内生固氮菌是指那些定殖在植物内部与宿主植物联合固氮的微生物，主要是细菌，它们的部分或整个生活周期寄居在植物组织，特别是营养繁殖的组织中生存、繁衍、传播而不会对植物引起明显的损害^[1-2]。对内生固氮菌最早的认识来自于禾本科作物和牧草。如20世纪80年代末以来，Boddey等^[3]先后从甘蔗体内分离得到几种具有特殊生理生化特性的固氮菌，包括Gluconacetobacter (Acetobacter)diazotrophicus、Herbaspirillum seropedicae、Herbaspirillum rubrisubalbicans和Burkholderia spp.^[3]；这些属的固氮菌相继在巴西之后从美洲其他国家、澳洲^[4]和亚洲^[5-7]的甘蔗体内被分离。近年国内外的研究者先后对不同地域的甘蔗、水稻、小麦、燕麦、玉米、大麦、高粱、甘薯及卡拉草等植物的内生固氮菌进行了分离研究，证明植物内生固氮菌资源非常丰富，包括醋酸杆菌属(Acetobacter)^[8]、草螺菌属(Herbaspirillum)^[9]、肠杆菌属(Enterobacter)^[10]、泛菌属(Pantoea)、假单胞属(Pseudommonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)^[11]、克雷伯氏菌属(Klebesilla)^[11-12]、Methylobacterium^[13]、Raoultella terrigena^[14]、Mangrovibacter^[15]、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、固氮弧菌属(Azoarcus)等^[16]。研究证明，内生固氮菌避免了化合态氮的抑制及土著微生物的竞争，更有利于充分发挥固氮效能，分泌固氮产物直接供给植物吸收，表现出更高的固氮效率^[17]。植物内生固氮菌除了能为宿主提供氮素以外，同时具有分泌生长素、溶磷、增强植株抗病性、抗逆境等多方面的促进植物生长作用，具有很大的应用潜力^[17-20]。近年来，大量施用化肥造成的肥料浪费及土壤、地下水体污染已引起了世界各国的广泛重视，减少化肥施用、提高氮肥利用率是当前农业生产的重要任务^{[17, 21]}。随着生态农业和绿色食品的发展，植物内生菌逐渐应用于生物有机肥，因其具有消减化肥和农药过量使用引起的环境质量、食品安全和公众健康的弊端等优势，成为了国内外的研究热点。利用生物固氮是减少氮肥施用量最为有效的途径，生物固氮资源的研究、开发和利用在我国农业可持续发展中占有重要地位^[22]。本文对前期从甘蔗组织上分离筛选获得的一株内生固氮细菌NN08200菌株的固氮促生长特性进行研究，通过菌落和菌体形态特征分析、Biolog细菌鉴定系统和16S rRNA基因序列分析确定菌株的分类地位，测定该菌株的固氮酶活性和溶磷能力，同时测定菌株对甘蔗幼苗的促生长作用，并利用¹⁵N同位素稀释法测定其相对固氮效率，以期为该菌株的进一步研究和应用提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株NN08200从广西南宁糖厂甘蔗种植基地的甘蔗品种新台糖22号植株茎基部组织分离筛选获得，是具有较高固氮酶活性的内生固氮菌，该菌株目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 5438。

供试对照菌株为巴西甘蔗内生固氮菌Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5，由浙江大学农业与生物技术学院提供。

1.1.2 主要试剂和仪器及培养基 蔗糖、葡萄糖、NaCl、KH₂PO₄、MgSO₄、CaSO₄、CaCO₃、Ca₃(PO₄)₂，国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母提取物，北京索莱宝科技有限公司；15%的(¹⁵NH₄)₂SO₄，上海化工研究院；BUG^TM琼脂，Biolog Inc.公司。

PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司；Biolog微生物自动鉴定仪，广州市华粤行仪器有限公司。

培养基按有关参考文献配制：肉汁胨培养基(NA)^[20]，Pikovaskaia培养基(PKO)^[23]，LB培养基和阿须贝无氮培养基(Ashby)^[24]，C₂培养基^[10]。BUG琼脂培养基：57 g BUG^TM琼脂加入到950 mL ddH₂O，调pH至7.3。

1.1.3 供试土壤 盆栽接种试验用土壤为甘蔗试验地栽培土，土壤基本情况：全氮0.147%，全磷0.104%，全钾1.229%，速效氮78.6 mg/kg，速效磷98 mg/kg，有机质28.8 g/kg，pH 6.1。

