半胱氨酸可以发生交联形成二硫键，这一方法可以用来检测TAP是否处于向细胞内关闭NBD结构域保持二聚化的状态，是研究病毒因子影响TAP构象变化的良好系统。

2.5 BNLF2a促进TAP突变株二硫键交联

含有TAP的膜中加入Cu²⁺，于0、1、4、16 min后用N-乙基顺丁烯二烯亚胺(NEM)终止反应。样品在非还原条件下在SDS-PAGE胶中分离，转膜后分别用TAP1和TAP2的抗体检测，结果如图 5A、C所示。Cu²⁺存在的氧化条件下，图 5A中显示了TAP1、TAP2单体及交联后的异源二聚体TAP1和TAP2的位置大小。为了研究EB病毒的蛋白BNLF2a是否影响TAP蛋白的构象变化，在过表达BNLF2a的情况下，对突变株TAP二硫键形成实验进行了检测，如图 5B、C所示。结果表明当过表达BNLF2a时TAP突变株形成二硫键的比例大幅提高。因此，BNLF2a促进了TAP突变株二硫键的形成，表明BNLF2a提高了TAP固定在NBD二聚化，向细胞外打开的构象的比例。

2.6 BNLF2a 1-39抑制TAP突变株的活性

BNLF2a分为N端1-40氨基酸的细胞质区和41-60氨基酸的跨膜区，是细胞质区还是跨膜区发挥了抑制TAP活性的功能目前还不太清楚。为了研究这一问题本研究合成了BNLF2a的N端1-39氨基酸(BNLF2a 1-39)。接着再次检测了TAP野生株和TAP突变株的多肽转运活性，将200 μmol/L的BNLF2a 1-39加入含有TAP的生物膜中，孵育30 min后检测多肽转运能力，结果如图 6A所示。200 μmol/L的BNLF2a 1-39处理可以抑制野生型和突变型TAP的多肽转运活性。同样对突变株TAP二硫键形成实验进行了检测，如图 6B所示，经200 μmol/L的BNLF2a 1-39处理后，TAP突变株形成二硫键的比例明显提高。因此，BNLF2a 1-39促进了TAP突变株的NBDs二聚化，抑制了其多肽转运活性。

3 讨论与结论

Epstein-Barr病毒属于疱疹病毒科，与其它疱疹病毒类似，它可以造成潜伏感染，一旦感染常常终生潜伏在人体内。在机体内，细胞内的病原体主要靠细胞免疫清除，因此细胞免疫在EBV感染中起着关键性作用^[16]。EB病毒感染的细胞如何逃过CTL的杀伤是一个重要的科学问题。其中的机制之一是由于EB病毒编码的蛋白BNLF2a^[2]可以抑制ATP和抗原多肽结合到TAP上，这样TAP就失去转运抗原的能力，EB病毒的抗原就不能通过MHC class I被递呈到细胞表面，被感染的细胞就不被CTL杀伤。

目前BNLF2a抑制TAP的分子机制尚未完全清楚，例如BNLF2a如何同时抑制ATP和抗原多肽结合到TAP。基于ABC转运蛋白的晶体结构和生物化学的实验结果，目前TAP转运多肽的机制模型是：初始状态下TAP蛋白位于一个面向细胞内打开的构象中，NBDs不形成二聚体。TAP装载ATP并结合抗原多肽后，TAP的NBDs会二聚化，这会诱导TMDs的构象变化，变成向细胞外(内质网腔)打开的构象，从而将抗原多肽从胞质侧转移到ER腔内。当ATP水解后，NBDs不再二聚化并触发TMDs向细胞内打开的构象运动^[7]。

假设BNLF2a结合TAP后使其停留在NBDs二聚化TMD向内质网腔打开的构象，当TAP在这一构象时ATP和抗原多肽都无法结合到TAP上。这一假说可以解释为何BNLF2a同时抑制ATP和抗原多肽结合到TAP上。为了验证这一假说，需要检测BNLF2a是否影响NBDs的二聚化。基于TAP同源性较高的三型ABC转运蛋白的晶体结构P-glycoprotein和Sav1866，猜测D-loop可能是NBDs二聚化的界面。因此本研究在D-loop上引入了半胱氨酸，通过二硫键形成的交联实验证实了D-loop确实在NBDs二聚化的界面，二硫键的形成一般需要2个半胱氨酸的硫原子距离在2-3 Å的范围内。这一改造的TAP转运蛋白可以用来研究BNLF2a的抑制机制。本研究结果表明BNFL2a对改造的TAP具有类似野生型TAP的抑制效果，说明改造后的TAP突变体与野生型一样可以被抑制。实验结果表明表达BNLF2a的情况下，TAP二聚化的比例大大提高了，这一结果支持了BNLF2a结合TAP后促进NBDs二聚化的状态这一猜想。相比于哺乳动物细胞，sf9细胞和杆状病毒是可以表达更高水平的TAP和BNLF2a等膜蛋白，更适于生化研究，但是与人体内感染的情形有一定差距，特别是BNLF2a的表达修饰状况在两种细胞中是否一致有待进一步研究。我们还研究了BNLF2a的细胞质区还是跨膜区发挥了促进NBDs二聚化的功能。实验结果清楚表明BNLF2a的细胞质区的多肽足以促进同样位于细胞质的NBDs的二聚化。此前有研究表明BNLF2a是一个TA蛋白(Tail anchor)^[2-3]。我们认为BNLF2a的C端疏水跨膜域帮助其作为TA蛋白，以翻译后的插入的形式定位在内质网膜上。BNLF2a N端的亲水多肽暴露在细胞质，与TAP细胞质部位结合，抑制其构象变化。这一研究为ABC转运蛋白的转运机制研究提供了方法借鉴，也为EB病毒抑制抗原提呈的具体分子机制提供了进一步的阐释。