微生物学通报  2019, Vol. 46 Issue (5): 1030−1040

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韩如月, 李睿瑞, 杨帆, 李红宇, 钱永德, 郑桂萍, 郭永霞, 荆瑞勇
HAN Ru-Yue, LI Rui-Rui, YANG Fan, LI Hong-Yu, QIAN Yong-De, ZHENG Gui-Ping, GUO Yong-Xia, JING Rui-Yong
一株水稻根内生拮抗细菌SM13的分离及鉴定
Isolation and identification of an endophytic and antagonistic bacterium from rice roots
微生物学通报, 2019, 46(5): 1030-1040
Microbiology China, 2019, 46(5): 1030-1040
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180471

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收稿日期: 2018-06-11
接受日期: 2018-10-15
网络首发日期: 2018-11-09
一株水稻根内生拮抗细菌SM13的分离及鉴定
韩如月 , 李睿瑞 , 杨帆 , 李红宇 , 钱永德 , 郑桂萍 , 郭永霞 , 荆瑞勇     
黑龙江八一农垦大学    黑龙江  大庆    163319
摘要: 【背景】 作物根内生细菌具有固氮、分泌激素、产生病原真菌抗性物质等特性,根系内生菌的分离及应用成为环境友好型防控技术研究的热点之一。近年来盐碱地水稻种植面积逐年增加,而关于盐碱地水稻根内生菌的分离与应用鲜有报道。【目的】 从大庆盐碱地水稻根中分离内生细菌,筛选对植物真菌病害有拮抗作用的促生菌株,初步探讨其抑菌和促生功效,为进一步研究其抑菌和促生机理提供菌种资源。【方法】 对水稻根表面灭菌后研磨涂布分离内生细菌,采用对峙培养法和改良Salkowski比色法筛选具有广谱抑菌效果并有分泌吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)能力的菌株,通过形态鉴定、革兰氏染色、生理生化测定、16S rRNA结构基因以及srfAituAfenB 功能基因序列系统进化分析,确定细菌的分类地位。【结果】 从水稻根部分离到一株内生细菌SM13,该菌株具有广谱性抑菌作用,对玉米新月弯孢菌、大豆菌核病菌、稻瘟病菌、禾谷镰刀菌的抑菌率分别为59.38%、78.13%、53.12%、37.50%,分泌IAA的能力为5.56±0.41 μg/mL (n=6)。经形态学、生理生化试验结合系统进化分析初步鉴定SM13菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌株在pH 11.0、盐浓度10%的NA培养基中生长良好,具有较高的耐盐碱性。【结论】 水稻根内生菌SM13菌株具有耐盐碱性、促生和生防性能,可作为微生物农药及菌肥的材料。
关键词: 根内生细菌    拮抗细菌    鉴定    枯草芽孢杆菌    
Isolation and identification of an endophytic and antagonistic bacterium from rice roots
HAN Ru-Yue , LI Rui-Rui , YANG Fan , LI Hong-Yu , QIAN Yong-De , ZHENG Gui-Ping , GUO Yong-Xia , JING Rui-Yong     
Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing, Heilongjiang 163319, China
Abstract: [Background] Endophytic bacteria in crop roots are beneficial to fix nitrogen, secrete hormones and produce resistant substances to pathogenic fungi. The isolation and application of endophytic bacteria in roots has become one of the hotspots in environment-friendly prevention and control technology. Although the rice planting area in saline alkali soil is increasing, the isolation and application of endophytic bacteria from rice roots in saline-alkali soil are still limited. [Objective] To isolate endophytic bacteria from rice roots in saline-alkali soil in Daqing, to screen promoting-growth bacteria with antagonistic effect on plant fungal diseases, to investigate its bacteriostasis and promoting-growth effect, and to provide the bacteria resources for further studies on bacteriostasis and promoting mechanism. [Methods] Sterilized the root surface and then grinded the rice root, which were used to isolate the endophytic bacteria. Screened endophytic antagonistic strains and determined the ability of endogenous bacteria to secreting indole-3-acetic acid (IAA) by using confrontation culture method and modified Salkowski colorimetry method, respectively. The taxonomic status of the strains with broad-spectrum bacteriostatic effect was determined by using morphological identification, Gram staining, physiological and biochemical analysis, phylogenetic analysis of 16S rRNA structural genes and srfA/ituA/fenB functional genes. [Results] The SM13 strain was an candidate of endophytic bacterium isolated from rice roots, which showed broad-spectrum bacteriostatic effect. The bacteriostasis rates for Curvularia lunata, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, Magnapporthe grisea, and Fusarium graminearum Schw were 59.38%, 78.13%, 53.12% and 37.50% respectively, and the ability to secrete IAA was 5.56±0.41 μg/mL (n=6). SM13 strain was identified as Bacillus subtilis by morphological, physiological and biochemical tests and phylogenetic analysis. The strain grew well in NA medium under pH 11.0 and salt concentration 10% condition, so it had higher salt tolerance and alkalinity tolerance. [Conclusion] The rice roots endophyte SM13 has the ability of tolerance to saline-alkaline, promoting-growth and biocontrol. It could be used as the material of microbial pesticides and biofertilizers.
Keywords: Endophytic bacteria    Antagonistic bacteria    Identification    Bacillus subtilis    

