植物内生细菌是指生活在健康植物的组织或器官内，对宿主没有明显病害症状的细菌^[1]。已有研究报道，几乎所有的植物都存在内生菌，且不同植物的不同组织部位中(如根、茎、叶、花、种子和根瘤)均有内生菌的存在^[2]。根瘤是豆科或非豆科植物根部的瘤状凸起，由根瘤菌或弗兰克氏菌引起，根瘤中也定居着大量内生细菌^[3]。

植物内生细菌具有丰富的生物学功能，主要包括生物防治、促生、固氮和生物修复作用等^[4]。植物内生细菌通过产生抗生素、细菌素、溶菌酶、超氧化物歧化酶、挥发性有机物等代谢产物来抑制或者杀死病原物，或通过与病原物营养竞争和生态排斥作用抑制病原物生长，起到生物防治的作用^[2]。植物内生细菌可以产生吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、细胞激动素、赤霉素等植物激素，直接促进宿主植物的生长^[5]；还可通过产生铁载体将Fe³⁺还原成植物能够吸收的Fe²⁺，向宿主提供可以利用的铁元素来满足植物的生长需要；能溶解土壤中的难溶性磷酸盐来改善植物对矿物质的利用率^[6]。

沙棘是一种非豆科植物，沙棘根瘤是弗兰克氏菌侵染沙棘根部后形成的共生体。徐瑞瑞^[7]研究发现，沙棘根瘤中除弗兰克氏菌外还存在大量的非弗兰克氏菌。作者前期研究也发现，沙棘根瘤中存在种类繁多的内生细菌，并从中分离出大量的内生细菌资源^[8]。相对于植物其他组织部位的内生细菌而言，根瘤内生细菌不仅将植物作为其栖息场所，而且对宿主植物有促生、防病及联合固氮等广泛的生物学作用，其对土壤的适应性更强，用于土传性病害的生物防治更具优势^[2]。因此，本研究对来源于沙棘根瘤的内生细菌进行筛选，筛选出具有较高抑菌和促生活性的菌株，并对其生物学特性及对作物的防病促生效果进行初步探索，还通过形态学观察、生理生化试验，16S rRNA基因序列分析对菌株进行鉴定，为开发新型农用微生物资源提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

所用的供试内生细菌共131株，均由本实验室分离保存。供试细菌为3种标准菌株，即以革兰氏阴性菌为代表的大肠杆菌(Escherichia coli)、以革兰氏阳性菌为代表的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)；两种植物病原真菌，即黄瓜枯萎病病原真菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumebrium Owen)和黄芪根腐病病原真菌(Fusarium oxysporum Schlecht)。5种供试病原菌均由本实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器及培养基

蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、葡萄糖、磷酸三钙、铬天青S、天冬酰胺，上海泰坦科技股份有限公司；PCR反应试剂，北京康为世纪生物科技有限公司；引物由北京诺禾致源生物信息科技有限公司合成。PCR仪，上海一恒科学仪器有限公司。牛肉膏蛋白胨培养基(菌株活化培养基)、PDA培养基(拮抗菌筛选培养基)、无机磷培养基、CAS固体培养基、蔗糖-天冬酰胺培养基(促生活性测定培养基)等，参照张雨^[9]的方法配制。

1.3 沙棘根瘤拮抗性内生细菌的筛选

沙棘根瘤抑菌性内生细菌的筛选采用双层琼脂法和琼脂扩散法，初筛采用双层平板对峙法，参照Nieto-Lozano等^[10]的方法；复筛采用牛津杯法，参照唐梅等^[6]的方法，采用十字交叉法测定抑菌圈的直径。

1.4 拮抗性内生细菌促生活性测定

1.4.1 促生活性测定

菌株促生活性的测定分别采用定性和定量检测方法。产吲哚乙酸能力测定参照Salkowski比色法^[9]进行；溶磷能力的定性测定参考Ji等^[11]的方法，定量测定采用钼锑抗比色法^[12]；产铁载体能力的定性测定采用CAS平板对峙法^[11]，定量测定参考张雨^[9]的相对定量检测法。

