芝麻香型白酒生产过程中的一个重要环节是高温堆积发酵过程，芝麻香型白酒的酒醅堆积过程相当于“二次制曲”，高温堆积工艺促使微生物大量生长繁殖，丰富微生物的种类和质量，促进酒醅中淀粉和蛋白质的分解转化，是形成酒的香气成分或其前体物质的重要过程，为“美拉德反应”提供前驱物质和反应条件^[1-2]。芝麻香型白酒之所以兼具“酱、浓、清”三大香型白酒的优点^[3]，是因为在堆积过程中将高温大曲、河内白曲、生香酵母曲、细菌曲混合在一起，以此作为芝麻香型白酒堆积过程中的糖化发酵剂，这种堆积过程是芝麻香型白酒典型风格形成的关键工序，该过程直接影响酒醅入池后的发酵过程，进而影响最终所产出酒的质量和产量^[4-6]，因此，解析堆积过程中细菌和真菌微生物群落的演替规律对探究此工艺意义重大。

近几年，国内酿酒领域已有越来越多的报道将高通量测序技术应用于浓香型、清香型白酒酿造微生物的研究中^[7-10]。对于酱香型、芝麻香型白酒酒醅的研究主要集中在发酵过程，而对芝麻香型白酒酒醅堆积过程中的生物学机理研究相对较少^[11-14]。跟踪堆积发酵过程，解析堆积发酵过程中微生物群落组成和发酵前后细菌和真菌微生物区系的结构组成和变化规律，可为白酒堆积发酵的机理研究提供一定的理论依据。随着现代分子生物学技术的发展，高通量测序技术(High-throughput sequencing)能够快速对数百万个DNA分子同时进行测序，获得大量数据^[15-16]，已被广泛运用到奶酪等传统发酵食品的微生物群落结构分析中^[17-18]。

本研究以芝麻香型白酒酿造过程中堆积不同时间段的酒醅为样本，使用高通量测序技术分析酒醅细菌16S rDNA的V3−V4区序列和真菌ITS2区序列，从真核微生物和原核微生物两个方面对芝麻香型白酒酒醅堆积工序的微生态进行解析，并结合相应的理化分析数据，如堆积过程的温度、水分、酸度、淀粉、还原糖等变化情况，初步解析堆积过程中微生物的作用机理，探究堆积过程中的主体功能微生物及其演变规律，及其对堆积发酵参数的影响机制，为实现堆积可控化提供参数依据，为实际生产应用提供一定的指导。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

用于理化参数测定的试剂均为国产分析纯；氢氧化钠、斐林试剂、葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；土壤DNA提取试剂盒，Omega公司。PCR仪，Thermo Scientific公司；核酸微量测定仪，Maestro Nano公司；高通量测序仪MiSeq，Illumina公司。

1.2 取样方法

酒醅样品源自古井贡酒调味酒生产车间，根据实验目的，取样方法如下：取样时间为0 (开始堆积)、6、12、16、20、24、28、32、36、40、44 (堆积结束) h，20 h后对堆积的酒醅进行倒堆(倒堆，是操作工艺中的一个环节，对堆积的酒醅翻倒)，每个时间点的样品为堆积各个面的混合样，选取同时生产的两组(编号分别为Z2和Z4)，每组中的各样品一式两份，一份用于理化实验分析，一份用于高通量测序，共计22个酒醅样品。用于理化分析的样品4 ℃保存，用于高通量测序的样品−20 ℃保存。

1.3 高通量测序

高通量测序中的扩增子测序采用Illumina MiSeq的MiSeqPE300，委托北京奥维森生物科技有限公司进行。

细菌16S rDNA V3−V4区的PCR扩增引物为：F：5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；R：5′-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

真菌ITS2区域的PCR扩增引物为：F：5′-GCAT CGATGAAGAACGCAGC-3′；R：5′-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3′。

PCR反应体系：DNA样品30 ng，F和R引物(5 µmol/L)各1 µL，BSA (2 ng/µL) 3 µL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 µL，ddH₂O补足至25 µL。

PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，共25个循环；72℃ 10 min。

构建MiSeq文库用的是测序得到的双端序列数据，首先对测得的fq数据进行过滤处理，过滤Read尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的Reads；然后根据PE测序的Overlap关系将成对的序列拼接(Merge)成一条序列。使用的软件为Trimmomatic、Flash、Pear和USEARCH。OTU聚类分析使用软件QIIME和UPARSE，得出反映微生物群落丰富度的Chaol指数以及反映物种多样性的Shannon指数等。

1.4 理化分析

堆积开始时记录温度数值，固定温度计直到堆积结束，此后跟踪记录不同取样时间的温度。参照文献[19]中的方法，水分直接用干燥法测定，酸度用氢氧化钠滴定法测定，淀粉用酸水解法测定，还原糖用直接滴定法测定。利用SPSS 20.0软件对酒醅样品堆积过程中的理化指标与微生物多样性进行相关性分析。