水稻是我国主要粮食作物,长期以来,我国主要依靠化学农药防治其病虫害,每年农药使用量是世界平均水平的2.5−3.0倍[1]。化学药剂防治造成环境污染、成本高、易产生抗性,不符合绿色农业发展需求。因此,探索新的防治方法迫在眉睫。微生物农药的研发是发展绿色农业的研究热点,微生物农药有特异性高、防效好、安全无害、不易产生抗药性等优点,可为农产品的安全无害生产提供保障,具有广阔的发展前景。因此,筛选具有生防功能的微生物意义重大。

根内生细菌是生防功能微生物筛选的重要资源库,它与内生真菌和内生放线菌均属于植物内生菌。植物内生菌是指生活史中某一阶段或整个阶段定殖在植物各组织器官或细胞间隙内,对宿主植物不引起明显病害症状的一类微生物群[2]。据报道植物内生细菌具有固氮、分泌植物激素、诱导植物产生抗性和产生抗真菌代谢产物等多种生物学作用[3]。近年各种作物内生细菌的分离及应用成为环境友好型防控技术研究的一大热点[4]。Etesami等[5]从水稻根际和根内分离出的革兰氏阳性细菌蜡状芽孢杆菌REN3和REN4具有促生长、抑制一些水稻病原真菌生长的特性。Patel等[6]从古吉拉特邦(印度)地区的各种禾本科植物茎叶中分离的内生菌链霉菌属SS1、SS5和SS8表现出对立枯丝核菌的抑制作用。Akbaba等[7]从健康黄瓜植物组织中分离的假单胞菌对黄瓜角叶病病原菌有抑制作用。赵龙飞等[8]从河南大豆根瘤的内生细菌资源中筛选到对稻瘟病菌有拮抗作用的菌株,最高抑制率为62.16%。谢学文等[9]从黄瓜根际土样中筛选的一株甲基营养型芽孢杆菌WF-3对黄瓜炭疽病菌的防治效果为66.48%。

虽然从水稻、黄瓜、大豆根瘤及禾本科植物等分离出具有促生和拮抗作用内生细菌的报道很多,但盐碱地水稻根内生细菌的相关研究鲜有报道,因此本研究以大庆盐碱地水稻根内生细菌为研究对象,采用传统培养方法筛选具有潜在应用价值的、适合盐碱区的水稻根内生促生细菌,发现新的促生菌种资源,为促生和生防菌种资源的开发及微生物菌制剂研发奠定理论基础,以符合我国农业发展“节肥减药、提质增效”的战略要求。

1 材料与方法 1.1 试验材料

采集点概况:稻田位于黑龙江省大庆市七二一农场区域(46°40ʹ42ʺN,125°7ʹ40ʺE),土壤类型为草甸棕壤土。土壤理化性质:碱解氮175.0 mg/kg;速效磷26.5 mg/kg;速效钾90.6 mg/kg;有机质3.0%;pH 8.4。

