布鲁氏菌是一种革兰氏阴性胞内寄生菌，主要感染牛、羊、猪等家畜和多种野生动物。布鲁氏菌感染后主要引起雌性动物流产和雄性动物不育等症状，感染人则会导致波浪热、虚弱、乏力、关节疼痛等症状，严重者会影响劳动能力和生育能力。人类主要是通过接触感染的动物或者摄入被污染的食物以及实验室接触等方式感染。1993年Goldbaum等从牛型布鲁氏菌中提取出一种18 kD的胞质蛋白^[1]，之后证明其是一种2, 4-二氧四氢蝶啶合成酶(Lumazine synthase，LS)，即布鲁氏菌LS蛋白(BLS)^[2]。目前对BLS的研究多集中在其结构与功能的关系上。本文就布鲁氏菌BLS的研究进展作一综述，以期为BLS后续的研究和应用提供参考。

1 BLS的结构及其特点

2, 4-二氧四氢蝶啶合成酶广泛存在于动植物及微生物中，为催化核黄素生物合成途径倒数第二步的酶。这种酶最显著的特征之一是在不同物种中具有空间结构差异：其分为五聚体结构和二十面体结构，它们由几乎相同的结构单体单元组成。五聚体结构由5个18 kD单体组成，每个单体与相邻单体充分接触。二十面体结构由60个LS单体组成，它们排列成12个五聚体，具有二十面体532对称性的衣壳。目前研究过的所有LS的活性位点都位于五聚模块中相邻亚基之间的界面处^[3-4]。

布鲁氏菌属中具有LS酶活性的蛋白有2个，分别为RibH1和RibH2。流产布鲁氏菌染色体I上ribH1基因编码产物的结构为上面提到的五聚体，因此推测ribH1是布鲁氏菌属中的功能性LS。位于染色体Ⅱ上的ribH2基因编码的蛋白，其空间结构不同于上面提到的五聚体结构和二十面体结构，催化活性较低，是一种毒性因子^[5-8]。它的空间结构是由2个稳定的五聚体结构组成的十聚体，由10个18 kD的小亚基紧密结合而成。由于十聚体结构高度稳定，使其热稳定性增高，化学性质更加稳定，这一特性赋予它超强的免疫力^[4]。而且，它可以在不同的条件下可逆地展开和重新折叠。其10个N-末端有暴露性和灵活性，因此可在其N端插入外源肽或蛋白质而不破坏其折叠^[9]。本文所综述的即为ribH2基因编码的BLS蛋白。

2 BLS的应用 2.1 用于布鲁氏菌病的诊断

由于病原学方法的敏感性较低，通常首选血清学试验来进行人和动物布鲁氏菌病的诊断。根据脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)分子的完整性，将布鲁氏菌分为粗糙型和光滑型。传统血清学技术(即凝集试验)的一个主要缺陷是，用于诊断由光滑型布鲁氏菌引起感染的优势抗原不适于诊断粗糙型所引起的感染，反之亦然。因此，研究布鲁氏菌共有的抗原对于诊断具有重要的意义。近年来已经研究了许多这样的抗原，BLS即为其中一种。Cassataro等^[10]分别包被布鲁氏菌CP24、BLS以及CP24和BLS两种蛋白，建立ELISA方法对分别由光滑型和粗糙型的布鲁氏菌感染的人和犬的血清进行检测。结果显示，包被CP24和BLS的ELISA方法比单独包被CP24或BLS更加敏感，并且与包被细胞质蛋白的ELISA方法一样敏感。这与文献[11-12]报道的结合BLS抗原可以用于布鲁氏菌病的诊断结果是一致的。鉴于LS蛋白在动植物和微生物中广泛存在，我们对牛种布鲁氏菌2308的BLS的氨基酸序列进行了同源比对，结果表明该蛋白与人苍白杆菌、多种根瘤菌和农杆菌的LS蛋白具有较高的一致性(Identities > 60%)。因此，布鲁氏菌的LS作为诊断抗原时是否会与其他病原的LS蛋白产生的抗体发生交叉反应，仍需进一步实验确定。

2.2 用于布鲁氏菌病亚单位疫苗的研发

2.2.1 利用BLS的免疫原性制备亚单位疫苗

免疫BLS可以激发机体抗原特异性细胞应答产生IFN-γ，从而对宿主产生保护力。因此BLS是一种比较理想的布鲁氏菌病亚单位疫苗的候选者^[13]。Velikovsky等将携带BLS基因的质粒DNA (pcDNA-BLS)注射到BALB/c小鼠中，可刺激机体产生抗体和Th1细胞介导的免疫应答，并能有效地对抗布鲁氏菌的攻击，而将外源重组表达的BLS (rBLS)免疫小鼠只表现较强的体液免疫而缺乏特异性细胞反应，因此无法保护小鼠免受布鲁氏菌的攻击^[14]。如将rBLS连同佐剂(IFA、AI和MPA)一起免疫小鼠后，均可诱导脾细胞产生高水平的IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10，并可抵御布鲁氏菌的感染，而这种作用与使用的佐剂类别无关^[13]。