1.4.2 促生盆栽试验

黄瓜品种：旱黄瓜，种子购于北京派得伟业科技发展有限公司。

土壤采用进口丹麦品氏泥炭营养土。盆栽试验方法参照江绪文等^[13]的方法并加以改进。将已消毒的旱黄瓜种子种于装有灭菌营养土壤的花盆(d=16 cm)中，每个处理10盆，每盆1粒种子。待黄瓜长到株高平均为35 cm时，将沙棘根瘤内生促生菌液(总菌量1.2×10⁸ CFU/mL)以每盆100 mL浇灌于盆栽土壤中，以无菌水作对照。待黄瓜长至开花期后，分别测定黄瓜植株的生长指标及其叶绿素的含量，测定方法参照田琴^[14]的方法。

1.5 内生细菌的鉴定

1.5.1 形态学鉴定

参考《常见细菌系统鉴定手册》^[15]，依据菌落和显微形态特征分别进行鉴定。

1.5.2 生理生化鉴定

对筛选的具抑菌促生活性的内生细菌菌株进行运动性、接触酶等生理生化试验，参考《常见细菌系统鉴定手册》^[15]进行鉴定。

1.5.3 内生细菌的16S rRNA基因序列分析

沙棘根瘤内生细菌DNA的提取采用微波法^[16]。

16S rRNA基因扩增采用细菌通用引物：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系(25 μL)：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA (约50.0 mg/mL) 4 μL，2×Es Taq MasterMix (Dye) 15 μL，加ddH₂O至25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min^[17]。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行双向测序，测序由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。将所得到的序列用NCBI的BLAST进行比对，用MEGA 7.0软件采用临近法(Neighbor-Joining method)构建系统发育树。

1.6 数据处理

采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析，用Origin 7.5软件绘图。

2 结果与分析 2.1 拮抗内生细菌的筛选

2.1.1 初筛

对131株沙棘根瘤内生细菌进行抑菌活性初筛后发现，25株内生细菌对供试细菌或病原真菌表现出不同程度的抑菌效果(表 1)。其中有5株内生细菌能同时抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黄芪根腐病和黄瓜枯萎病病原真菌(图 1)，有6株内生细菌能同时抑制除大肠杆菌外的其他4种病原供试菌，有1株内生细菌能同时抑制除黄芪根腐病菌外的其他4种病原供试菌，其他13株内生细菌对部分病原供试菌也具有较好的抑菌效果。有2株内生细菌TT207和GR201能同时抑制两种病原真菌，且抑菌带直径均超过25.9 mm，抑菌效果明显。

2.1.2 复筛

对初筛得到的9株抑菌性能较好的内生细菌，根据其发酵液对供试病原菌的抑菌性进行复筛(图 2)。结果表明，9株内生细菌对2株供试病原真菌均有抑菌效果，除菌株TT201和TT06外，其余7株内生细菌对黄瓜枯萎病菌的抑菌性均强于黄芪根腐病菌。其中，菌株TT201对黄瓜枯萎病菌和黄芪根腐病菌的抑制性相对较高，其抑菌带直径分别为24.5 mm和25.2 mm；菌株TT207对黄瓜枯萎病菌的抑制性最强，其抑菌带直径达到28.8 mm；菌株TT06对病原真菌抑菌性最弱。

9株内生细菌对供试病原细菌的抑菌性结果表明，有2株内生细菌能同时抑制3种病原细菌，有5株内生细菌能抑制除大肠杆菌外的2种病原细菌。菌株SB107对大肠杆菌的抑菌性最强，其抑菌带直径达到30.3 mm。

2.2 内生细菌的促生活性检测

2.2.1 促生活性的测定结果

对复筛得到的9株具有抑菌活性的内生细菌进行促生活性的测定，分别检测了菌株的产IAA、溶磷和产铁载体能力，结果如表 2所示。其中，8株内生细菌具有促生活性，1株无促生活性。只产IAA的有5株，能产铁载体的有4株，具有溶磷能力的有5株；既能产生IAA又具有溶磷能力的有2株，既能产生IAA也能产铁载体的有2株，既具有溶磷能力又能产铁载体的有3株。菌株SR308的促生活性较好，能同时具有产IAA (含量：23.17±0.17 μg/mL)、溶磷(溶磷量：1.36±0.01 μg/mL)和产铁载体(含量：4.9±0.37%)的能力，且其产IAA能力最强。菌株SY101的溶磷能力最强，可溶性磷的含量为2.0±0.02 μg/mL。菌株TT207的产铁载体能力最强，产铁载体的含量达68.2±0.06%。图 3为部分菌株促生活性测定的效果图。

