微生物学通报  2019, Vol. ${metaVo.volume} Issue (${metaVo.issue}): 1235−1245

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章先, 付子贤, 周一钊, 方维焕, 宋厚辉
ZHANG Xian, FU Zi-Xian, ZHOU Yi-Zhao, FANG Wei-Huan, SONG Hou-Hui
赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮-二联胶体金免疫层析试纸条的制备及应用
Dual flow immunochromatographic assay for simultaneous determination of ochratoxin A and zearalenone in cereal and feed samples
微生物学通报, 2019, ${metaVo.volume}(${metaVo.issue}): 1235-1245
Microbiology China, 2019, ${metaVo.volume}(${metaVo.issue}): 1235-1245
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180407

文章历史

收稿日期: 2018-05-25
接受日期: 2018-08-15
网络首发日期: 2018-08-15
赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮-二联胶体金免疫层析试纸条的制备及应用
章先1,2,3,4,5 , 付子贤1,2,3 , 周一钊1,2,3 , 方维焕1,2,3,4,5 , 宋厚辉1,2,3     
1. 浙江农林大学动物科技学院    浙江  杭州    311300;
2. 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室    浙江  临安    311300;
3. 动物健康检测互联网技术浙江省工程实验室    浙江  杭州    311300;
4. 中澳动物健康大数据分析联合实验室    浙江  杭州    311300;
5. 浙江大学动物科学学院    浙江  杭州    310058
摘要: 【背景】 真菌毒素为真菌的有毒次级代谢产物,混合污染时毒性显著增强,可对人类和动物健康造成严重伤害。制备二联胶体金免疫层析试纸条,实现对常见真菌毒素混合污染的快速监测,具有重要意义。【目的】 制备赭曲霉毒素A (Ochratoxin A,OTA)和玉米赤霉烯酮(Zeralenone,ZEN)金标单克隆抗体,基于免疫层析原理,采用竞争反应模式,建立二联胶体金免疫层析检测法用于污染样品中OTA和ZEN的同时快速检测。【方法】 采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,并标记获得两种真菌毒素金标单克隆抗体,通过优化相关条件,建立稳定的二联胶体金免疫层析检测方法,用于同时检测谷物和饲料样品中的OTA和ZEN。【结果】 制备的OTA和ZEN二联胶体金试纸条对OTA和ZEN的检测限分别为0.625 ng/mL和1.25 ng/mL,且与谷物和饲料中其它真菌毒素(黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、桔青霉毒素、展青霉毒素和呕吐毒素)均无交叉反应,人工添加试验结果准确。对天然样本检测结果表明该方法与LC-MS/MS一致性良好。【结论】 本研究制备的二联胶体金试纸条可用于实际样品中OTA和ZEN的同时快速筛查。
关键词: 赭曲霉毒素A    玉米赤霉烯酮    胶体金    免疫检测    
Dual flow immunochromatographic assay for simultaneous determination of ochratoxin A and zearalenone in cereal and feed samples
ZHANG Xian1,2,3,4,5 , FU Zi-Xian1,2,3 , ZHOU Yi-Zhao1,2,3 , FANG Wei-Huan1,2,3,4,5 , SONG Hou-Hui1,2,3     
1. College of Animal Science and Technology, Zhejiang A & F University, Hangzhou, Zhejiang 311300, China;
3. Zhejiang Provincial Engineering Laboratory for Animal Health Inspection and Internet Technology, Hangzhou, Zhejiang 311300, China;
4. China-Australian Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics, Hangzhou, Zhejiang 311300, China;
5. College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310058, China
Abstract: [Background] Mycotoxins produced by different species of fungi may coexist in single cereal or feed samples, which could become highly toxic for humans and animals. In this context, a dual flow immunochromatographic assay for rapid monitoring mixed mycotoxin contamination has become a necessity. [Objective] Development of the colloidal gold dual immunoassay for simultaneous detection of ochratoxin A and zearalenone in cereal and feed samples. [Methods] Mycotoxins monoclonal antibodies were labeled with colloidal gold nanoparticles. After optimizing the materials, reagents as well as the experimental conditions, a dual flow immunochromatographic assay was developed and tested for determining the ochratoxin A and zearalenone in cereal and feed samples. [Results] The detection limit for ochratoxin A and zearalenone was 0.625 ng/mL and 1.25 ng/mL, respectively. Naturally contaminated cereal and feed samples were analyzed using both immunochromatographic assay and LC-MS/MS, and showed a good agreement between these two methods. [Conclusion] This immunoassay could detect ochratoxin A and zearalenone in cereal and feed samples rapidly and accurately, more easily and at a lower cost.
Keywords: Ochratoxin A    Zeralenone    Colloidal gold nanoparticles    Immunoassay    