分别于水稻苗期(2017年7月12日)、成熟期(2017年8月24日)取水稻根系。具体操作为随机取5株植物样品根系,混合后放入冰盒带回实验室,除去淤泥,进行表面清洗,分别于4 ℃冰箱保存备用,2 d内分离根系内生细菌。

供试植物病原真菌:禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw)、玉米新月弯孢菌(Curvularia lunata)、大豆菌核病菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary]、稻瘟病菌(Magnapporthe grisea),由黑龙江八一农垦大学农学院植物病理实验室提供。供试生理生化鉴定标准菌株大肠杆菌(Escherichia coli),由黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院微生物实验室提供。

1.2 主要试剂和仪器及培养基

牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉,北京奥博星生物技术有限责任公司;吲哚-3-乙酸(Indole- 3-acetic acid,IAA)、L-tryptophan,广州赛国生物科技有限公司;EasyTaq® DNA polymerase,北京全式金生物技术有限公司;引物由华大基因公司合成;其它试剂为分析纯。

生化培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;全温振荡培养箱,上海旻泉仪器有限公司;PCR仪,耶拿分析仪器股份公司。

NA培养基(g/L):牛肉膏3.0,蛋白胨10.0,氯化钠5.0,琼脂20.0,pH 7.2−7.4;PDA培养基(g/L):马铃薯200.0,葡萄糖20.0,琼脂20.0,pH自然;LB培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母粉5.0,氯化钠10.0,琼脂粉20.0,pH 7.2。生理生化性质鉴定所用培养基的配制参考《常见细菌系统鉴定手册》[10]

1.3 试验方法

1.3.1 根表面灭菌

采用乙醇-升汞联合灭菌[11]方法对水稻根样品进行表面灭菌:用无菌水彻底清洗水稻根表面,无菌滤纸吸干水分,然后用75%乙醇浸泡5 min,再用0.1% HgCl2浸泡10 min,最后用无菌水冲洗6−7次,无菌滤纸吸干多余水分。取最后一次清洗过根表面的水200 μL涂布于1/10 NA培养基平板上,检测水稻根表灭菌的效果,未发现可培养细菌则表明根表面除菌较为完全。

1.3.2 内生细菌数量测定及菌株分离保存

采用稀释平板涂布法[12]测定水稻根内生细菌数量。将1 g表面灭菌的水稻根样用无菌剪刀剪成1 cm−2 cm小段,在超净工作台内于无菌研钵中充分研磨,研磨过程可加入灭菌的石英砂和9 mL无菌水,然后用无菌水依次稀释成稀释度为10−1、10−2和10−3的菌悬液。分别取不同稀释度的菌悬液200 μL涂布于1/10 NA平皿上,每个稀释度3次重复,30 ℃培养7 d。选择菌落数在30−300范围内的平板进行菌落计数,再选取3次重复中菌落数较多的平板,根据形态、颜色、菌落大小等特征挑取不同菌株,在NA平板上分离纯化,将纯化后的根内生细菌接种NA斜面培养基培养,4 ℃保藏。

1.3.3 拮抗内生菌株的筛选

采用对峙培养法[13]测定分离获得的内生细菌对植物病原真菌的抑菌能力。将植物病原真菌0.6 cm菌饼接于PDA培养基平板中央,距离中央3.2 cm处等距离三点接种待测内生菌菌悬液2 µL (浓度为1.2×108 CFU/mL),3次重复,以无菌水为对照,30 ℃恒温培养,待对照病原菌长满平皿板时,测定抑菌圈半径(cm),计算抑菌率。抑菌率[14]=(1−处理菌落直径/对照菌落直径)×100%。

1.3.4 促生内生菌株的筛选

采用改良Salkowski比色法[15]测定获得的内生细菌菌株分泌IAA的能力。先用无菌牙签挑取活化的水稻根内生菌株于40 μL无菌水中,涡旋混匀,即为待测菌株菌悬液。取待测菌悬液10 μL于1.5 mL离心管中,再加入1 mL含色氨酸500 mg/mL的NA液体培养基,每菌株重复3次;取10 μL无菌水加入1 mL含色氨酸的NA液体培养基中作为对照。30 ℃、180 r/min振荡培养7 d,收集菌悬液10 000 r/min离心10 min,取上清液100 μL加入酶标板中,再加入200 μL Salkowski比色液,避光静置反应35 min,使用酶标仪测定各浓度标准液的OD530值,重复3次。利用IAA标准曲线[16]换算各菌株产生的IAA浓度。