1.1.4 甘蔗组培苗 供试甘蔗品种为巴西引进品种RB 92-8064 (简称B9)，其组培苗由广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化培养及固氮酶活性测定 菌株的活化培养采用Ashby无氮培养基，固氮酶活性的测定采用乙炔还原法，具体测定方法参照胡春锦等^[11]、孙建光等^[25]的方法进行，以甘蔗内生固氮模式菌株G. diazotrophicus PAL5为阳性对照。

1.2.2 菌株培养性状及菌体形态观察 以平板划线法将NN08200菌株培养于NA和Ashby无氮培养基上，置30 ℃培养箱中培养2 d。观察并记录菌落的颜色、大小、形状。

菌株NN08200活化后接种至5 mL LB培养液，在摇床中30 ℃、200×g培养过夜至对数中后期。取1 mL菌液10 000×g离心5 min，除去上清，然后用无菌水重悬后10 000×g离心5 min洗菌2次，用无菌水悬浮，取10 µL菌液滴在铜网上，用滤纸吸干水分；取一滴1%醋酸双氧铀滴在铜网上染色20−30 s，用滤纸吸干水分后，用电子显微镜观察细菌形态。

1.2.3 菌株的nifH扩增与序列分析 采用菌落PCR方法进行菌株nifH基因的扩增，参照Lin等^[10]的方法进行。培养供试菌株18−20 h，挑取少许菌落作为PCR模板。利用已报道nifH基因扩增通用引物PolyF (5′-TGCGAYCCSAARGCB GACTC-3′)和PolyR (5′-ATSGCCATCATYTCR CCGGA-3′)扩增NN08200的nifH部分序列，以G. diazotrophicus PAL5菌株为阳性对照，以大肠杆菌E. coli DH5α菌株为阴性对照。将nifH扩增产物回收后克隆到pMDTM18-T载体上，通过PCR验证的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果提交GenBank获得登录号并在NCBI进行BLAST比对分析。

1.2.4 菌株的16S rRNA基因序列分析 16S rRNA基因的扩增同样采用菌落PCR方法，扩增产物测序及菌株系统发育分析参照胡春锦等^[11]的方法进行。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI进行BLAST同源性比对，并用软件MEGA 4.0构建菌株的系统发育树。

1.2.5 菌株的Biolog检测 挑取菌株NN08200的单菌落至BUG琼脂培养基，28 ℃培养16−24 h。用无菌棉签将BUG琼脂培养基上的菌体悬浮于0.85% NaCl溶液，调节菌悬液OD₆₀₀为0.2，取150 µL菌液加入Biolog-GN2板，28 ℃培养。分别在4−6 h和16−24 h用Biolog微生物自动鉴定仪及Biolog Microstation 4.20.05系统检测和分析代谢指数。

1.2.6 菌株对无机磷的降解能力测定 参考史国英等^[20]的方法，将供试菌株NN08200以及对照菌株G. diazotrophicus PAL5分别接种到无机磷液体培养基，接种量为1%活化菌液，对照接种等量灭活菌液，于28 ℃、120×g培养5 d后，参照文献[26]采用磷钼蓝比色法测定菌株发酵液中的有效磷含量。

1.2.7 接种效果及联合固氮效率测定 甘蔗栽培前土壤的处理：栽培土经晒干、细化过筛后，向栽培土样中加入丰度为15%的(¹⁵NH₄)₂SO₄并混合均匀，使土样中纯氮含量终浓度达到120 mg/kg。

甘蔗品种B9组培苗的移栽及接种方法参考胡春锦等^[11]。将炼苗后生长基本一致的甘蔗组培苗移栽至上述栽培土中，每桶种3个单株。将菌株NN08200、PAL5活化后分别在LB和C₂液体培养基中培养48 h，6 000×g离心15 min收集菌体，用无菌水悬浮后6 000×g离心15 min，清洗2次后稀释到每毫升1×10⁸−2×10⁸个细胞作为接种菌剂。甘蔗移栽当天以上述菌剂进行灌根接种1次，移栽7、14、21 d后分别用同样的菌剂再灌根接种3次，对照接等量无菌水。90 d时整株收获甘蔗植株，将植株解析成根、茎、叶并烘干至恒重，分别测定菌株对甘蔗的接种效应和联合固氮效率。