赭曲霉毒素(Ochratoxins)主要由赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、疣孢青霉(Penicillium verrucosum)等产生[1],包括赭曲霉毒素A (Ochratoxin A,OTA)、赭曲霉毒素B (Ochratoxin B,OTB)以及赭曲霉毒素C (Ochratoxin C,OTC)等7种化合物。其中OTA因分布最广、毒性最强且具有致癌性和免疫毒性,已被国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅱ B类致癌物质,备受关注[2-3]。玉米赤霉烯酮(Zeralenone,ZEN)由镰刀菌属(Fusarium),如合谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和粉红镰刀菌(Fusarium roseum)等产生,可影响动物机体内分泌功能,导致流产和死胎[4-5]。2种甚至多种毒素混合污染农产品时毒性显著增强[6]

近年来,真菌毒素多重检测方法发展迅速,如利用稀土离子Eu3+和Sm3+作为示踪剂[7]建立的时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA),可实现对呕吐毒素和玉米赤霉烯酮的同时检测;采用液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)同时检测谷物中多种真菌毒素[8]以及利用超高液相色谱(UPLC)同时检测咖啡豆中真菌毒素的混合污染等[9]。这些方法特异性好,灵敏度较高,但操作复杂,耗时较长,无法满足大量样本的快速筛查。胶体金免疫层析技术由于具备快速、简便、低成本的特点,近年来发展迅速,主要包括竞争法和双抗体夹心法[10]。真菌毒素属于小分子,多采用竞争反应模式,待检样本阴性时,检测线显色,待检样本阳性时,检测线不显色。由于胶体金颗粒制备简单且标记过程温和,以免疫层析为基础的多重检测模式目前已成为食品安全检测领域的研究热点[11]

本研究旨在选取OTA和ZEN为检测对象,建立二联胶体金免疫层析检测法,在满足方便、快捷和低成本的同时,实现对谷物和饲料中上述两种真菌毒素的同时快速检测。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

不同真菌毒素标准品、卵白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚砜(DMSO)和氯金酸(Tetrachloroauric Ⅲ acid)购自Sigma公司;山羊抗小鼠抗体购自上海捷宁生物科技有限公司;硝酸纤维素膜(Millipore 180,PALL VividTM170,YN120B,Sartorius UniSart CN140,YNHS120B和YNHS140B)、玻璃纤维、聚酯膜和吸水板等常规耗材购自杭州奥唯生物科技有限公司;OTA和ZEN单克隆抗体(Anti-OTA,Anti-ZEN)、偶联抗原(OTA-OVA/BSA、ZEN-OVA/BSA)为本实验室前期制备;谷物、饲料阴性和天然样本由浙江省检验检疫科学技术研究院提供。

胶体金试纸条制备所需相关设备(划线仪XYZ 3060、贴合机LM4000和切割仪CM4000),BioDot公司;SpectraMax M2酶标仪,Molecular Divice公司;透射电镜为浙江大学农业与生命环境学部公共平台所有。

1.2 胶体金颗粒的制备

胶体金颗粒的制备参考文献[12]。100 mL 0.01%的氯金酸溶液置于磁力搅拌加热器,加热至沸腾时,迅速加入2%柠檬酸钠溶液0.75 mL或0.375 mL,分别制备粒径为20 nm和40 nm的金颗粒,持续加热至溶液颜色均匀稳定,并继续煮沸5 min,室温自然冷却。通过目测法和透射电镜扫描,鉴定所制备的胶体金颗粒。

