食用菌是我国继粮食、油料、果品和蔬菜之后的第五大种植产业，市场前景广阔^[1]。大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)味道鲜美、风味独特，高蛋白、低脂肪、低热量，营养丰富^[2]，具有增强免疫力、防癌抗衰老、预防冠心病等功效^[3]，是极具开发潜力的食药兼用珍稀食用菌种类^[4]。随着人们生活水平的提高，对大球盖菇及斑玉蕈的需求量也逐年增加，提高其产量及质量对产业发展具有重要意义。

食用菌的培养基是菌种保藏的关键，同时也是生产上的重要依据^[5]。目前，食用菌常规培养一般主要使用马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)，培养基类型非常单一，但在科研及生产过程中发现PDA培养基并不是所有食用菌的最佳培养基，虽然可以使许多菌株生长，但存在生长速度慢、生物量低等问题，直接影响食用菌的生产。近年来对大球盖菇及斑玉蕈培养基的优化主要包括碳源、氮源、无机盐、维生素及植物生长调节剂等^[6-7]。海藻糖是一种非还原性二糖，是广泛存在于各种生物体内的抗逆境剂，能够增强生物体对高温、脱水、干旱、冷冻、高渗透性、重金属及有毒试剂等逆境的抵抗能力^[8-9]。通过外源添加的方式，海藻糖也能对细胞起到较好的非特异性保护作用。大球盖菇是一种草腐菌，采用稻草、麦秸等农林废弃物为原料，可以生料栽培，具有很强的木质纤维素分解能力^[10]。纤维素酶通过其酶系组分的协同作用，将大分子高结晶化的纤维素分解为葡萄糖，可以被菌丝吸收利用。纤维素酶活性的高低与食用菌子实体的产量密切相关。斑玉蕈为一种木腐菌，栽培过程中主要以木屑为原料^[11]，因此对木质素的降解尤为重要。漆酶具有降解木质素、氧化降解酚类物质、抑制杂菌、改善出菇品质等重要作用，漆酶活性的高低可能与菌体的生长速度、生产周期有密切的关系，漆酶活性较高的菌种生长速度较快，生产周期相对较短^[12]。

为了满足生产及科研的需要，并为进一步探索非渗透性保护剂对菌丝体生长的影响提供基础^[13]，本研究使用了添加海藻糖的培养基对大球盖菇、斑玉蕈菌株进行培养，以基础PDA培养基作为对照，对其菌丝生长状况、生长速度和生物量进行了比较，同时测定了大球盖菇的羧甲基纤维素酶活性和斑玉蕈的漆酶活性，筛选出各自适用的最佳培养基。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

大球盖菇菌株CY-12、斑玉蕈菌株HM-54由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供。

1.2 培养基

PDA培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，加蒸馏水至1 L。固体培养基加琼脂15 g/L。

PDTA培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖10，海藻糖10，加蒸馏水至1 L。固体培养基加琼脂15 g/L。

PTA-2培养基(g/L)：马铃薯200，海藻糖20，加蒸馏水至1 L。固体培养基加琼脂15 g/L。

PTA-5培养基(g/L)：马铃薯200，海藻糖50，加蒸馏水至1 L。固体培养基加琼脂15 g/L。

所有培养基均在1×10⁵ Pa下灭菌20 min。

1.3 主要试剂和仪器

海藻糖，国药集团化学试剂有限公司；羧甲基纤维素酶试剂盒、漆酶试剂盒，苏州科铭生物技术有限公司。酶标仪，Bio-Rad公司。

1.4 菌丝形态及生理指标的测定

1.4.1 生长状态及菌丝生长速度的测定

每组选用同一生长状况的菌丝进行接种，在长满菌丝的PDA固体培养基上，分别用直径为5 mm的打孔器沿菌落边缘打孔，将菌块接种于不同类型的固体培养基上，25 ℃暗条件下培养，每天定时观察菌株的生长形态。接种后培养4、6、8 d用十字交叉法测量菌落半径，菌落半径差值(mm)与生长天数(d)的比值即为菌丝生长速度(mm/d)。每组重复3次，计算菌丝平均生长速度并且在培养10 d时对菌丝菌落进行拍照。