1.3.5 筛选菌株的形态学和生理生化鉴定

形态学观察主要包括光学显微镜观察革兰氏染色和透射电镜观察[17]。鞭毛运动性观察,即在0.3%琼脂糖的LB培养基平板上点接2 μL菌悬液(108 CFU/mL),置于25 ℃培养箱24 h,观察菌株菌落的大小变化,菌落变大说明细菌具有鞭毛和运动性,反之无鞭毛。生理生化性质鉴定方法参考《常见细菌系统鉴定手册》[10],根据结果对筛出的促生拮抗菌株进行初步鉴定。

1.3.6 16S rRNA基因和功能基因鉴定

细菌16S rRNA基因的扩增引物及表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和丰原素(Fengycin)这3种合成酶基因的引物[18]表 1。引物由华大基因公司合成。

表 1 PCR扩增所用引物 Table 1 Primers of PCR amplication in this study
Primers name Primers sequence (5ʹ→3ʹ) Sizes (bp)
  27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1 500
  1492R GGTTACCTTGTTACGACTT
  srfA_F CTGCTCGCCGCCTATTTGTA 418
  srfA_R GGTGAGTTTCCCAGTATCCC
  ituA_F CATTCGTCGAGGTGGGACA 545
  ituA_R TCGGGCAAGTTCGTAGCG
  fenB_F TCGGGTTGACCGTATGCC 408
  fenB_R CCTGAAATCGGCGGGAAG

16S rRNA基因和3个功能基因鉴定的PCR反应体系均采用50 μL体系:10×Buffer 5 μL,EasyTaq® DNA polymerase (5 U/μL) 1 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 5 μL,上、下游引物(50 μmol/L)各0.5 μL,ddH2O 36.5 μL,待测菌悬液1.5 μL。

16S rRNA基因的PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30个循环;72 ℃ 5 min。3个功能基因的PCR扩增条件[18]:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,30个循环;72 ℃ 8 min;16 ℃ 5 min。

16S rRNA基因序列测定:胶回收试剂盒纯化PCR产物后,与pEASY-T1载体连接,转化至E. coli Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞中,涂布LB平板37 ℃培养18 h后,用含X-Gal平板筛选含有插入DNA片段的白色转化子,用无菌牙签挑白色单菌落于12 μL无菌水中为克隆鉴定模板,以大肠杆菌质粒引物M13R (5′-CAGGAAACAGCTATGA C-3′)和M13F (5′-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3′)为鉴定引物,PCR反应体系(10 μL):10×Buffer 1 μL,EasyTaq® DNA polymerase (5 U/μL) 0.2 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 1 μL,M13F/R (10 μmol/L)各0.1 μL,ddH2O 7.3 μL,待测菌悬液0.3 μL。PCR反应条件对应同上,鉴定的阳性克隆送去测序。

序列同源性分析:将测序得到的16S rRNA基因序列提交GenBank并与同源序列进行BLAST比对,用软件MEGA 5.0构建系统进化树。将得到的功能基因序列在网站(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/)上翻译成氨基酸序列后与GenBank中的同源序列进行BLAST比对,用软件MEGA 5.0构建系统进化树。

2 结果与分析 2.1 根内生细菌数量测定

供试两个时期水稻根系经表面除菌,最后一次清洗根表的无菌水未发现可培养细菌,表明根表面除菌较为完全。无菌水稻根系经研磨稀释涂布计数,结果发现水稻苗期根内生可培养细菌数量为1.6×104 CFU/g鲜重,成熟期水稻根内生可培养细菌数量为1.1×104 CFU/g鲜重。经划线分离纯化细菌,从两个时间水稻根系中共纯化74株细菌,其中苗期48株,成熟期26株,结果表明水稻根系内生细菌苗期数量和种类较成熟期丰度高。