1.3 金标抗体的制备

1.3.1 胶体金标记抗体最佳pH的确定

取7个2 mL EP管,分别加入1.5 mL胶体金溶液,0.2 mol/L的K2CO3调整胶体金溶液pH依次至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0;0.02 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)稀释抗体(0.1 mg/mL),每管加入150 μL,混匀后室温放置30 min;每管加入150 μL体积分数为10%的氯化钠溶液,混匀后室温静置2 h;反应结束后测定各管液体的吸光度。最适pH下溶液颜色均匀,吸光值最高。

1.3.2 胶体金标记抗体最佳浓度的确定

将待标记单克隆抗体用20 mmol/L的Tris-HCl (pH 7.4)稀释,每100 μL溶液中加入的抗体量分别为1、2、3、4、5、6、7、8和9 μg;将胶体金溶液调至1.3.1中优化的最佳结合pH,分别取1 mL加入9个1.5 mL离心管中;向每个1.5 mL离心管中分别加入100 μL不同浓度的抗体溶液,充分混匀20 min后室温静置10 min;每管内加入100 μL 10% NaCl溶液,混匀,室温静置2 h;反应结束后,测定溶液吸光值,最高吸光值相对应的最低抗体量即为最佳使用量;实际操作中抗体最佳标记量为最佳使用量的120%。

1.3.3 胶体金标记抗体方法

10 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.4)稀释抗体,取50 mL处于最佳标记pH的胶体金溶液,边搅拌边迅速加入待标记抗体,室温混匀作用30 min后,加入BSA蛋白溶液,终浓度为1%,充分混匀作用30 min后4 ℃、2 000xg离心20 min;上清以4 ℃、8 000xg离心30 min后弃上清;使用10 mL 2 mmol/L含有1% BSA的硼酸盐缓冲液(pH 7.4)重悬后,以8 000xg离心20 min,重复2次,洗涤未结合抗体;沉淀用5 mL硼酸盐缓冲液重悬,置于4 ℃保存备用。

1.4 二联胶体金免疫层析试纸条的检测原理

二联胶体金免疫层析试纸条检测示意图与结果判定方法如图 1所示。

图 1 赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮ZEN定性胶体金免疫层析试纸条示意图 Figure 1 Schematic diagram of the dual flow immunoassay for the qualitative detection of ochratoxin A and zearalenone

检测线T-1、T-2分别包被OTA和ZEN偶联抗原,质控线包被山羊抗兔抗体,胶体金标记的OTA、ZEN单克隆抗体和兔源多克隆抗体按最适比例混匀后固定于金标垫。滴加待检样品后,通过比较检测线与质控线颜色的差异对结果进行判定。

1.5 二联胶体金免疫层析检测方法的优化

1.5.1 金标抗体保存液的优化

选取5 mmol/L pH 7.4的硼酸盐缓冲液,分别加入不同浓度的蔗糖(4%、8%、10%、20%)、叠氮钠(0、0.05%)、不同浓度BSA (0、0.5%、1%、2%)配成不同金标抗体保存液。将制备的金标抗体加入配置的保存液中,4 ℃保存1个月,观察金标抗体溶液有无沉淀产生,并同时检测金标抗体活性,选择最佳抗体储存液配方。

1.5.2 免疫层析试纸条包被抗原的选择

分别选取BSA、OVA作为载体蛋白合成的偶联抗原作为检测线包被抗原,比较检测的特异性和灵敏度,选择最优。

1.5.3 免疫层析试纸条组成材料的优化

硝酸纤维素膜(NC膜)的优化:分别选用Millipore 180、PALL VividTM170、Sartorius UniSart CN140、YN120B、YNHS120B和YNHS140B 6种较为常用的NC膜,通过比较流速、检测线与质控线颜色强度和均一性以确定最优NC膜。

