现如今人们越来越重视生态环境的保护，树木的采伐受到控制，自1998年天然林保护工程实施以来，木屑等原材料日趋紧张，导致生产成本逐年增加^[1]。传统食药用菌生产主要以林木为原料，菌业的快速发展导致“菌林矛盾”日益突出。因此，“以草代木”已经成为当今食用菌产业研究的热点，用这种方式生产食药用菌与传统栽培的食药用菌相比，具有活性成分含量高、易于分离的特点^[2]。红平菇Pleurotus djamor (Rumph.) Boedijn是一种生长在热带、亚热带地区的木腐菌类，子实体色泽鲜艳、味道鲜美、营养丰富，属低脂肪高蛋白食品，含多种人体所需氨基酸、维生素及矿物质，是一种“能吃能观赏”的珍稀蕈菌^[3-6]，其提取物对癌细胞有抑制作用，锌多糖可有效减轻肝脏和肾脏的损伤^[7-8]。

红平菇生长过程中，各种酶在其菌丝体发育中起到不可或缺的作用。门金鑫等^[9]以生物量、纤维素酶酶活、漆酶酶活等为指标筛选出纤维素酶、漆酶活性高的优质蜜环菌菌株用于猪苓栽培。张政研究发现，当草菇菌丝体退化时间延长，多酚氧化酶、漆酶等酶活呈现明显降低趋势^[10]。漆酶和多酚氧化酶都是木质素降解的重要催化剂，可以将木质素芳香族高分子化合物分解为小分子物质供菌丝生长，胞外漆酶活性越强，菌株降解木质素的能力就越强^[10-13]。纤维素酶是一种复合酶，是降解基质纤维素的主要酶类，由羧甲基纤维素酶和滤纸纤维素酶等酶组成，可将纤维素分解成小分子物质供菌丝体生长发育使用^[14]。

关于农业剩余物基质代谢的研究，国内有许多报道，如胡居吾^[15]、冯作山^[16]、刘连强^[17]、张鹏等^[18]先后对灵芝、白灵菇、金针菇进行了“以草代木”栽培基质的研究。目前，红平菇降解农业剩余物代谢基质的研究鲜有报道，因此有必要对适合红平菇菌丝生长的“农业剩余物”基质组分进行研究。

本试验以7种农业剩余物做主料，利用软件Design-Expert 8.0.6.1设计基质配方培养红平菇，探究不同基质组分下其胞外酶活性及菌丝生长速率的差异，以期筛选出适合红平菇菌丝生长的“以草代木”基质配方。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和样品 红平菇，编号2014062001，由吉林农业大学食药用菌种保藏中心提供。

小麦秸秆、水稻秸秆、大豆秸秆、玉米秸秆、玉米芯、花生秸秆、油菜秸秆、杨木屑、白糖、麦麸、石膏粉，由吉林农业大学菌菜基地提供。

1.1.2 主要试剂和仪器 柠檬酸、柠檬酸钠、3, 5-二硝基水杨酸(DNS)、联苯胺、醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯二酚，长春鑫海泰生物科技有限公司。生化培养箱，宁波赛福实验仪器有限公司；多功能酶标仪，BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 初筛培养基的制备 分别称取7种秸秆粉各50 g，代替基础配方(木屑78.0%，麦麸20.0%，石灰粉1.0%，蔗糖1.0%)中的木屑，其他辅料成分不变，等量分装于10个平板(直径80 mm)中，含水量78%，1×10⁵ Pa灭菌40 min，冷却至室温备用。

1.2.2 菌丝生长速率测定 使用5 mm口径的打孔器，沿长满菌丝的PDA平板边缘均匀打孔，将菌块接种至培养基中心，24 ℃黑暗条件下培养6 d，每种培养基5个重复。每隔24 h采用十字画线法测得当天菌丝生长速率，最后计算平均生长速率，即菌丝生长速率。

1.2.3 粗酶液的提取^[19] 准确称取在平板中24 ℃黑暗条件下培养至第6天的菌质2 g，适当研磨后移入试管中，加纯净水20 mL，于37 ℃水浴锅中浸提2 h后，4层纱布过滤，取滤液，定容至25 mL，4 ℃、8 000 r/min冷冻离心10 min，上清液即为粗酶液，5 mL离心管分装，于−80 ℃保存备用。

1.2.4 酶活的测定 漆酶、多酚氧化酶酶活的测定参照韩增华等的方法。漆酶酶活力单位定义：以每毫升培养酶液与底物作用30 min内改变0.1光密度值为一个活力单位(U)。多酚氧化酶酶活力单位定义：以每毫升培养酶液与底物作用30 min内改变0.1光密度值为一个活力单位(U)^[14]。纤维素酶酶活的测定参照安琪等^[20]的方法。纤维素酶酶活力单位定义为：每分钟催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位(U)^[20]。