1.4.2 菌丝生物量的测定

接种后的液体培养基在25 ℃、150 r/min、黑暗条件下培养到10 d时，菌丝基本长满摇瓶，处于生长旺盛阶段，第10天时收集菌丝。用烘干至恒重(M₁)的滤纸过滤，取菌丝团同滤纸共同烘干至恒重(M₂)，计算菌丝团干重M=M₂−M₁，每个处理设置3次重复。

1.4.3 SDS-PAGE电泳分析

收集在液体培养基中培养10 d的菌丝，用TCA/丙酮法提取蛋白质，并用浓度为12.5%的凝胶进行SDS-PAGE电泳分析。

1.4.4 羧甲基纤维素酶活力的测定

大球盖菇羧甲基纤维素酶活的测定参照Mandels等^[14]的方法，使用羧甲基纤维素酶试剂盒进行测定。取处理好的大球盖菇菌丝，加液氮后充分研磨，分别精确称取0.1 g，加入1 mL的提取液，充分混匀，然后于4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min。收集上清液置于冰上，按照试剂盒说明书测定羧甲基纤维素酶的活力。

1.4.5 漆酶活力的测定

斑玉蕈漆酶活力的测定参照张雪玲等^[15]的方法，使用漆酶试剂盒进行测定。取处理好的斑玉蕈菌丝加液氮后充分研磨，分别精确称取0.1 g，加入1 mL的提取液充分混匀，然后于4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min。收集上清液置于冰上，按照试剂盒说明书测定漆酶的活力。

2 结果与分析 2.1 大球盖菇、斑玉蕈在不同培养基上的生长情况

将接种后的培养皿置于25 ℃培养箱中黑暗条件下培养，分别在接种后第4、6、8、10天比较观察菌丝生长状态，记录菌丝色泽、边缘整齐度以及菌落长势，菌丝洁白粗壮，菌落浓密，菌丝分枝多且密，长势好，边缘整齐则标记为“+++”；菌丝中等粗壮与浓密，微黄，菌丝分枝中等，边缘较整齐记为“++”；菌丝纤细绒毛状，微黄至黄褐色，稀疏，边缘不整齐则记为“+”。

大球盖菇CY-12及斑玉蕈HM-54菌株在4种培养基上第10天的生长情况见图 1，菌丝生长情况评价见表 1。两种食用菌在不同的培养基中菌落边缘均整齐，大球盖菇CY-12菌株在不同的培养基中生长，菌丝均表现为洁白粗壮，菌落浓密，菌丝分枝多且密，长势好，添加海藻糖的培养基在长势上略优于PDA培养基。斑玉蕈HM-54菌株在不同培养基上的生长情况均表现为菌丝洁白粗壮，菌落浓密，菌丝分枝多且密，长势好。

2.2 大球盖菇、斑玉蕈在不同培养基上的菌丝生长速度

菌丝在不同培养基上的生长速度结果(图 2)表明，添加海藻糖的培养基对菌丝的生长速度具有不同程度的提高。与基础培养基PDA相比，大球盖菇CY-12菌丝在PTA-5培养基上生长速度最快，具有极显著差异；斑玉蕈HM-54在添加海藻糖的培养基上菌丝速度也有一定程度的提高，相较于基础培养基PDA，PDTA、PTA-5上的菌丝生长速度显著加快。

2.3 大球盖菇、斑玉蕈在不同培养基上的菌丝生物量

在不同液体培养基上培养的两种食用菌的菌丝生物量测定结果(图 3)表明，海藻糖的添加能不同程度地提高菌丝生物量。大球盖菇CY-12的菌丝生物量在PTA-5培养基中显著增加；斑玉蕈HM-54在添加海藻糖的培养基中生物量也增加显著，而且在PDTA及PTA-5培养基中菌丝生物量的增加达到极显著差异。

2.4 SDS-PAGE电泳

收集不同培养基培养的菌丝提取蛋白质进行SDS-PAGE电泳，结果(图 4)表明，来自不同培养基的大球盖菇CY-12、斑玉蕈HM-54蛋白质在SDS-PAGE电泳图上的条带组成基本一致，说明添加海藻糖的培养基可能并未改变菌丝的蛋白质结构与组成，但蛋白条带的颜色深浅存在明显的差异，初步说明来自不同培养基菌丝体的部分蛋白表达量存在差异性。