金标垫种类和前处理液的优化:3种不同金标垫(SB06、SB08、6613),处理液选择不同摩尔浓度(10、20、50 mmol/L)的Tris-HCl、磷酸盐缓冲液(PBS)和硼酸盐缓冲液(BB) (pH 7.4),分别含不同的蔗糖浓度(0、2%、4%、6%)和牛血清白蛋白BSA (0、0.5%、1%、2%)。并选取不同浓度(0、0.05%、0.25%、0.5%、1%)的Tween-20或TritonX-100作为表面活性剂,以金标抗体干燥后的稳定性和释放效率为标准,选取最优金标垫和前处理液配方。

样品垫种类和前处理条件的优化:本研究对于样品垫,主要针对SB06和SB08择优选择,前处理液的优化同上,最终通过滴加阳性、阴性样品提取液,比较吸收情况以选择最佳样品垫种类和前处理条件。PVC底板和吸水垫对层析体系影响较小,选用常规型号。

1.5.4 胶体金免疫层析相关条件的优化

抗原包被缓冲液的优化:分别对比含3%甲醇的10 mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH 9.0,TBS)、10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4,PBS)、10 mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 9.0,BB)以及50 mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6,CBS)的包被效率,以检测线颜色均匀、清晰且检测灵敏度高的为最优。

硝酸纤维素膜封闭液的选择:分别使用含不同浓度Tween-20 (0.5%和1%)、PEG 2000 (0.5%和1%)、BSA (0.5%和2%)、NaN3 (0和0.01%)的10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)作为封闭液并观察封闭效果。

金标抗体稀释液的选择:2种不同pH值(7.4和8.2)的10 mmol/L碳酸盐缓冲(CBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、硼酸盐缓冲液(BB),加入不同添加物,蔗糖(2%、4%、8%和10%)或海藻糖(2%、4%、8%和10%)、BSA (0.5%、1%和2%)、NaN3 (0、0.05%),比较胶体金试纸条的灵敏度和稳定性。

基质影响的消除:样本萃取时,加入的高浓度有机试剂以及样本中蛋白质、纤维素等均会对层析效果产生影响,即基质效应。检测时需对样本进行稀释,稀释倍数过高会降低检测灵敏度,过低则不足以消除基质影响,本研究将综合考虑,优化得到最佳稀释倍数。

1.5.5 金标抗体与包被抗原浓度的优化

双重检测时,金标垫上需同时固定3种金标抗体,因此需要对不同金标抗体的混合比例进行优化,保证检测阴性样本时,检测线T1、T2与质控线C显色效果一致。

1.6 二联胶体金免疫层析检测方法的建立

按照模式图(图 1),硝酸纤维素膜(NC膜)上T-1、T-2分别包被OTA和ZEN偶联抗原,C线包被山羊抗兔抗体,金标OTA抗体、ZEN抗体和兔源多克隆抗体按比例混合后固定于金标垫,并按图 2所示,将处理后的样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在PVC底板上,每两部分相互重叠,试纸条组装完成后,切割成宽度0.5 cm的试纸条备用。配置不同浓度毒素标准品溶液,取100 μL滴加至加样孔,层析5 min后观察显色结果,判定最低检测限。

图 2 胶体金免疫层析试纸条侧面结构示意图 Figure 2 Sketch map of test strip (side view)
1.7 样本萃取与加标试验

25 g样本置于250 mL三角烧瓶,加入100 mL萃取液(甲醇׃水=7׃3,体积比),剧烈振荡5 min后4 000×g离心10 min后上清经快速定量滤纸过滤,超纯水稀释后使用试纸条进行检测。将经LC-MS/MS检测过的OTA和ZEN阴性样本烘干后,研磨过筛,分别加入OTA或ZEN标准品溶液并充分混匀,室温放置过夜待检。

1.8 胶体金免疫层析试纸条稳定性试验

本研究采用37 ℃加速试验判定试纸条稳定性。将组装好的试纸条装入锡箔袋(1个/袋),每袋放入两包干燥剂,真空包装机压膜包装。包好的试纸条置于37 ℃恒温箱,分别于7、15、30 d取出,采用梯度稀释的标准品溶液验证其检测灵敏度,以评价试纸条稳定性,预测保存期。