2.2.2 利用BLS作为载体制备亚单位疫苗

BLS具有高度稳定的十聚体结构，有很好的免疫原性。这种特征类似于大肠杆菌不耐热肠毒素(EtxB)和霍乱毒素(CtxB)的β亚基的特征^[3]。这两种毒素在体内组装成异常稳定的同型五聚体复合物，在多种蛋白质变性条件下仍可保持四级结构^[3]。这种极强的稳定性以及EtxB和CtxB五聚体的固有免疫原性使它们作为疫苗运载工具成为可能。值得注意的是，BLS的热稳定性优于EtxB (T_m值为84 ℃)和CtxB (T_m值为75 ℃)^[3]。因此，BLS是一种很有价值的抗原以及表位聚合物载体，是开发亚单位疫苗的潜在候选蛋白，可以和布鲁氏菌蛋白一起制作亚单位疫苗。目前研究比较多的是布鲁氏菌rOmp31-BLS蛋白疫苗和布鲁氏菌BLS-L7/L12重组亚单位疫苗。

单生苗等^[15]发现重组Omp31-BLS免疫家兔后可增强Omp31的免疫原性，刺激家兔产生比单独免疫Omp31蛋白更高的抗体滴度。此外，还有一部分研究也证明了Omp31-BLS重组蛋白作为布鲁氏菌病疫苗的可能性^[16-18]。

周丽丽^[19]制备了BLS、L7/L12、BLS-L7/L12重组蛋白疫苗和重组DNA疫苗，以及减毒沙门氏菌为载体的BLS-L7/L12重组蛋白疫苗和重组DNA疫苗，分别免疫BALB/c小鼠，ELISA测定抗体水平结果显示，各实验组均能诱导产生特异性抗体。布鲁氏菌544A强毒株对免疫BALB/c小鼠攻毒试验证明，所构建的疫苗株都具有一定的免疫保护性，双价疫苗优于单价疫苗，DNA疫苗优于蛋白疫苗，减毒沙门氏菌活载体双价基因疫苗略优于DNA疫苗。此研究证实了布鲁氏菌L7/L12和BLS都有一定的免疫原性和免疫保护性，BLS-L7/L12双价融合疫苗免疫原性比单价疫苗好，说明BLS可加强L7/L12的免疫刺激作用。还有研究以布鲁氏菌L7/L12-BLS融合蛋白为抗原免疫家兔，诱导产生了高水平的IgG，也证明了L7/L12-BLS融合蛋白具有免疫保护力^[20]。

2.3 用于其他病原疫苗的研究

BLS不仅可以用于制备布鲁氏菌病亚单位疫苗，还可以用于制备其他细菌病、病毒病或者寄生虫疾病的亚单位疫苗。

2.3.1 细菌疫苗的研究

目前以BLS作为载体的细菌疫苗研究较多的主要是产志贺毒素大肠杆菌疫苗，所选用的抗原一般为志贺毒素2的B亚基(Stx2B)。

一些研究表明，在交配前用以BLS为载体构建的新型免疫原BLS-Stx2B免疫BALB/c雌性小鼠，免疫后在雌鼠的乳汁、雌鼠和幼鼠的血清和粪便提取物中，Stx2B的抗体效价都较高，且幼鼠在产后8-90 d内可抵抗致死剂量的Stx2注射^[21-22]。另外，断奶期幼鼠对口服产生Stx2的EHEC菌株攻毒具有抵抗力，并且没有产生与Stx2毒性相关的任何症状^[22]。Martorelli等^[23]和Mejias等^[24]分别用BLS-Stx2B免疫4月龄犊牛和小鼠，均诱导产生了特异性抗体。这些研究证明了BLS-Stx2B作为疫苗的可行性。

2.3.2 病毒疫苗的研究

以BLS为载体的病毒疫苗研究较多的主要是轮状病毒疫苗，人类甲型流感疫苗也有研究。

Bellido等^[25]将C 486牛轮状病毒(BRV) VP8核心蛋白(VP8d)与BLS融合免疫仔鼠，希望能够增强机体对BRV VP8的免疫应答，结果表明，BLS-VP8免疫仔鼠对C 486 BRV攻击有97.5%-100%的保护作用。作者推测可能是因为BLS支架是一种有效的抗原传递系统，它使得BLS-VP8d嵌合蛋白折叠良好、稳定，从而增强机体对BRV的抗体应答。还有研究将BLS-VP8d在烟草叶绿体中表达，该融合蛋白在植物发育的所有阶段保持可溶性和稳定表达，即使在衰老或冻干的叶中也是如此，从新鲜和冻干的叶中提取的未纯化的可溶性蛋白能够在产蛋母鸡模型中诱导特异性中和IgY抗体^[26]。这项工作提示BLS作为一种基于植物的高度免疫原性注射剂甚至口服VP8亚单位疫苗是可行的。