2 结果与分析 2.1 测序结果

两组堆积过程中共计22个样本中，原核微生物16S rDNA测序共产生539个OTU，真核微生物ITS测序共产生64个OTU，其中16S rDNA共检测出5个门7个纲12个目17个科18个属，ITS共检测出4个门4个纲4个目6个科8个属。Chaol和Shannon指数均表明原核微生物的丰富度高于真核微生物。

2.2 原核微生物群落多样性与群落组成

2.2.1 门水平上的原核微生物多样性 整个堆积过程中，16S rDNA中原核微生物主要是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)，其中绝对优势菌群为厚壁菌门(Firmicutes)。相对丰度比例Z2组厚壁菌门占80.33%、变形菌门14.6%、放线菌门3.49%；在Z4组中厚壁菌门63.51%、变形菌门32.24%、放线菌门3.08%。由图 1可见，在堆积过程中随堆积时间的变化，厚壁菌门含量呈下降的趋势，而变形菌门呈升高的趋势，厚壁菌门类微生物大量减少，变形菌门类微生物大量生长繁殖，直到堆积结束。

2.2.2 属水平上的原核微生物多样性 属水平上原核微生物群落变化情况如图 2所示，18个细菌属分别是Bacillus、Weissella、Acetobacter、Staphylococcus、Klebsiella、Corynebacterium、Cronobacter、Acinetobacter、Lactobacillus、Serratia、Kroppenstedtia、Leuconostoc、Kurthia、Brevibacillus、Comamonas、Brevibacillus、Nocardiopsis和Duganella。其中优势菌主要是Bacillus、Weissella和Acetobacter，这3种菌在Z2组分布占比为69.35%，在Z4组分布占比71.90%。堆积20 h前后微生物群落结构变化较为明显，如魏斯氏菌比例呈减少趋势，醋酸菌比例显著增加。而芽孢杆菌属具有较强的分泌蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶的能力，分解大分子物质形成含氮化合物等风味物质，在堆积过程中具有耐高温、产酶、产香的功能^[20-21]。此外，还有多数优势菌能代谢产酸的菌，说明随着芝麻香型白酒酒醅堆积时间的进行，酒醅酸度增大，优势菌属为耐酸类菌属，为丰富的后期蒸馏酒酒体的丰满度起到了重要的作用。

2.3 真核微生物群落多样性与群落组成

2.3.1 门水平上的真核微生物多样性 由图 3可知，门水平上的分类结构分布较为单一，整个堆积过程中，ITS中优势菌群为子囊菌门(Ascomycota)、接合菌类(Zygomycota)，其中Z2组子囊菌门的相对含量为98.51%，Z4组子囊菌门97.38%，子囊菌门成为绝对优势菌群，为酒醅的入池发酵提供原动力。

2.3.2 属水平上的真核微生物多样性 由表 1可知，优势菌属包括曲霉Aspergillus、酵母属Saccharomyces、毕赤酵母Pichia等，同时堆积生产的两组样品属水平上的整体比例接近。随着堆积时间的延长，堆积酒醅中真核微生物的丰富度呈现降低的趋势。堆积开始时是曲霉属占绝对优势，随后占比迅速降低，24 h后所占比例非常小；随着堆积时间的增加，毕赤酵母和酵母逐渐增多，对发酵酒醅的产香产酒起着重要的作用，20 h左右酵母达到峰值，随后保持平稳。

以Z2组为例具体分析堆积发酵过程中属水平上的优势真核微生物菌群(图 4)，Z2组真菌占比由堆积时的Aspergillus 72.84%、Pichia 13.35%、Saccharomyces 8.88%、Rhizopus 2.67%、Wickerhamomyces 0.79%、Cyberlindnera 0.48%、Hyphopichia 0.36%和Candida 0.13%，到堆积结束时的Aspergillus 5.58%、Pichia 58.9%、Saccharomyces 34.28%、Rhizopus 0.46%、Wickerhamomyces 0.13%、Hyphopichia 0.11%和Candida 0.34%。堆积开始时曲霉比例最高，曲霉能在酸性酿造环境条件下正常生长代谢，分解原料中的淀粉与蛋白质，为发酵提供持续性的动力^[22]。堆积6 h后，曲霉比例大幅下降，表明霉菌类营养物质被消耗分解，毕赤酵母开始大量增多，直到堆积结束时一直占据主要优势，说明它是主要功能微生物，是后续酒醅入池发酵提供产酒产香味物质及其前提物质的菌源。

2.4 微生物群落多样性分析

从图 5细菌和真菌的Shannon指数关系来看，堆积开始后，物种数量逐渐增多，物种越来越丰富。在堆积16 h左右时，细菌和真菌的物种丰富度达到较高水平，尤其是真菌的丰富度达到一个峰值；随后真菌的物种丰度显著减少，可能与部分真菌类微生物被消耗分解有关，酵母类主要有产酒产香功能，霉菌类能够分泌酶并降解淀粉、蛋白质等；在堆积后期，32 h后就能达到一个相对稳定的平衡，可进一步再结合堆积过程中的理化指标进行分析，综合考虑把控堆积时间。