1.2.5 混合设计配方 采用混料设计(Mixture)中的限制成分上下界的单纯型格子法(Simplex-lattice design)进行设计，利用软件Design-Expert 8.0.6.1对主料中各成分的比例进行优化设计，X₁–X₅均设在0–100%，X为主料，主料成分占整个培养基的75%，其余辅料麦麸、玉米面、豆粕、石灰粉、石膏粉占25%。X₁为小麦秸秆、X₂为油菜秸秆、X₃为花生秸秆、X₄为大豆秸秆、X₅为水稻秸秆。X₁+X₂+X₃+X₄+X₅=100%。对照配方：玉米芯45.0%，木屑30.0%，麦麸15.0%，玉米面5.0%，豆粕3.0%，石灰1.0%，石膏1.0% (表 1)。

1.2.6 评价指数 本试验测定了红平菇菌丝生长时期的4个评价指数：菌丝生长速率、纤维素酶酶活、多酚氧化酶酶活、漆酶酶活。

1.2.7 回归分析 建立菌丝生长速率与各种主料的二次回归模型，分析各基质配比中五组分的变化及交互作用对菌丝生长的影响。通过Design-Expert 8.0.6.1软件的Optimization功能，设定各组分变化范围及期望的响应值，直至达到期望响应值，进行验证试验。

1.2.8 验证试验 优化获得的配方在吉林农业大学菌菜基地与对照配方一起进行验证，每个配方10个重复，并测量其菌丝生长速率、漆酶酶活等4个评价指数，分析结果，判断配方可行性。

2 结果与分析 2.1 7种农业剩余物及木屑的平板培养试验结果

根据7种农业剩余物及木屑的平板培养试验，测得菌丝生长速率做差异显著性分析，发现小麦秸秆做基质菌丝生长速率最高，为6.76 mm/d，其次是大豆秸秆和花生秸秆，分别为6.10 mm/d和5.70 mm/d。木屑做主料时菌生长速率是5.59 mm/d，与油菜秸秆(5.62 mm/d)、水稻秸秆(5.62 mm/d)和玉米秸秆(5.51 mm/d)无差异显著性，但在数值上玉米秸秆较低。玉米芯做基质时菌丝生长速率最低，为5.40 mm/d。因此筛选出小麦秸秆、大豆秸秆、花生秸秆、油菜秸秆和水稻秸秆5种优势主料(图 1)。

2.2 22个配方菌丝生长速率、多酚氧化酶酶活、纤维素酶酶活和漆酶酶活数据统计分析

2.2.1 红平菇菌丝生长速率 菌丝生长速率与各主料之间的回归方程为：

通过分析菌丝生长速率的二次多项回归模型方差(表 2)，结果显示：线性混合模型和二次回归模型的P值都小于0.000 1，二者都达到了极显著水平，相关系数R²=0.894 3，很好地拟合了主料与菌丝生长速率的关系。失拟项小于0.000 1是极显著的，表明失拟误差除了与试验误差有关，还与其他因素呈极显著相关。在回归模型中，方程系数K(X₄)＝6.39 > K(X₁)＝6.06 > K(X₅)＝5.83 > K(X₃)＝5.72 > K(X₂)＝4.95，表明各成分对菌丝生长速率的贡献程度为：X₄ (大豆秸秆) > X₁ (小麦秸秆) > X₅ (水稻秸秆) > X₃ (花生秸秆) > X₂ (油菜秸秆)。交互作用X₁X₂、X₁X₃和X₂X₄是极显著的，表明小麦秸秆与油菜秸秆、小麦秸秆与花生秸秆、油菜秸秆与大豆秸秆交互作用可以显著影响红平菇菌丝的生长。做22个配方7 d菌丝生长直径的差异显著性分析，结果表明：4、7、9、15、18、19号配方与对照配方的菌丝生长速率无显著差异，20、21号配方菌丝生长速率与对照配方有差异显著性并高于对照配方；10、11号配方菌丝生长最慢(图 2)。如图 3所示，小麦秸秆与油菜秸秆、小麦秸秆与花生秸秆可显著提高菌丝生长速率。油菜秸秆与大豆秸秆交互作用不利于红平菇菌丝体的生长。一个配方的C/N会显著影响菌丝生长速率，如冯改静等研究发现适合猴头菌菌丝体生长的C/N范围为28:1-38:1^[21]。根据表 3可以得知，不同的秸秆粉碳氮含量会有差异，因此每个配方的C/N也不相同，从而影响菌丝生长速率。