1.9 胶体金免疫层析试纸条与LC-MS/MS比较试验

对天然样本(包括玉米、小麦和饲料)同时采用制备的二联胶体金试纸条和LC-MS/MS进行平行检测。

2 结果与分析 2.1 胶体金溶液的鉴定

分别采取目测和透射电镜法对制备的胶体金溶液进行鉴定。

2.1.1 目测法鉴定

图 3A所示,制备的胶体金溶液外观澄清,色泽鲜艳,无颗粒物沉淀,在日光灯下透光度好,且随着颗粒粒径的增大,溶液颜色变深。

图 3 目测法(A)和透射电镜(B)对不同粒径胶体金颗粒的鉴定 Figure 3 Colloidal solution of various diameter gold nanoparticles Note: A: Visualization with naked eyes; B: Images from transmission electron microscopic.

2.1.2 透射电镜观察

透射电镜扫描结果见图 3B,胶体金粒径均匀,与标尺比较,大小与预期相符。

2.2 胶体金与单克隆抗体最佳结合pH和单克隆抗体最佳标记量

OTA、ZEN单克隆抗体与胶体金颗粒最佳结合pH和最佳标记量的优化结果如图 4所示。处于最佳标记pH,胶体金颗粒与抗体吸附效果较好,此时胶体金-抗体复合物光密度较高,如图 4A所示,OTA和ZEN抗体最佳标记pH分别为7.5和6.5。

图 4 单克隆抗体与胶体金颗粒标记最佳结合pH (A)和最佳标记量的优化(B) Figure 4 Optimization results based on monoclonal antibodies labeling pH (A) and quantity (B)

OTA、ZEN抗体标记时,最佳标记浓度时吸光度值最高,抗体过量会影响检测灵敏度。如图 4B所示,OTA和ZEN抗体实际标记量分别为8.4 μg/mL和6.0 μg/mL (实际标记量=最佳使用量×120%)。

2.3 金标抗体的鉴定结果

图 5所示,制备的金标抗体特异性良好,可用于二联胶体金免疫层析试纸条的制备。

图 5 金标抗体的免疫层析效果鉴定 Figure 5 Identification of gold nanoparticles labeled antibodies by lateral flow immunoassay
2.4 金标抗体保存液的确定

5 mmol/L pH 7.4的硼酸盐缓冲液中分别加入不同浓度的蔗糖、叠氮钠、BSA配成不同金标抗体储存液,分别保存金标抗体(4 ℃,1个月),结果发现不加叠氮钠和不加BSA组均出现沉淀,蔗糖含量超过10%后金标抗体稳定性较好,为降低试验成本,选择含蔗糖10%,叠氮钠0.05%,BSA 0.5%的5 mmol/L pH 7.4的硼酸盐缓冲液作为金标抗体储存液。

2.5 胶体金免疫层析试纸条包被抗原的确定

2种金标抗体均与载体蛋白BSA或OVA均无交叉反应。OTA检测时,包被OTA-OVA时灵敏度更高,ZEN检测时,包被ZEN-BSA效果更优。因此选择OTA-OVA、ZEN-BSA作为包被抗原。

2.6 胶体金免疫层析试纸条组成材料的确定

硝酸纤维素膜(NC):对比表明,Sartorius UniSart CN140最优,检测灵敏度较高,点样后5-10 min内可读取结果,竞争免疫反应充分,背景值较低。

金标抗体固定垫和前处理液:将金标抗体在不同金标垫(SB06、SB08、6613)冻干、复溶后比较层析效果,结果表明聚酯膜6613效果最佳,金标抗体5 min左右可释放完全,处理液为20 mmol/L分别含有4%蔗糖、1% BSA和0.25%表面活性剂TritonX-100的硼酸盐缓冲液(BB,pH 7.4)。