2.2.2 黄瓜盆栽试验结果

通过对沙棘根瘤内生细菌促生活性的测定结果发现，菌株SR308能同时产生3种促生活性物质，因此选取菌株SR308对旱黄瓜的促生作用进行盆栽试验，分别对旱黄瓜植株的生长指标及其叶绿素含量进行了测定。

研究发现SR308菌株发酵液对旱黄瓜的生长具有明显的促进作用(表 3)，与对照相比，用SR308菌株发酵液处理后的黄瓜的各项生长指标均高于对照处理，特别是用菌株SR308发酵液浇灌过的黄瓜地上部分湿重和干重分别是对照组的1.99倍和1.63倍，且黄瓜苗株高比对照组增加了70%，差异比较显著；茎粗、主根干重和主根湿重均高于对照组，但差异均不显著。

研究也发现，SR308菌株发酵液浇灌过的黄瓜叶绿素含量高于用无菌水浇灌的(表 4)。其叶绿素a、b和总含量分别为对照组的1.83、2.14和2.01倍，具有显著差异性，类胡萝卜素的含量比对照组高0.07 mg/g，其差异性不显著。可见，沙棘根瘤内生细菌SR308对旱黄瓜植株具有明显的促生效果(图 4)。

2.3 两株内生细菌的鉴定

2.3.1 菌株的形态特征

选取具有较强抑菌性的内生菌株TT201，以及产生3种促生活性物质能力较强的菌株SR308分别进行了鉴定。图 5和图 6为两株内生细菌的菌落和显微形态特征。菌株TT201的菌落呈圆形、扁平，白色不透明，边缘啮蚀状，中央褶皱状隆起，表面干燥，菌落直径为1 mm−4 mm (图 5A)，经革兰氏染色后镜检观察到其为G⁻菌，细胞呈短杆状，有芽孢生成(图 5B)；菌株SR308的菌落呈圆形、扁平光滑，乳白色不透明，边缘啮蚀状，表面较湿润，菌落直径为1 mm–3 mm (图 6 A)，经革兰氏染色后镜检观察到其为G⁺菌，细胞呈直杆状，也有芽孢生成(图 6B)。

2.3.2 菌株的生理生化试验

两株内生细菌的部分生理生化鉴定结果见表 5，生理生化反应结果的测定以实验室保存的模式菌株大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为依据。菌株TT201的运动性、接触酶、甲基红、硫化氢反应均呈阳性，V-P、柠檬酸盐反应为阴性，能够产生吲哚，不能水解淀粉，能利用葡萄糖、硝酸盐，水解明胶和纤维素，与短芽孢杆菌属(Brevibacillus)菌种特征基本相符。菌株SR308的运动性、接触酶、甲基红、硫化氢、V-P反应均呈阳性，柠檬酸盐反应为阴性，能水解淀粉，能利用葡萄糖、硝酸盐，水解明胶和纤维素，与芽孢杆菌属(Bacillus)菌种特征基本相符。初步鉴定这两株菌株分别为短芽孢杆菌属(Brevibacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)。

2.3.3 菌株16S rRNA基因序列分析

从测序结果可知，菌株TT201的16S rRNA基因片段长度为1 400 bp左右，菌株SR308的16S rRNA基因片段长度为1 420 bp左右。构建系统发育树结果显示(图 7)，TT201与Brevibacillus laterosporus DSM 25 (NR 112212.1)位于同一分支，其聚类支持强度为100%；SR308与Bacillus mycoides ATCC 6462 (NR 115993.1)位于同一分支，其聚类支持强度为95%。结合形态和生理生化特征将菌株TT201鉴定为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，菌株SR308鉴定为蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)。