Alvarez等^[27]将人类甲型流感病毒株中蛋白基质2 (M2e)的外显子结构域的4个串联拷贝与BLS融合，并用其免疫小鼠刺激产生了明显的体液免疫反应，用流感病毒攻击小鼠的存活率为100%，这为流感疫苗的研制提供了新的思路。

2.3.3 寄生虫疫苗的研究

Fragoso等^[28]和Cruz-Revilla等^[29]分别将猪带绦虫保护肽GK--1和KETc 1与BLS融合制成亚单位疫苗口服免疫小鼠，都取得了很好的免疫效果，这为寄生虫口服疫苗的研制打下了基础。

2.4 抗肿瘤相关研究

BLS抗肿瘤作用的相关研究目前正处于初级阶段。有文献表明，BLS信号通过Toll样受体4 (TLR4)增加共刺激分子水平和促炎细胞因子的分泌，引起特异性CD8淋巴细胞的快速增殖和活化^[30]。由于目前许多能够加强免疫反应的生物因子具有毒性作用，所以能够促使树突细胞的激活，加强Th1类型的免疫反应和抗原呈递，诱导抗原特异性细胞毒性的TLR激动剂在肿瘤疫苗研究中发挥着重要作用。而BLS的这种特性表明，其可以作为抗肿瘤疫苗一个有效的佐剂成分。

Rossi等^[31]在一项研究中评估了BLS作为预防性疫苗和治疗药物的有效性。在评估其作为预防性疫苗的有效性实验中，用BLS或BLS-OVA免疫C57BL/6小鼠，35 d后皮下接种B16-OVA黑色素瘤。可以发现，BLS或BLS-OVA对肿瘤的生长有明显的抑制作用，50%免疫BLS最高剂量组的小鼠没有可见的肿瘤而TLR4缺乏的小鼠没有观察到这种效应。治疗实验中小鼠接种B16细胞2 d后注射BLS或BLS-OVA，两种治疗方法都能显著延缓肿瘤细胞生长，提高存活率。此外，治疗实验中BLS和BLS-OVA刺激也对TLR4缺陷小鼠有效。为了研究BLS对肿瘤细胞是否有直接影响，在体外使用一定剂量的BLS对B16细胞进行预孵育处理，48 h后将细胞接种小鼠，结果显示120 d后小鼠存活率增高，肿瘤细胞的生长受到抑制。在将B16细胞与BLS体外预孵育之前，将TLR4/MD2单克隆抗体添加到细胞培养物中，结果表明BLS产生的抗肿瘤作用被抑制，证明了BLS通过TLR4抑制体内肿瘤细胞的生长。上述实验为肿瘤治疗提供了新的思路。

本实验室在前期工作中，利用高通量测序技术研究致病菌与宿主互作关系过程时发现，小鼠巨噬细胞在感染布鲁氏菌后，与癌症转录失调信号通路相关基因的转录水平发生显著变化，提示布鲁氏菌感染可能与肿瘤细胞的发生相关联^[32]。此后，我们使用布鲁氏菌感染1周前注射过黑色素瘤B16细胞的小鼠，发现布鲁氏菌在小鼠体内可抑制肿瘤细胞的生长(待发表资料)。为了进一步验证BLS是否在布鲁氏菌抗肿瘤效应中发挥主要作用，我们构建了BLS基因缺失株和互补株，用以比较BLS布鲁氏菌基因缺失株和野生株对肿瘤细胞的抑制作用。与此同时，我们构建BLS蛋白大肠杆菌表达载体，对BLS蛋白进行表达纯化，并免疫小鼠制备单克隆抗体，检测BLS多克隆抗体注射入小鼠体内后是否会拮抗布鲁氏菌的抗肿瘤效应(实验中进行)。

3 小结与展望

尽管基于BLS在布鲁氏菌病的诊断试剂和亚单位疫苗方面的研究还处于实验室研究阶段，对BLS抗肿瘤作用的研究才刚刚起步，但BLS自身由于具有极强的稳定性和较高的免疫原性等特点，无疑为建立布鲁氏菌病诊断方法、研发疫苗载体甚至是治疗肿瘤性疾病提供了一种新的思路。