2.5 大球盖菇羧甲基纤维素酶活力

在不同液体培养基中大球盖菇菌丝的羧甲基纤维素酶(CMC酶)活力(图 5)具有显著性差异。以大球盖菇CY-12在PDA培养基中CMC酶的活力作为对照组，PDTA和PTA-2培养的菌丝CMC酶的活力显著低于PDA，而PTA-5培养的菌丝CMC酶的活力显著高于PDA，说明大球盖菇在PTA-5培养基中CMC酶活力最高，菌丝对纤维素的分解能力可能会显著增加。

2.6 斑玉蕈漆酶活力

斑玉蕈菌丝在不同液体培养基中漆酶的活力(图 6)具有显著性差异。以在PDA培养基中斑玉蕈HM-54菌丝的漆酶活力作为对照组，PTA-2和PTA-5显著低于PDA培养基中漆酶的活力，而PDTA极显著高于PDA培养基中漆酶的活力，说明斑玉蕈在PDTA培养基中漆酶活力最高，菌丝对木质素的分解能力可能会显著增加。

3 讨论与结论

食用菌的菌种培养基对于科学研究及保藏菌种具有重要意义，也是栽培生产上高产稳产的关键。海藻糖作为一种稳定的非还原性二糖，具有防止蛋白质变性的作用^[16]，而且海藻糖积累到一定水平会响应于高温、碳氮饥饿、氧自由基、脱水、冷胁迫、冷冻、甲苯及乙醇等引发的胁迫性应激^[17-19]。海藻糖的外源添加可能将有助于增强大球盖菇及斑玉蕈在培养过程中应对不良环境的能力。大球盖菇属于草腐菌，以木质纤维素为主要的营养来源，人工栽培主要的原材料是稻草、麦秆、玉米秸秆等^[10]。大球盖菇具有完整的纤维素酶系，能够降解培养基基质，吸收营养和能量，在菌丝体内合成蛋白质、脂质和其他成分，保证能够正常生长发育。羧甲基纤维素酶是纤维素酶系中的重要一员，与大球盖菇的产量密切相关。通过测定羧甲基纤维素酶活力的表达，可从生理水平上衡量不同培养基对其菌丝生物量的影响。斑玉蕈是一种木腐菌，栽培过程中以木屑作为主要原材料^[11]。研究表明漆酶的活性与斑玉蕈的菌丝生长及子实体发育密切相关，而且漆酶活力和生物量成正比关系^[20]。因此，我们选择通过测定漆酶活力来考察不同培养基对斑玉蕈菌丝生物量的影响。

本研究以普通PDA培养基作为对照，通过对菌丝生长情况评价、菌丝生长速度、菌丝生物量、羧甲基纤维素酶及漆酶活力进行分析，发现添加海藻糖的培养基对大球盖菇、斑玉蕈菌丝的生长能产生一定的积极作用，促进了两种食用菌的菌丝生长速度及其生物量的增加，添加不同比例的海藻糖对羧甲基纤维素酶和漆酶的影响较大。添加不同比例海藻糖的培养基对大球盖菇、斑玉蕈的菌丝形态影响不大，均表现为菌丝洁白粗壮，菌落浓密，菌丝分枝多且密，长势好。使用PTA-5培养基时大球盖菇的菌丝生长速度极显著高于普通PDA培养基，菌丝生物量和羧甲基纤维素酶的活力也显著高于普通PDA培养基。因此，大球盖菇的最适培养基是PTA-5。使用PDTA和PTA-5培养的斑玉蕈，其菌丝生长速度显著高于PDA培养基，菌丝生物量极显著高于PDA培养基。漆酶活力测定结果显示，PDTA培养的斑玉蕈菌丝漆酶活力极显著高于PDA培养基，因此斑玉蕈的最佳培养基为PDTA培养基。

综上研究结果表明，添加海藻糖的培养基不仅能为大球盖菇、斑玉蕈菌丝生长提供良好的营养和环境^[21]，显著加快两种食用菌菌丝的生长速度，提高菌丝生物量，还可能增强大球盖菇、斑玉蕈在培养过程中应对环境胁迫的能力^[22]，而且制作方法简单，具有间接增加经济效益的潜力。