参考文献[27]完成植株株高、干物质分析。样品含氮量及¹⁵N同位素含量由河海大学环境学院用碳氮稳定同位素质谱(Sercon Integra-CN)测定。固氮效率根据公式：Ndfa=(1−¹⁵N_fx−¹⁵N_nfx)×100%计算^[28]。式中Ndfa为固氮百分率，¹⁵N_fx为处理样品中¹⁵N原子百分超，¹⁵N_nfx为对照样品中¹⁵N原子百分超。

1.3 数据分析

利用Excel 2003和DPS 9.50分析软件进行数据统计分析，采用Duncan’s新复极差法进行比较。

2 结果与分析 2.1 菌株的联合固氮能力

菌株NN08200在无氮培养基上生长良好，固氮酶活性测定结果显示该菌株固氮酶的乙炔还原乙烯活性约为2 445 nmol C₂H₄/(h·mL)，高于阳性对照巴西甘蔗内生固氮菌模式菌株G. diazotrophicus PAL5的固氮酶活性1.68 µmol C₂H₄/(h·mL)。

利用引物PolyF/PolyR对NN08200菌株进行了PCR扩增，获得了一条大小约400 bp的片段，测序分析结果表明该扩增片段为339 bp的nifH基因序列，证明NN08200菌株含有钼铁固氮酶铁蛋白基因，该菌株为内生固氮菌。该序列已在NCBI登录，登录号为KX539264。利用软件MEGA 4.0构建基于该菌株nifH基因序列的系统发育树(图 1)，结果表明NN08200菌株与甘蔗内生固氮醋酸杆菌G. diazotrophicus PAL5菌株的遗传距离较近，相似性达到99%。

2.2 菌株的分类鉴定结果

2.2.1 菌株的形态和菌落培养性状 电子显微镜下菌株NN08200菌体为直杆状，以周生鞭毛运动，平均大小为(0.5−1.0) µm×(1.0−3.0) µm (图 2A)。菌株在NA培养基上呈淡黄色，菌落圆形，边缘整齐，低凸，光滑。NN08200菌株的形态特征符合泛菌属细菌的基本特征^[29]。菌株在Ashby平板上的菌落较大，透明至半透明菌落，菌落形状不规则，边缘光滑，菌落低凸，质地均匀。

2.2.2 菌株的16S rRNA基因序列分析及系统发育关系 将菌株NN08200的16S rRNA基因序列在NCBI数据库进行在线同源比对，结果显示该菌株与多株泛菌属(Pantoea)细菌的相似性最高，在97%−99%之间。系统发育树(图 3)显示，菌株NN08200与已报道的成团泛菌Pantoea dispersa (MH542330.1)自成一个分支，表明这两个菌株的亲缘关系最近。

2.2.3 菌株的Biolog鉴定系统分析结果 Biolog微生物鉴定系统检测显示12 h时菌株NN08200的碳源代谢谱与数据库中Pantoea agglomerans的匹配度(SIM值)为0.54，说明该菌株与Pantoea agglomerans的相似性较高。

综合菌株的培养性状和菌体形态、16S rRNA基因的序列分析和Biolog鉴定系统分析结果，将菌株NN08200鉴定为肠菌科泛菌属(Pantoea)细菌。

2.3 菌株的溶磷能力分析

研究结果表明，接种菌株NN08200在常用无机磷液体培养基上培养5 d，发酵液中水溶性磷含量最高可达到152.30 mg/L，而接种G. diazotrophicusPAL5菌株发酵液中水溶性磷含量为131.35 mg/L，NN08200在液体培养条件下降解无机磷的效果明显优于PAL5菌株，差异达极显著水平(图 4)。

2.4 菌株接种对甘蔗的促生效应和联合固氮效率

菌株接种效应及¹⁵N同位素稀释法测定菌株相对固氮效率分析结果见表 1。甘蔗组培苗移栽在含有¹⁵N的基质中生长90 d，相比不接种的对照，接种NN08200提高了甘蔗组培苗B9的株高以及根、茎、叶的干重，分别比对照增加23.43%、9.47%、22.04%和27.03%；接种PAL5对B9的促生长作用略低于接种菌株NN08200。两个菌株对甘蔗B9的促生长效果表现在提高植株株高以及根、茎的干重。

