虾青素(3, 3′-二羟基-β, β-胡萝卜素-4, 4′-二酮)是一种具有强抗氧化性的红色酮类胡萝卜素，其抗氧化能力强于维生素E和其它类胡萝卜素^[1]，具有消炎、改善视力、预防癌症等作用^[2-3]，广泛应用于水产、医药、化妆品和保健品行业^[4]。虾青素在绿藻、酵母和植物中均有发现^[5-6]。雨生红球藻是一种单细胞淡水绿藻，是天然虾青素的最佳来源^[7-8]。尽管雨生红球藻常用于虾青素的生产，却存在着高投入、低产出问题，探寻有效的培养方法提高微藻虾青素的积累量显得尤为重要。

非生物胁迫条件，诸如氮缺陷、强光照等，能引发微藻产生氧化应激反应，即产生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)作为一种信号分子参与到生物信号通路中^[9-10]。NO是一种重要的信号分子，参与植物防御系统应对胁迫条件^[11]。研究表明外源添加一些抗氧化剂能促进胁迫条件下雨生红球藻中虾青素的积累^[12-13]，2, 6-二叔丁基对甲酚(Butylated hydroxytoluene，BHT)是一种人工合成的酚类抗氧化剂，在食品、化妆品、医药和石化产品中应用广泛^[14]。有研究表明，BHT能抑制氧化应激条件下小鼠细胞的脂质过氧化^[15]。BHT影响雨生红球藻虾青素积累的研究还未见报道。

以雨生红球藻为材料，采用适宜浓度的外源BHT处理雨生红球藻细胞，研究BHT对其生长、虾青素积累、信号分子、抗氧化体系和虾青素合成关键酶基因的影响，以探究BHT诱导雨生红球藻虾青素合成的机制。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 藻种 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis) LUGU由本实验室筛选、保存。

1.1.2 主要试剂和仪器 BHT，生工生物工程(上海)股份有限公司；一氧化氮检测试剂盒、活性氧检测试剂盒、SOD、CAT、GSH和GSSG检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；Trizol、逆转录试剂盒、chy和lcy引物以及荧光定量试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；过氧化物酶检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；乙腈，Thermo Fisher Scientific公司。

紫外可见分光光度计，安玛西亚(中国)有限公司；超声波微波组合体系，上海生析超声仪器有限公司；荧光定量PCR仪，Bio-Rad公司；高速冷冻离心机，LaboGene ScanSpeed公司；高效液相仪，Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 雨生红球藻的培养 以Bold’s Basal Medium (BBM)^[16]为基础培养基，将雨生红球藻培养于容积为3 L的鼓泡式光生物反应器中，培养温度为25±1 ℃，光照2 800±100 lx，连续通入0.1 vvm的无菌空气，培养10 d。

1.2.2 BHT处理 将上述的培养液3 500×g离心5 min，弃上清，无菌水洗去培养基再离心，用缺氮的BBM培养基重悬沉淀(使接种量为2.5×10⁵个/mL，培养基总体积为350 mL)，培养于容积为500 mL的鼓泡式光生物反应器中。将BHT溶于乙醇配成浓度为3.5 g/L的母液，加入培养基中使得BHT质量浓度分别为0 (对照组)、1.0、2.0、2.5和3.0 mg/L (保持各组加入相同体积的乙醇)，每个浓度设置3个平行样。温度27±1 ℃，光照12 000±100 lx，持续通入0.04 vvm的无菌空气培养15 d，隔天定期取样，测定藻细胞生物量、虾青素积累量、ROS、NO、POD、CAT、SOD、谷胱甘肽，实时荧光定量检测chy和lcy。

1.2.3 微藻生物量的测定 收集雨生红球藻细胞，冻干，称重。生物量计算公式为：

细胞生物量/(g/L)=藻粉干重(g)/藻液体积(L)。

1.2.4 测定虾青素积累量 采用高效液相法测定雨生红球藻中虾青素的含量。隔天定期取5 mL处于诱导阶段的藻液，3 000 r/min离心5 min，弃上清，水洗3次，加入2 mL甲醇-二氯甲烷(3:1，体积比)，冰水浴2 500 ×g匀浆20 s，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，上清转移至一试管中，重复上述步骤至沉淀物基本呈现无色为止。收集提取液使用滤膜过滤，用高效液相色谱仪测定其浓度，色谱柱为C18柱(Waters，25 cm×4.6 mm，5 mm)，流动相A (二氯甲烷:甲醇:乙腈:水=5.0:85.0:5.5:4.5，体积比)和流动相B (二氯甲烷:甲醇:乙腈:水=25.0:28.0:42.5:4.5，体积比)遵循：8 min B 0%，6 min B 0−100%，51 min B 100%。流速为1 mL/min；检测器为Waters 996光电二极管阵列检测器，进样量20 μL，检测波长为480 nm，积分得到虾青素质量浓度c (mg/L)。虾青素含量计算公式为：