2.2.2 红平菇多酚氧化酶酶活测定结果 多酚氧化酶活性与各主料之间的回归方程为：

从其二次多项回归模型方差分析中可看出，二次多项回归模型和线性混合模型的方差均达到极显著水平，相关系数R²=0.923 0，很好地拟合了主料基质与多酚氧化酶活性之间的关系(表 4)。在回归方程中，方程系数K(X₂)=3.33 > K(X₃)=2.44 > K(X₅)= 1.94 > K(X₁)=1.91 > K (X₄)=1.74，表明各成分对多酚氧化酶酶活的贡献程度为：X₂ (油菜秸秆) > X₃ (花生秸秆) > X₅ (水稻秸秆) > X₁ (小麦秸秆) > X₄ (大豆秸秆)。根据表 4可知，交互作用X₁X₂、X₂X₃、X₂X₄、X₂X₅与X₃X₄是极显著的，表明其相互配比可以显著影响多酚氧化酶的活性。对这21个配方做差异显著性分析的结果(图 4)表明：2号配方的多酚氧化酶活性最高，4号配方多酚氧化酶活性最低。结合图 5可发现，小麦秸秆与油菜秸秆、油菜秸秆与花生秸秆、油菜秸秆与大豆秸秆、油菜秸秆与水稻秸秆交互作用可显著降低多酚氧化酶活性；花生秸秆与大豆秸秆交互作用可显著提高多酚氧化酶活性。从表 3可以看到，虽然油菜秸秆的多酚氧化酶活性最高，但是其木质素含量相对较少，由此可知除木质素外，还有其他底物能影响多酚氧化酶活性。

2.2.3 红平菇胞外纤维素酶酶活测定结果 纤维素酶活性与各主料之间的回归方程为：

试验结果表明：二次多项回归模型和线性混合模型的方差均达到极显著水平，相关系数R²=0.982 5，很好地拟合了主料基质与纤维素酶活性之间的关系(表 5)。在回归模型中，方程系数K(X₁)=7.12 > K(X₂)=6.44 > K(X₃)=6.05 > K(X₅)=4.49 > K(X₄)=2.46，表明各成分对纤维素酶酶活的贡献程度如下：X₁ (小麦秸秆) > X₂ (油菜秸秆) > X₃ (花生秸秆) > X₅ (水稻秸秆) > X₄ (大豆秸秆)。交互作用X₁X₃、X₃X₄呈极显著水平，表明其在栽培料中相互配比可以显著影响纤维素酶活性(表 5)。做22个配方差异显著性分析可知，利用农业剩余物做主料的21个配方中，有17个配方的纤维素酶活性高于对照配方(图 6)。结合图 7可发现，小麦秸秆与花生秸秆交互作用可显著降低纤维素酶活性，花生秸秆与大豆秸秆交互作用可显著提高纤维素酶活性。由图 6和表 3可以发现，小麦秸秆、油菜秸秆纤维素含量较高，其纤维素酶活性也最高。而花生秸秆的纤维素和半纤维素含量最低，其纤维素酶酶活却高于和纤维素含量较高的水稻秸秆，由此说明花生秸秆中还有大量其他的纤维素酶降解的底物。

2.2.4 红平菇胞外漆酶酶活测定结果 漆酶活性与各主料之间的回归方程为：

试验结果表明：二次多项回归模型和线性混合模型的方差均呈极显著水平，相关系数R²=0.995 8，表明方程模型与试验数据有99.58%的符合度，模型可信度较高，很好地拟合了各主料基质与漆酶活性之间的关系(表 6)。在回归模型中，方程系数K(X₄)=6.21 > K(X₅)= 5.50 > K(X₃)= 5.00 > K(X₂)= 4.67 > K(X₁)=3.99，表明各成分对漆酶酶活的贡献程度为：X₄ (大豆秸秆) > X₅ (水稻秸秆) > X₃ (花生秸秆) > X₂ (油菜秸秆) > X₁ (小麦秸秆)。交互作用X₁X₃、X₁X₄、X₂X₅、X₃X₄是极显著的(表 6)，表明其在栽培料中相互配比可以显著影响漆酶活性。做22个配方差异显著性分析可知，利用农业剩余物做主料的21个配方中，有5个配方的漆酶活性高于对照配方(图 8)。结合图 9可看出，小麦秸秆与花生秸秆交互作用可显著降低胞外漆酶活性；小麦秸秆与大豆秸秆、油菜秸秆与水稻秸秆、花生秸秆与大豆秸秆交互作用可显著提高胞外漆酶活性。由图 8和表 3可以发现，漆酶活性在5种秸秆粉单独做主料时，与木质素含量呈显著的正相关。但当各主料混合配比时，漆酶酶活与木质素含量之间无相关性。由此可知，木质素含量在单一主料中对漆酶活性影响较大，在复合主料中，木质素含量对漆酶活性影响较弱，推测不同的碳氮比会显著影响漆酶的活性。