接种NN08200菌株的供试B9甘蔗组培苗中¹⁵N浓度低于没有接种的对照甘蔗苗，差异在5%的置信水平显著。接种NN08200菌株甘蔗组培苗的根、茎和叶从空气中获得氮的百分率分别为7.49%、15.02%和10.79%，其联合固氮效率显著优于甘蔗固氮模式菌株G. diazotrophicus PAL5，利用后者接种的甘蔗根、茎和叶从空气中获得氮的百分率分别为3.53%、9.44%和4.87%。

3 讨论与结论

甘蔗是我国最重要的糖料作物，而我国甘蔗主产区蔗地90%以上为旱坡地，土壤保水、保肥能力差，化肥利用率很低，其中生产上氮肥的施用量比世界平均水平高出一倍以上，因此国内甘蔗生产成本明显偏高，缺乏国际竞争力。近年来，受国际糖业的冲击，我国甘蔗和蔗糖产业已呈现下滑趋势^[30]。造成甘蔗产业萎缩的主要原因是甘蔗种植收益近年来已大幅下降，蔗农的积极性受到影响，而造成收益下降的原因除了市场的冲击因素以外，甘蔗种植成本总体过高也是一个重要的原因。我国甘蔗生产上氮肥施用量为500−700 kg/hm²，是巴西平均施氮量的8−10倍，是印度推荐施氮量280 kg/hm²的2倍多^[31]。减少氮肥施用量最为有效的途径是利用生物固氮。生物固氮是地球上固氮作用的重要途径之一，每年的总固氮量中约有60%来自生物固氮，在解决氮素来源问题上有巨大的潜力，生物固氮资源的研究、开发和利用在我国农业可持续发展中占有重要地位^[22]。充分发挥蔗地生态系统中联合固氮菌的固氮促生潜力，对提高我国甘蔗的生产能力和保护并改善甘蔗的生态环境，以及促进我国甘蔗产业的可持续发展具有重要的经济和社会意义^[11]。

本研究筛选到的甘蔗内生固氮菌株NN08200具有较高的固氮酶活性，nifH基因分析结果从遗传型上证明了该菌株的固氮功能，¹⁵N同位素稀释法分析结果显示该菌株与甘蔗的联合固氮效率显著优于甘蔗固氮模式菌株G. diazotrophicus PAL5；同时，菌株NN08200具有良好的溶磷效果，对于缓解我国甘蔗主产区红壤土中的磷素缺乏问题具有潜在的应用价值；盆栽接种试验结果表明该菌株对甘蔗具有显著的促生长作用，接菌处理甘蔗植株的株高以及干重均比对照增长20%以上，这些研究结果均预示了菌株NN08200具有成为固氮生物肥料优良菌种的光明前景。菌株的分类鉴定结果显示菌株NN08200属于泛菌属(Pantoea)细菌。近年来我国研究工作者从不同生态条件、不同植物上均分离筛选获得了内生固氮泛菌属细菌，并且证明该菌属细菌对植物具有良好的固氮促生长作用。如张磊等^[32]从马铃薯上分离获得的内生固氮菌株Pantoea spp. GWR2、GWR3具有极高的产IAA能力，分别为186.07、162.21 μg/mL，GWR2兼具产ACC脱氨酶活性和溶解无机磷的能力；陈静等^[33]研究证明泛菌属细菌为烤烟内生固氮菌的优势菌群；李艳星等^[34]从胡萝卜、白萝卜、紫甘蓝、山药、莲藕、芋头、红薯、生姜、甜菜等多种块根块茎类作物的根、茎部也分离获得了泛菌属内生固氮菌；傅蕾^[35]研究证明从象草中分离筛选获得的内生菌Pantoea sp. PP04也能够显著促进杂交狼尾草生长；覃姚红^[36]研究证明玉米种子内生固氮泛菌属细菌能显著促进小麦生长并提高植株的抗旱能力；此外，泛菌属细菌作为内生固氮菌还从野生稻^[37]、辣椒^[38]、荒漠灌木^[39]、兰科植物等多种植株组织中分离筛选得到^[40]。泛菌属细菌同时也是土壤固氮细菌种群中的重要成员，同时具有固氮、溶磷、解钾和拮抗植物病原菌的功能^[41]。本研究获得的甘蔗内生固氮菌Pantoea sp. NN08200相对于甘蔗固氮模式菌株G. diazotrophicus PAL5还具有容易培养、菌体生长量较大、促生长效果更加明显的特性，具有作为揭示甘蔗联合固氮菌机理研究模式菌株的潜力，该菌株的进一步研究和应用可为建立适应我国生态条件下稳定有效的甘蔗联合固氮体系提供基础。