虾青素含量(mg/g)=虾青素质量浓度(mg/L)/细胞生物量(g/L)。

1.2.5 ROS和NO含量测定 细胞内ROS的含量按照活性氧检测试剂盒说明书进行测定。内源NO的检测按照DAF-FM DA (NO荧光探针)的说明书进行。

1.2.6 内源抗氧化物的测定 3种抗氧化酶过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)，分别使用过氧化物酶测试盒、过氧化氢酶检测试剂盒和总SOD活性检测试剂盒进行检测。使用GSH和GSSG检测试剂盒测定藻细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量。

1.2.7 雨生红球藻chy和lcy基因表达分析 使用Primer 5.0设计的chy和lcy酶基因扩增引物(表 1)进行PCR扩增后测序，以此为模板设计荧光定量引物(表 2)。

离心收集诱导期藻细胞，保存于−80 ℃备用。将藻细胞在液氮中磨成粉末状，使用Trizol法提取总RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA，以此为模板按照Shang等^[12]的方法进行RT-PCR扩增，得到chy和lcy基因的相对表达量，以18S rRNA (引物为5′-CGG TCTGCCTCTGGTATG-3′与5′-GCTTGCTTTGAAC ACGCT-3′)基因作为内标来调节RNA的用量和循环数，使内标基因在不同浓度诱导下的表达丰度一致。

1.3 数据处理

每次均设置3个平行样，所有图表中数据为平均值±标准偏差，使用ANOVA (SPSS 19.0)一步法分析实验数据。最小显著性差异进行多重比较检验调查不同试验的组间差异，图中“*”表示同一时间与其他组差异显著(P < 0.05)；“**”表示同一时间与其他组差异极显著(P < 0.01)。

2 结果与分析 2.1 不同浓度BHT对微藻细胞生物量的影响

对照组生物量达到0.62 g/L，2.5、2.0和1.0 mg/L BHT处理组的生物量峰值分别为0.45、0.56和0.58 g/L，3.0 mg/L处理组的细胞生长受到明显的抑制(图 1)，表明低浓度的BHT (1.0 mg/L和2.0 mg/L)处理雨生红球藻时，藻细胞生物量较对照组无显著性变化；高浓度的BHT (2.5 mg/L和3.0 mg/L)会对细胞生长产生显著抑制。

2.2 不同浓度BHT对雨生红球藻虾青素积累的影响 图 2表明，2.5、2.0和1.0 mg/L BHT处理组藻细胞，虾青素含量在13 d达到最高，分别为25.70、31.66和22.30 mg/g，均高于同期对照组的16.94 mg/g；3.0 mg/L的BHT对细胞有明显的抑制作用，其虾青素含量也极低。低浓度的BHT (1.0、2.0和2.5 mg/L)有利于藻细胞虾青素的积累，2.0 mg/L BHT为效果最好的剂量，高浓度的BHT (3.0 mg/L)不利于虾青素的积累。

2.3 BHT处理对雨生红球藻细胞内ROS和NO水平的影响 对照组藻细胞中的ROS水平在培养前期持续增高，第7天时达到最高，随后开始下降(图 3A)；添加2.0 mg/L BHT，胞内ROS水平与对照组增长趋势相同，第5天时达到峰值，然后逐步下降。实验组和对照组细胞内的NO水平均呈现出先下降后上升的变化趋势，但实验组NO水平均高于对照组(图 3B)，表明BHT可有效抑制胁迫条件下雨生红球藻中ROS水平，并促进了NO的合成。

2.4 BHT处理对雨生红球藻细胞内抗氧化系统的影响 BHT对雨生红球藻抗氧化系统的影响，以细胞内抗氧化酶SOD、POD和CAT含量及抗氧化剂GSH含量为表征，如图 4所示。对照组和BHT处理组的藻细胞内SOD活性均呈现出先上升后下降的变化趋势，且处理组自5 d起均显著高于对照组(图 4A)。细胞内POD与SOD水平的变化趋势相似且均高于对照组(图 4B)。与对照相比，BHT的处理提高了培养前期胞内CAT活性，但5 d后无显著性差异(图 4C)；培养期间，实验组的GSH含量显著高于对照组(图 4D)。