2.2.5 最优配方预测及验证试验 根据回归方程分析设定各评价指数的期望响应值，优化出一个适合红平菇菌丝体生长的“以草代木”配方：小麦秸秆55.3%、大豆秸秆19.7%、麦麸15.0%、玉米面5.0%、豆粕3.0%、石灰1.0%、石膏1.0%。本试验对该配方进行了验证，验证地点是吉林农业大学菌菜基地。验证结果如表 7所示，验证配方的纤维素酶酶活(7.07 U/g)、漆酶酶活(10.76 U/g)均显著高于对照配方的纤维素酶酶活(4.07 U/g)和漆酶酶活(6.70 U/g)。多酚氧化酶酶活(1.67 U/g)和菌丝生长速率(6.60 mm/d)与对照配方的多酚氧化酶酶活(1.64 U/g)和菌丝生长速率(6.55 mm/d)无显著差异，但数值均高于对照配方。此验证结果表明预测配方在菌丝生长速率、多酚氧化酶酶活、漆酶酶活以及纤维素酶酶活等4个评价指数上均优于对照配方，因此可代替对照配方进行红平菇菌丝的培养，符合本研究的目的要求。

3 讨论与结论

本试验分析了各评价指标之间的相关性，发现红平菇菌丝生长速率与漆酶活性之间无相关性，与贾素巧^[26]研究的猴头菌菌丝生长速率与漆酶活性之间无相关性的结论相符。如在本研究的10号和15号配方中，漆酶活性无差异显著性，但是菌丝生长速率却有较大差异。在本研究中我们还可以看到不同栽培基质对红平菇生长过程中胞外酶活影响较大，与吴周斌等^[19]研究的不同培养料对真姬菇胞外酶活性影响较大的结果相符。不同基质中木质素、纤维素等含量均有较大差异，说明底物对酶活影响很大。分析22个配方纤维素酶活性，发现大多数配方的纤维素酶活性均高于对照配方，与胡传琪等^[27]研究的滑菇菌丝生长时期纤维素酶活性高于木屑基料的结论相符。推测木屑中纤维素含量较秸秆粉少，因此纤维素酶活性比秸秆粉中的低。纤维素是影响纤维素酶活性的主要因素，但本试验中发现有4个配方纤维素酶活性比对照配方低，推测还有其他影响纤维素酶活性的底物。

本研究通过混料设计中的单纯型格子法筛选适合红平菇生长的农业剩余物，试验结果表明：油菜秸秆多酚氧化酶活性最高，花生秸秆与油菜秸秆1׃1交互作用可显著降低多酚氧化酶活性；大豆秸秆基质中多酚氧化酶活性最低，与花生秸秆1׃1交互作用可显著增高多酚氧化酶活性；小麦秸秆纤维素酶活性最高，与花生秸秆秸秆1׃1交互作用可显著降低纤维素酶活性；大豆秸秆纤维素酶活性最低，与花生秸秆1׃1交互作用可显著增加纤维素酶活性；小麦秸秆与花生秸秆1׃1交互作用可显著提高漆酶活性，大豆秸秆与花生秸秆1׃1交互作用可显著提高漆酶活性；油菜秸秆与花生秸秆1׃1交互作用可显著降低菌丝生长速率。由此也可以发现，花生秸秆比较适合做一种调节材料。小麦秸秆和大豆秸秆有利于红平菇菌丝的生长，当大豆秸秆基质中加入少量的小麦秸秆时，可以显著提高菌丝的生长速率。大豆秸秆基质中漆酶活性最高而纤维素酶活性最低；小麦秸秆基质中纤维素酶活性最高而漆酶活性较低。推测大豆秸秆中木质素含量较高、纤维素含量较低，而小麦秸秆中纤维素含量较高、木质素含量较低。

设定各评价指数的期望响应值，最终通过得到一个适合红平菇菌丝体生长的“以草代木”配方：小麦秸秆55.3%、大豆秸秆19.7%、麦麸15.0%、玉米面5.0%、豆粕3.0%、石灰1.0%、石膏1.0%。希望本研究可为以后红平菇代谢基质的研究提供参考依据。