木聚糖酶是一组可降解植物半纤维素成分的水解酶系，在自然界中分布于各种微生物、植物、动物瘤胃等环境^[1]。随着生物技术在工业中的发展，木聚糖酶被广泛应用于食品加工、饲料生产、制浆造纸、能源工业等行业，具有很大的经济价值和应用前景^[2]。由于微生物产生的天然木聚糖酶在产量、酶活性、温度稳定性、pH值稳定性等方面存在着不同的缺陷^[3-4]，阻碍了木聚糖酶在诸多领域的高效应用，因此需要进一步挖掘新的木聚糖酶菌株资源和基因资源，以拓宽木聚糖酶的应用。

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，俗称小龙虾，属甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、蝲蛄科(Cambaridae)、原螯虾属(Procambarus)动物^[5]。小龙虾为杂食性动物，在天然条件下主要摄食有机物碎屑、藻类、水生植物的根、叶及碎片，特别喜食汁多肥嫩的绿色植物，如水浮莲、绿萍和水葫芦等，可见小龙虾具有很强的纤维素降解能力。小龙虾肠道微生物是小龙虾降解纤维素和半纤维素的主要驱动力，因此，在小龙虾肠道内有望筛选到高产木聚糖酶的优良菌株。

目前，国内外对克氏原螯虾的研究主要集中于其行为学^[6-7]、种群结构与分布^[8-9]及疾病与免疫方面^[10-12]，对营养饲料方面的研究也主要集中在蛋白质、脂肪等方面^[13]，而对于小龙虾肠道细菌的相关研究却鲜有报道。本文采用纯培养法，从小龙虾肠道中分离筛选产木聚糖酶的细菌，进行形态学和分子生物学初步鉴定，同时利用16S rRNA基因高通量测序，研究小龙虾肠道内细菌的物种组成，一方面有望分离到全新的高产木聚糖酶的优良菌株，另一方面，也为研究小龙虾肠道菌群结构和纤维素的降解机制提供理论支撑，为创制新型小龙虾饲料开辟新途径。

1 材料与方法 1.1 材料

市售小龙虾，在实验室条件下饲养。

1.2 主要试剂、仪器及培养基

木聚糖，Sigma-Aldrich公司；2×Taq MasterMix，北京宝日医生物技术有限公司；16S rRNA基因序列扩增引物，上海桑尼生物科技有限公司。PCR仪，Bio-Rad公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司。富集培养基(g/L)：木聚糖10.0，KH₂PO₄ 1.0，MgSO₄ 0.5，pH 8.0，1×10⁵ Pa灭菌20 min。筛选培养基(g/L)：胰蛋白胨5.0，NaCl 5.8，木聚糖8.0，酵母膏1.0，葡萄糖1.0，柠檬酸三钠4.5，pH 8.0，琼脂粉20.0，1×10⁵ Pa灭菌20 min。

1.3 产木聚糖酶菌的筛选

选取10只小龙虾，用70%酒精、无菌水依次清洗体表。拉出整个肠道，放于无菌离心管中。用灭菌的匀浆棒匀浆，充分匀浆后的液体即为小龙虾全肠菌悬液。吸取小龙虾全肠菌悬液倒入富集培养基中，37 ℃、120 r/min培养24 h。将富集培养基中的菌液稀释涂平板，涂到筛选培养基中。梯度从10⁻²到10⁻⁷，每个梯度涂2个平行。在28 ℃的恒温箱中进行倒置培养2 d。将筛选培养基上长出的菌分类标记后，用牙签点在筛选培养基上，于28 ℃的恒温箱中倒置培养24 h。用沾了酒精的纸板轻轻刮去培养基表面的菌体，刚果红染色15 min，NaCl脱色30 min，观察水解圈的形成。将有水解圈的菌落在筛选培养基的平板上进行分离纯化。记录水解圈直径和菌落直径大小，并将纯化的菌种−80 ℃甘油保藏。

1.4 菌株的表型特征鉴定

对所筛选菌株进行个体形态观察，参照《伯杰细菌鉴定手册》^[14]和《常见细菌系统鉴定手册》^[15]，对Z-3、Z-4、Z-29和Z-30分别进行明胶液化、V-P试验、接触酶试验、耐10% NaCl试验、丙酸盐利用、柠檬酸盐利用、D-木糖产酸试验、D-甘露醇产酸试验。

1.5 菌株的分子生物学鉴定

采用细菌通用引物27F和1492R进行16S rRNA基因的PCR扩增^[16]。PCR反应体系(50 μL)：DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×Taq MasterMix 25 μL，双蒸水补足到50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min；15 ℃保存。PCR结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，送至上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.6 小龙虾肠道16S rRNA基因高通量测序

采用CTAB方法提取小龙虾肠道总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度，送至武汉基诺塞克科技有限公司进行16S rRNA基因高通量测序。

2 结果与分析 2.1 小龙虾肠道产木聚糖酶细菌的分离与筛选

在筛选培养基平板中以及28 ℃的环境条件下，菌株能够利用培养基中的营养物质进行生长并产生木聚糖酶，使培养基中的玉米芯木聚糖水解并形成透明圈。水解圈直径与菌落直径之比较大的菌株产木聚糖酶能力比较强，反之较弱。从表 1中可以看出Z-3产酶能力最大，其次是Z-4，Z-29、Z-30产酶能力最小。