2.5 BHT处理对雨生红球藻中虾青素合成相关基因chy和lcy表达量的影响 如图 5所示，2.0 mg/L BHT处理显著提高了培养过程中lcy和chy的表达量，最高值分别出现于培养的第1和3天，且分别比对照提高了7.85和14.42倍。

3 3讨论与结论

Ding等^[17]利用不同浓度的褪黑素诱导雨生红球藻积累虾青素，结果表明，褪黑素可有效促进藻细胞中虾青素的积累，10 μmol/L褪黑素处理高于5和15 μmol/L褪黑素处理的虾青素含量，与BHT一样，过高或过低剂量的外源褪黑素均不利于虾青素的合成。Wen等^[18]研究证明强光照条件下，添加3% (体积比)乙醇诱导雨生红球藻，其生物量较对照组提高了25.3%，同时促进了虾青素的积累，较对照提高了2.03倍，但当乙醇含量达到5% (体积比)时抑制了藻细胞的生长。本实验中BHT添加量对强光缺氮胁迫下雨生红球藻虾青素积累的影响较大，当添加2 mg/L BHT时诱导效果最佳，其虾青素浓度可达31.66 mg/g，比对照组提高了1.87倍，对生物量无明显的促进作用；而当添加3 mg/L BHT时，同样抑制了藻细胞的生长，说明高浓度的诱导剂可能对藻细胞产生了一定的毒害作用。此外，乙醇既可作为碳源促进雨生红球藻的生长，又可作为诱导子促进虾青素的积累；而BHT可能只起到了诱导的作用，通过调控藻细胞内信号分子水平和虾青素合成酶基因表达水平，进而促进了虾青素的积累。

雨生红球藻中虾青素的合成涉及诸多机制调控。已有研究表明，强光照和氮胁迫等条件能促进虾青素的积累，与细胞内ROS的迸发有关，ROS的过量积累又会破坏藻细胞的蛋白和核酸等大分子，对细胞产生毒害作用^[19-20]。NO是一种重要的信号分子，能响应生物和非生物胁迫。外源添加褪黑素时提高了病原体侵染拟南芥中的NO水平，增加了抗性基因表达，从而提高了机体抗性^[21-22]。机体响应胁迫会启动自身的抗氧化系统，体内抗氧化物质的含量或活性提高，用于淬灭过高的ROS，降低胁迫条件对机体的损伤^[23]。此外，胁迫条件下虾青素的大量积累经常会伴随着雨生红球藻生物量和细胞存活率的降低^[24-25]。本试验中，强光缺氮条件下，外源添加2 mg/L BHT下，虾青素含量较对照组提高了1.87倍，而生物量较对照组无显著性变化。这可能是由于外源BHT提高了逆境下藻细胞内抗氧化物质(虾青素、谷胱甘肽和相关抗氧化酶)的含量或活性，清除了胞内过量的ROS，维持了氧代谢平衡的作用，从而提高了藻细胞在强光照缺氮下的抗性，进而促进虾青素积累，并维持微藻正常的生物量。Nanou等^[26]利用BHT诱导真菌Blakeslea trispora，使胡萝卜素和细胞内抗氧化物质的含量得以提高，而胡萝卜素是虾青素合成途径中重要的中间代谢产物。Ding等^[27]研究表明，外源添加适宜浓度的抗氧化剂褪黑素可提高雨生红球藻细胞内的虾青素含量，同时雨生红球藻的生物量无显著变化。Franz等^[28]发现抗氧化剂茴香醚可以刺激微藻产生光保护，降低光氧化胁迫，提高藻细胞抗性。褪黑素和BHT均是抗氧化剂。因此，抗氧化剂可能通过调控非生物胁迫下雨生红球藻中ROS、NO和相关抗氧化酶的水平，从而提高藻细胞内虾青素的积累。

lcy和chy为藻细胞虾青素合成途径上的重要调控基因，先前的研究表明，外源添加水杨酸和氨基环丙烷，可上调雨生红球藻中lcy和chy的表达水平，从而促进了虾青素的积累^[29-30]，这与本文研究结果一致。综上，适量BHT可有效促进强光缺氮胁迫下雨生红球藻中虾青素的积累，这可能与BHT调控细胞内信号分子水平、抗氧化系统及虾青素合成相关基因的表达有关。