玻璃纤维:SB06、SB08在检测时,均能完全吸收100 μL样品,SB08时检测线信号更强,因此选取为后续样品垫材料。处理液配方同上。

2.7 免疫层析相关条件的确定

经优化,抗原包被液确定为含3%甲醇的50 mmol/L碳酸盐缓冲液(CBS,pH 9.6);NC膜封闭液则最终选择10 mmol/L含0.5% Tween-20、0.5% PEG2000、2% BSA和0.02% NaN3的磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4),金标抗体稀释液为10 mmol/L含8%蔗糖、2% BSA和0.05% NaN3的硼酸盐缓冲液(BB,pH 8.2)。样本萃取后选择1:9的稀释比以达到最佳的检测效果。

2.8 二联胶体金免疫层析试纸条检测特异性与检测限

2.8.1 3种金标抗体交叉反应性的验证

结果如图 6所示,3种金标抗体不发生交叉反应,为后续两种真菌毒素的同时检测奠定基础。

图 6 3种金标抗体交叉反应性的测定 Figure 6 The cross-reactivities of three different complex of gold nanoparticles labeled antibodies Note: 1: GNPs-Anti OTA; 2: GNPs-Anti ZEN; 3: GNPs-pAb (rabbit).

2.8.2 金标抗体和包被抗原浓度的确定

为获得最佳检测效果,对OTA-OVA、ZEN-BSA和金标抗体GNPs-Anti OTA以及GNPs-Anti ZEN的浓度进行优化,最终确定OTA-OVA (3.7 mg/mL)的包被浓度为0.06 mg/mL,ZEN-BSA (4.9 mg/mL)包被浓度为0.04 mg/mL,山羊抗兔抗体包被浓度为0.1 mg/mL,10倍稀释后的金标OTA、ZEN单克隆抗体和兔源多克隆抗体的使用比为2:1:1,总喷涂量为60 μL/cm2

2.8.3 二联胶体金免疫层析试纸条检测限的确定

检测OTA时,结果如图 7A所示,浓度为0.625 ng/mL时,T1 (OTA)颜色与C相比,变化明显,说明对OTA标准品的检测限为0.625 ng/mL,检测ZEN时,按照相同的判定方法,ZEN标准品的检测限为1.25 ng/mL,图 7B所示。

图 7 二联免疫层析试纸条对赭曲霉毒素A (A)和玉米赤霉烯酮(B)的检测限 Figure 7 Detecting limits of immunochromatographic strip for ochratoxin A (A) and zeralenone (B) Note: 1-6: Concentrations of OTA 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.312 5 and 0 ng/mL; 7-12: Concentrations of ZEN 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 and 0 ng/mL.

2.8.4 二联胶体金免疫层析试纸条特异性的鉴定

图 8所示,制备的OTA和ZEN二联定性试纸条对常见的真菌毒素均不发生交叉反应,特异性良好(浓度均为5 ng/mL)。

图 8 二联定性免疫层析试纸条对其他真菌毒素的交叉反应性 Figure 8 Cross-reactivities of the dual flow immunochromatographic strip for different mycotoxins

2.8.5 二联胶体金免疫层析试纸条对加标样本的检测

图 9所示,二联胶体金试纸条对OTA检测限为20 μg/kg,对ZEN检测限为40 μg/kg,判断标准为该浓度下检测线显色强度与质控C线相比差异明显。

图 9 二联定性免疫层析试纸条对OTA和ZEN加标样本的检测 Figure 9 Sensitivity of the dual flow immunochromatographic strip for ochratoxin A (A) or zeralenone (B) in spiked samples
2.9 二联胶体金免疫层析试纸条稳定性的验证

按照1.8中所述进行胶体金试纸条稳定性检测,结果表明37 ℃放置30 d后,试纸条检测灵敏度未下降,对OTA和ZEN仍能特异性检出。本试验证明制备的胶体金试纸条稳定性好,至少可在37 ℃保存30 d,胶体金试纸条通常室温放置,因此预测其在室温可稳定保存一年。

2.10 二联胶体金免疫层析试纸条与LC-MS/MS比较

OTA检测时,使用40份天然样本。其中包括玉米、小麦和饲料,由浙江省检验检疫科学技术研究院提供,分别使用二联免疫层析试纸条和LC-MS/MS平行检测,每种方法均重复3次,结果表明,当OTA含量超过20 μg/kg时,二者具有较好的相关性(表 1)。