2.2 分离菌株的鉴定结果与分析

2.2.1 表型特征鉴定 如图 1所示，菌株Z-3、Z-4、Z-29、Z-30均为革兰氏阳性芽孢杆菌，从菌落形态来看，Z-3菌落圆形，扁平，表面干燥；Z-4较规则圆形，乳白色，稍透明，表面光滑；Z-29菌落圆形扁平，边缘整齐，乳白色，表面湿润；Z-30圆形或不规则圆形，灰白色，不透明，边缘整齐，表面光滑凸起。生理生化结果如表 2所示，由《伯杰细菌鉴定手册》^[14]和《常见细菌系统鉴定手册》^[15]可知，4株菌株的生理生化结果与芽孢杆菌属相符。

2.2.2 分子生物学鉴定 将筛选菌株进行16S rRNA基因PCR扩增，得到约1 500 bp的PCR产物(图 2)。根据系统发育树结果(图 3)可知，菌株Z-3属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株Z-4属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，菌株Z-29属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，菌株Z-30属于高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，皆与生理生化鉴定结果相吻合。

2.3 小龙虾肠道16S rRNA基因高通量测序

小龙虾肠道细菌在属水平上的分类(图 4)，Candidatus Bacilloplasma和拟杆菌属细菌数量最多，Candidatus Bacilloplasma占24.93%，拟杆菌属细菌占23.44%，弧菌属细菌占10.11%，不动杆菌属细菌占3.81%，Dysgonomonas占2.99%，Tyzzerella 3占2.06%，气单胞菌属细菌占1.13%，希瓦氏菌属细菌占1.05%，其余的未知菌属细菌占30.48%。

3 讨论与结论

木聚糖酶具有重要的应用价值，在饲料、食品医药、制浆造纸等行业中有着广阔的应用前景^[17]。目前工业应用的木聚糖酶存在着不同的缺陷，阻碍了木聚糖酶在诸多领域的高效应用，进一步挖掘新的木聚糖酶菌株资源和基因资源，仍然显得十分重要^[18]。细菌木聚糖酶具有稳定的酶学特性，发掘和研究高产菌株资源对促进木聚糖酶工业发展具有十分重要的意义^[19]。小龙虾以植物根、叶为食，肠道中生存着大量的纤维素降解细菌，然而目前，小龙虾肠道微生物的相关研究还很少，对小龙虾肠道菌群的种群组成和功能都知之甚少，从小龙虾肠道中筛选产木聚糖酶细菌，有望获得全新的木聚糖酶菌株资源和基因资源，同时对小龙虾肠道菌群进行多样性分析，有助于了解宿主与菌群间的相互作用关系，揭示小龙虾降解纤维素的机制。

利用Illumina平台对16S rRNA基因的一个或多个高变区测序，具有测序深度高、利于鉴定低丰度群落物种的特点，但是高通量测序读长有限，不可能将16S rRNA基因的9个可变区全部测序，所以往往只选择1−3个可变区作为测序区域，单端测序长度为250 bp，双端测序长度为500 bp，测序片段越短，后续对序列进行物种注释时的分辨度越低，只能将微生物注释到属的分类水平^[20]。本论文采用高通量测序研究了小龙虾肠道菌群结构，结果表明小龙虾肠道核心菌群包括Candidatus Bacilloplasma、拟杆菌属、弧菌属、不动杆菌属、Dysgonomonas、Tyzzerella 3、气单胞菌属细菌，为小龙虾肠道菌群多样性研究、纤维素在肠道内的降解机制研究以及小龙虾肠道内功能菌的定向选育提供指导。

本实验从小龙虾肠道中筛选出4株产木聚糖酶菌株，分别编号为Z-3、Z-4、Z-29、Z-30。对4株菌株进行表型和分子生物学鉴定，判定4株菌均属于革兰氏阳性的芽孢杆菌科芽孢杆菌属。其中菌株Z-3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株Z-4为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，菌株Z-29为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，菌株Z-30为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，形态学鉴定结果也相吻合。芽孢杆菌属(Bacillus)是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧生活^[21]，芽孢杆菌属的微生物能够形成芽孢的特性使得他们能够抵抗各种极端环境，而且对各种杀菌剂也具有一定的抵抗力，他们在各种自然环境中都能被分离到^[22]。本实验筛选到的菌株并不是小龙虾肠道中的优势菌群，在属的水平上，小龙虾肠道中的优势菌群为Candidatus Bacilloplasma、拟杆菌属和弧菌属。这与本研究采用的筛选方法以及小龙虾肠道本身的菌群结构有关，芽孢杆菌属多为好氧菌，较易于实验室培养。Candidatus Bacilloplasma被定义为软壁菌门柔膜菌纲，有关Candidatus Bacilloplasma在肠道内的作用研究很少，在肠道内的作用尚不清楚^[23]。拟杆菌属(Bacteroides)是无芽孢、专性厌氧的革兰氏阴性菌。研究发现，许多拟杆菌属菌株具有降解纤维素类的多酶体系，该多酶复合体具有纤维素酶和木聚糖酶活性，可影响纤维素晶体和木质纤维素的降解^[24]，也有研究表明拟杆菌还有助于增强机体免疫力^[25]。弧菌属于弧菌科弧菌属，是一类革兰氏阴性、具极生鞭毛、能运动、无芽孢的短杆状细菌，是引起海、淡水养殖鱼类细菌性疾病最重要的病原菌之一^[26-27]。通过对小龙虾肠道物种组成结构及功能的分析，可以发现小龙虾肠道内还含有大量未知的未分离到(含大量厌氧菌)或者不可培养的纤维素降解菌，这也指示我们对筛选方法进行改进以及通过其他的生物技术手段广泛获得木聚糖酶基因资源。通过认识小龙虾肠道菌群的相互联系，以及微生物与宿主的共生关系，一方面，可以了解肠道菌群与小龙虾疾病和免疫的关系，为小龙虾养殖用益生菌的开发和饲料配方的优化提供依据；另一方面，也为小龙虾纤维素降解机制的研究提供参考。