2.5 理化结果分析

堆积过程中温度(图 6)整体呈上升趋势，在20 h倒堆后有降低并再次升高，淀粉的含量在堆积过程中呈下降趋势，堆积初期酒醅营养丰富，微生物代谢较为旺盛，淀粉分解速度较快。还原糖含量从后期所测数据反映出堆积36 h前微生物糖化迅速，之后保持平稳，整个堆积过程的酸度变化波动差约为0.3。

由酒醅样品堆积过程中理化指标与微生物多样性的相关性(表 2)可知，细菌的多样性与水分成显著正相关，与温度、酸度成极显著正相关，与淀粉成极显著负相关。而真菌多样性与其相关性不显著，堆积过程中，细菌将淀粉分解为还原糖。

堆积工序理化指标的分析表明，堆积结束时酒醅还原糖含量达到5%左右，这在另一方面表明堆积工序也是边糖化与边发酵的双边过程，糖化过程为堆积工序中的微生物生长提供碳源，也为后续的窖池高温发酵提供条件。

3 讨论与结论

堆积发酵是芝麻香型白酒生产过程中非常关键的生产工艺过程，整个堆积过程能够大量富集环境中微生物，为入窖发酵创造良好条件，也为芝麻香型白酒的酒体风格形成提供香味成分或香味前体物质。近两年对堆积过程的研究中，2017年江苏洋河酒厂利用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术对芝麻香型不同位置堆积酒醅的风味成分进行了研究，发现堆积中层与底层酒醅的风味变化^[23]。山其木格等^[24]采用较为传统的PCR-DGGE技术研究酱香型白酒酿造中所有的糟醅堆积过程，对堆积糟醅中的微生物种群变化进行跟踪，揭示微生物种群在各个轮次糟醅堆积过程的变换规律，发现堆积发酵过程细菌种类多于真菌种类。2018年陈建新课题组^[25]通过在实验室模拟芝麻香型白酒实际堆积发酵和入窖发酵过程，研究不同堆积发酵条件下微生物菌群演替对入窖发酵过程及原酒品质的影响，发现堆积温度的高低对酒质产生的影响较大。

截至目前对堆积过程中微生态的结构及功能研究仍然在逐步认识阶段，且多数基于传统的生物手段，而不同厂家在堆积方式方面又存在差异，环境微生物也在一定程度上影响堆积工序关键功能微生物群系的结构和功能，进而生产出风格各异的芝麻香型风格白酒。古井是主要的浓香型白酒的代表，但其利用芝麻香型白酒作为调味酒是白酒企业发展的创新模式，对于古井所生产的芝麻香型白酒目前尚无相关研究报道。本研究基于高通量测序技术对古井酒厂所生产的芝麻香型白酒堆积工序过程中的微生态进行了解析，分别针对原核和真核微生物对堆积过程中的主体功能微生物及其演变规律进行了跟踪探究，解析了堆积前后细菌、酵母菌、霉菌等微生物的变化规律。与原核微生物相比，真菌微生物的结构逐步集中，到发酵结束时，毕赤酵母和酵母两者占真菌总量的93%以上，在一定程度上为后续的高温发酵奠定了微生物基础。结合温度变化及水分、酸度、淀粉、还原糖等变化情况的分析结果表明，在堆积过程中，原核微生物丰度多样性高于真核微生物。

堆积过程中原核微生物的结构一直保持较高的丰富度，固态堆积过程是一种存在氧气浓度和温度梯度变化的体系，表层氧气较为丰富，深层氧气含量相对较少，表层温度偏低，深层温度偏高，而不同细菌也存在对氧气和温度不同程度的偏好性，所以堆积工序为多种功能性细菌的生长提供了广泛的空间。前期的研究表明，以吡嗪为代表的杂环类化合物大部分是在堆积过程中生成的，所以堆积过程的高温是合成杂环类化合物的基础，而高温也是功能微生物代谢活动旺盛的表现，更是堆积过程中微生态结构调整的推动力。

堆积过程中微生物的优势菌种随堆积时间的推移也相应有显著性的改变，堆积开始时和结束后物种分布的比例变化较为显著。堆积后期的主要功能微生物为后续酒醅入池发酵提供产酒产香味物质及其前提物质提供菌源。当微生物的相对比例达到相对平衡时，已经起到相应的功能作用，在实际生产中，在保证酒醅微生物发酵达到一定的程度时，可以减少实际的堆积时间，降低生产运营的成本。本研究为实际生产上的工艺优化提供科学依据，有效调控堆积发酵过程，能够进一步清晰芝麻香典型风格形成的核心与基础。