表 1 二联胶体金免疫层析试纸条和LC-MS/MS对天然样本中OTA进行检测 Table 1 Comparison of strips with LC-MS/MS for the detection of ochratoxin A in cereal and feed samples
Sample No. LC-MS/MS Mean±SD (μg/kg) Strips
1 0.97±0.01 -
2 3.98±0.03 -
3 - -
4 49.24±0.12 -
5 - -
6 1.36±0.02 -
7 - -
8 1.25±0.01 -
9 0.92±0.02 -
10 20.99±1.01 +
11 - -
12 4.18±0.01 -
13 - -
14 1.09±0.01 -
15 - -
16 46.92±0.02 +
17 - -
18 14.87±0.11 -
19 1.01±0.01 -
20 - -
21 18.39±0.03 -
22 0.93±0.01 -
23 27.71±0.03 +
24 20.42±0.07 +
25 0.98±0.03 -
26 32.36±0.14 +
27 22.94±0.02 +
28 - -
29 1.19±0.01 -
30 1.34±0.02 -
31 15.97±0.01 -
32 25.57±0.01 +
33 20.42±0.07 +
34 1.23±0.01 -
35 - -
36 49.55±1.23 +
37 20.01±0.01 +
38 59.88±0.03 +
39 27.71±0.03 +
40 0.91±0.01 -
注:+:试纸条判定阳性;−:试纸条判定阴性.
Note: +: Positive result; −: Negative result.

ZEN检测时,使用40份天然样本。其中包括玉米、小麦和饲料,由浙江省检验检疫科学技术研究院提供。分别使用二联定性免疫层析试纸条和LC-MS/MS平行检测,每种方法均重复3次。结果表明,当ZEN含量超过40 μg/kg时,两种方法相关性较好(表 2)。

表 2 二联胶体金免疫层析试纸条和LC-MS/MS对天然样本中ZEN进行检测 Table 2 Comparison of strips with LC-MS/MS for the detection of zeralenone in cereal and feed samples
Sample No. LC-MS/MS Mean±SD (μg/kg) Strips
1 109.14±0.06 +
2 14.84±0.29 -
3 9.99±0.08 -
4 85.03±0.29 +
5 3.81±0.55 -
6 29.14±11 -
7 38.20±0.21 -
8 29.07±0.16 -
9 21.25±0.11 -
10 65.23±0.10 +
11 3.71±0.15 -
12 3.74±0.08 -
13 169.66±0.10 +
14 17.52±0.29 -
15 - -
16 106.27±1.02 +
17 - -
18 19.21±0.21 -
19 34.20±0.19 -
20 14.01±0.45 -
21 19.34±0.15 -
22 - -
23 10.91±0.28 -
24 16.67±0.05 -
25 3.89±0.04 -
26 - -
27 4.48±0.22 -
28 27.03±0.31 -
29 24.20±0.44 -
30 22.46±0.15 -
31 - -
32 14.27±0.15 -
33 140.75±0.51 +
34 36.86±0.09 -
35 30.34±2.19 -
36 3.32±0.10 -
37 14.41±0.35 -
38 3.28±0.08 -
39 3.56±0.13 -
40 4.05±0.16 -
注:+:试纸条判定阳性;-:试纸条判定阴性.
Note: +: Positive result; -: Negative result.

综上所述,本研究制备的OTA和ZEN二联胶体金免疫层析试纸条快速、便捷且灵敏度高,并在其检测范围内,与LC-MS/MS结果一致性良好,可用于谷物和饲料中两种毒素的快速初筛。

3 讨论与结论

胶体金试纸条显色原理为:金标抗体或抗原在检测线或质控线上发生聚集,形成肉眼可见的颜色反应。因此胶体金粒径会直接影响检测体系的稳定性和灵敏度,粒径过大会阻碍金颗粒对小分子蛋白质的标记,过小则不足以产生可被肉眼识别的颜色信号。相关报道对胶体金粒径的选择并不一致[13-15],本研究中我们分别制备了20 nm和40 nm金颗粒。经比较,20、40 nm胶体金标记抗体后均可获得较高的检测灵敏度,但40 nm金颗粒标记产物稳定性更好,因此,本实验最终选择40 nm胶体金作为最佳抗体标记物。