3 讨论与结论

植物内生细菌与宿主植物在长期协同进化的过程中形成了互惠互利的共生关系，一方面植物为内生细菌提供生长必需的能量和营养物质，另一方面内生细菌可产生生物活性物质或借助于信号传导作用对植物体产生影响。植物内生细菌具有固氮、生防、促植物生长、增强宿主植物抗逆性、抗病虫害等多种生物学作用^[18]。已有研究表明，植物内生细菌可产生抗菌类物质抑制病原菌对宿主的侵害，减少植物的发病率，还可通过竞争生态位和营养抑制植物病原菌的侵染和生长，从而达到生物防治的作用^[19]；内生细菌也能产生生长调节类物质促进宿主植物的生长，同时还可促进宿主植物对氮、磷、钾、铁等营养物质的吸收^[20-21]。

本研究从沙棘根瘤内生细菌中筛选出一株具有广谱抑菌作用的内生细菌TT201，经鉴定为侧孢短芽孢杆菌。抑菌初筛发现菌株TT201对E. coli、B. subtilis和S. aureus的抑制带宽分别为20.3、18.8和23.9 mm，对黄瓜枯萎病菌和黄芪根腐病菌的抑制带宽为23.3 mm和23.2 mm。复筛的结果发现其对E. coli、B. subtilis和S. aureus的抑制带宽分别为20.3、16.3和18.3 mm，对黄瓜枯萎病菌和黄芪根腐病菌的抑制带达24.5 mm和25.2 mm。与初筛相比，复筛结果中菌株TT201对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性较弱，说明此菌株对革兰氏阳性菌的抑制性低于革兰氏阴性菌。总体而言，菌株TT201对5种供试病原菌均表现出相对较强的抑制能力。复筛结果也发现，部分沙棘根瘤内生细菌对黄瓜枯萎病菌的抑制性强于黄芪根腐病菌，其原因可能是由于两种枯萎病菌属不同生理专化型而引起的。沈文渊^[22]研究发现，不同枯萎病专化型镰刀菌对植物有不同程度的致病性，同种药剂对不同枯萎病专化型镰刀菌的抑制效果也存在差异。当然，在筛选抑菌高效、稳定的生防内生细菌时只使用一种或少数几种病原菌作为筛选条件是远远不够的，这会导致所筛选的内生细菌生防能力单一、综合防治效果差、应用范围窄^[4]。因此，在筛选生防内生菌时应选取多种病原菌作为筛选目标，也可将多种菌剂配合使用，开发新型农用微生物菌肥，同时进行盆栽和大田试验进行验证，提高植物内生细菌的综合防治效果。

本研究从131株沙棘根瘤内生细菌中筛选出一株具有较好促生活性的内生细菌SR308，它也具有较好的抑菌作用，经鉴定为蕈状芽孢杆菌。研究发现，菌株SR308能够产生植物生长激素IAA，其含量达到23.17±0.17 μg/mL；同时能溶解难溶性磷酸盐，产生嗜铁素，有较高的促生活性。王秀呈等^[23]研究发现，水稻内生固氮菌除有固氮作用外，还同时具有溶磷、产铁和分泌生长激素的能力。本研究结果发现，沙棘根瘤内生细菌SR308具有产IAA、铁载体和溶磷的能力，但对其是否具有固氮作用还需进一步的研究。

郑文波等^[24]研究发现高产吲哚乙酸并具解磷作用的芽孢杆菌具有促生作用。本研究也发现，蕈状芽孢杆菌SR308的发酵液对黄瓜的生长具有明显的促进作用，用菌株SR308发酵液处理过的黄瓜苗株高达64.8 cm，比对照组高19.4 cm；其叶绿素总含量达到2.61 mg/g，比对照组高1.31 mg/g。袁玉娟^[25]发现芽孢杆菌能降低黄瓜枯萎病发病率并促进黄瓜生长，这与本研究结果较相似，但本试验的菌株SR308对黄瓜具有促生长作用，其是否对黄瓜枯萎病具有防治作用还需进一步验证。对于菌株SR308促进黄瓜的生长是否因为菌株所产生的IAA、铁载体或解磷作用，还需研究探讨。因此，进一步研究沙棘根瘤内生细菌的促生性能及其促生机理，可为提高内生细菌对植物生长促生效果的研究提供丰富的理论依据。