2.2 拮抗内生菌株的筛选

采用平板对峙培养法,对已分离的74株根内生细菌进行拮抗菌株筛选,发现分离的根内生细菌中至少对一种供试病原菌有拮抗效果的细菌有24株,占总分离数量的32.43%,其中成熟期拮抗菌株的数量有10株,占成熟期总分离菌株数量的38.46%;而苗期拮抗菌株数量有14株,占苗期总分离菌株数量的29.17%。筛选得到的SM13菌株对4种植物病原菌均具有较好的抑菌作用,抑菌活性见表 2图 1

表 2 SM13菌株的抑菌活性 Table 2 Bacteriostasis activity of SM13 strain
植物病原真菌
Plant pathogenic fungi
抑菌圈半径a
Radius of bacteriostasis circlea (cm)
抑菌率
Bacteriostasis rate (%)
Curvularia lunata 1.9±0.06 59.38
Sclerotinia
sclerotiorum
(Lib.) de Bary
2.5±0.20 78.13
Magnaporthe grisea 1.7±0.10 53.12
Fusarium
graminearum Schw
1.2±0.06 37.50
注:a:抑菌圈半径的算术平均数±标准差.
Note: a: The arithmetic mean±standard deviation of the radius of the bacteriostasis circle.

图 1 内生拮抗细菌SM13对不同病原菌的抑菌作用 Figure 1 Antagonism of antagonistic endophytic bacteria SM13 against different pathogens 注:A:大豆菌核病菌;B:玉米新月弯孢菌;C:稻瘟病菌;D:禾谷镰刀菌. Note: A: Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary; B: Curvularia lunata; C: Magnaporthe grisea; D: Fusarium graminearum Schw.
2.3 促生内生菌株的筛选

采用Salkowski改良比色法测定各菌株上清液与Salkowski比色液的OD530值,经IAA标准曲线方程Y=0.025 7X−0.000 1 (YOD530值;X为IAA浓度,单位为μg/mL)计算得知菌株分泌IAA的能力。结果显示,水稻中分离菌株均产IAA,但分泌IAA的能力差异较大,多数菌株(55株)产IAA的能力介于1−10 μg/mL之间,占总分离菌株的74.32%;SM13菌株分泌IAA的能力约为5.56 μg/mL。

2.4 SM13菌株的形态学和生理生化鉴定

选择具有广谱抑菌作用并能够分泌IAA的SM13菌株进行鉴定,革兰氏染色结果和透射电镜观察结果如图 2所示,SM13菌株革兰氏染色呈阳性,经电镜观察测量SM13的菌体大小为(1.38−1.63) μm×(0.62−0.79) μm,细菌菌体边缘凹凸不平。图 2C为接菌24 h的鞭毛运动性实验,观察到细菌菌落变大,表明SM13菌株有运动性,证明其有鞭毛。表 3中菌落形态特征和生理生化鉴定结果表明,SM13菌株淀粉水解试验、V-P试验、柠檬酸盐试验、甲基红试验、过氧化氢试验、明胶试验、硝酸盐还原试验、产硫化氢试验等均为阳性,SM13菌株可在pH 11.0和盐浓度10%的NA培养基中生长良好,在盐浓度15%的NA培养基中也可生长,具有较高的耐盐碱性。经查阅细菌鉴定手册[10]表明,SM13菌株初步归属于芽孢杆菌属(Bacllius)。

图 2 SM13菌株的形态观察 Figure 2 Morphologic observation of strain SM13 注:A:革兰氏染色;B:透射电镜观察;C:鞭毛运动性试验. Note: A: Gram staining; B: Transmission electron microscope observation; C: Flagellar motility test.