层析系统主要由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水垫组成。样品垫主要作用为对将待检样本进行初步过滤,调节pH和粘度,并转运至金标垫和检测膜,减缓样本渗透速度,使其均匀展开;金标垫功能为固定金标抗体,决定其释放效果和稳定性;NC膜筛选主要考虑包被效率、层析速度和背景信号等因素。本研究中我们分别对相关材料进行优化,选择聚酯膜6613、玻璃纤维SB08和Sartorius UniSart CN140作为本实验中的样品垫、金标垫和硝酸纤维素膜。

相关缓冲液的浓度、种类和pH同样会影响层析系统的检测效果,如抗原包被缓冲液、金标抗体稀释液、样品垫和金标垫前处理液以及NC膜封闭液等[16]。缓冲液种类主要包括磷酸盐缓冲液(PBS)、硼酸盐缓冲液(BB)和碳酸盐缓冲液(CBS)[16-17],通常为10-50 mmol/L[13, 15, 18],pH一般为7.4-9.0[16, 19-20],并添加不同浓度蔗糖、海藻糖和BSA,保证金标抗体稳定性。在本研究中,我们通过比较检测灵敏度、肉眼观察检测线或质控线信号强度以及评价金标抗体释放效率和稳定性等对缓冲液种类、浓度和pH进行优化。结果表明碳酸盐溶液(CBS)作为抗原包被缓冲液时,包被效率更好,硼酸盐溶液(BB)作为前处理缓冲液时效果更佳;在维持金标抗体稳定性方面,海藻糖和蔗糖无明显差别,BSA和NaN3的加入均有助于增强检测体系稳定性。表面活性剂,例如TritonX-100、Tween-20和Tetronic 1307等同样可提高检测灵敏度,低浓度的表面活性剂可使NC膜的二次湿润,利于样本的迁移。与此同时,本研究发现在样品垫、金标垫前处理液和抗原包被缓冲液中添加TritonX-100和Tween-20后,可获得比其他表面活性剂更好的检测效果。

抗原包被浓度和金标抗体喷涂量通过方阵法确定,以获得最佳的显色效果和灵敏度为依据。制备二联检测层析试纸条时,还需综合考虑两种待检物质的信号强度和检测区间。不同批次偶联抗原和金标抗体效果、浓度存在差异,需经预试,并对抗原浓度和金标抗体稀释倍数进行调整,在满足检测要求后,再组装成试纸条。

样本检测过程涉及待检物质的萃取、萃取液中有机溶剂(甲醇)及样本中蛋白质和纤维素等均会对层析系统稳定性产生影响[21-22],通常选择对萃取液进行稀释以降低其影响。一般来说,稀释度过高会降低检测灵敏度,过低则不足以消除基质的影响。本研究通过对基质影响和检测灵敏度综合考虑,优化得到最佳的稀释比例,达到最优检测效果。

相比常规的酶联免疫检测法(ELISA),试纸条检测时间短、操作简单、检测成本低并可满足大量样本快速检测的需求,可通过肉眼直接对检测结果进行判定。OTA在谷物、豆类、小麦及其制品中限量标准为5 μg/kg,在饲料原料和猪饲料中的限量标准则分别为250μg/kg和50 μg/kg[23],ZEN在食品和饲料中的限量则分别为60 μg/kg和500 μg/kg[24],本研究制备的二联试纸条对OTA和ZEN的检测分别可达到20、40 μg/kg,满足谷物及饲料原料中OTA和ZEN的快速初筛。相比对针对单一目标分子的检测,二联免疫层析试纸条更加快速、高效。

本研究利用前期制备的OTA和ZEN单克隆抗体,建立的二联试纸条为基层检验检疫单位在真菌毒素快速检测方面提供支持,具有很好的应用价值,可大规模推广使用。后期我们将在此基础上结合胶体金读数仪,提高检测灵敏度,实现定量检测。

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