表 3 拮抗菌株生理生化特征 Table 3 Physiological and biochemical characteristics of antagonistic strains
Test items Strain SM13 E. coli
Gram stain +
Amylohydrolysis +
Voges-Proskauer test +
Citrate test +
M-R + +
Catalase + +
Gelatin liquefaction test + +
Nitrate reduction test + +
Anaerobic growth test + +
Ammonia production test + +
Indole test +
Litmus milk test Acid coagulation Reduction, Peptone
Growth in different concentration of NaCl (%)
  0.5 + +
  2.0 + +
  5.0 + +
  10.0 +
  15.0 +
  20.0
pH value
  8.0 + +
  9.0 + +
  10.0 +
  11.0 +
  12.0
Acid producing test of glycolysis
  Sucrose + +↑
  Glucose + +↑
  Mannitol + +↑
Only carbon source test
  Sucrose + +
  Glucose + +
  Mannitol + +
Only nitrogen source test +
  (NH4)2SO4
  KNO3 +
注:+:阳性;−:阴性;+↑:产气阳性.
Note: +: Positive; −: Negative; +↑: Positive and producing gas.
2.5 16S rRNA基因鉴定

以细菌16S rRNA基因通用引物27F/1492R从SM13菌株扩增的PCR产物约1 500 bp (图 3A),PCR产物经胶回收、克隆,选取不同阳性克隆采用BsuR I内切酶分型(图 3B),分型一致的阳性克隆经测序得到1 510 bp核苷酸序列。所测序列经过BLAST比对分析,与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens FZB42 (GenBank登录号为NR075005)和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168 (GenBank登录号为NR102783)的相似性最高,分别为98.92%和98.72%。将SM13菌株的16S rRNA基因序列与GenBank上登录的一些芽孢杆菌相关种属进行比对建立系统发育树(图 4),发现SM13菌株与Bacillus subtilis MH25和Bacillus amyloliquefaciens FZB42两株菌的同源性更近,但进化距离略存差异。

图 3 SM13菌株的16S rRNA基因PCR图谱(A)和BsuR I酶切图谱(B) Figure 3 16S rRNA gene PCR profile (A) and BsuR I enzyme cut profile (B) of strain SM13 注:1−5:阳性克隆;M:100 bp DNA marker. Note: 1−5: Positive clones; M: 100 bp DNA marker.

图 4 基于16S rRNA基因序列构建的系统发育进化树 Figure 4 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences 注:参与比对序列的GenBank登录号列于括号中;分支处标注有自展值;标尺所示长度为0.000 5核苷酸置换率. Note: The GenBank accession numbers of aligned sequences are shown in the brackets; The bootstrap values are shown at the node; Bar 0.000 5 means the nucleotide substitution rate of 0.000 5.
2.6 功能基因鉴定

SM13菌株的3个功能基因PCR扩增结果见图 5。由图 5可知,PCR扩增仅获得ituA基因的目的条带,srfAfenB未扩增得到目的片段长度的条带。将ituA基因PCR产物克隆、测序得到的545 bp基因序列翻译成氨基酸后,SM13菌株ituA基因在氨基酸水平上与Bacllius subtilis MH25 (GenBank登录号为ABY89498)的一致性最高(98.82%)。SM13菌株的ituA基因在氨基酸水平上的系统进化分析见图 6,SM13菌株与Bacillus subtilis MH25更近,但进化距离略存差异。

图 5 SM13菌株的功能基因图谱 Figure 5 Functional genes pictures of strain SM13 注:1−3:srfAituAfenB基因PCR扩增图谱;M:100 bp DNA marker. Note: 1−3: PCR amplification profile of srfA, ituA and fenB gene; M: 100 bp DNA marker.

图 6 基于ituA基因在氨基酸水平上构建的系统发育进化树 Figure 6 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on ituA gene sequences at amino acid level 注:参与比对序列的GenBank登录号列于括号中;分支处标注有自展值;标尺所示长度为0.2氨基酸置换率. Note: The GenBank accession numbers of aligned sequences are shown in the brackets; The bootstrap values are shown at the node; Bar 0.2 means the amino acid substitution rate of 0.2.
3 讨论与结论

通过调查大庆盐碱地中水稻根内生细菌的数量和促生拮抗功能发现,水稻苗期根内生细菌丰度高于水稻成熟期,此结果与喻江[17]分离大豆和玉米根内生细菌数量的结果一致,可能由于内生细菌的数量可以随植物生长期、生长环境和寄主植物种类的变化而变化[19]的原因。成熟期的水稻根中拮抗菌株比例高于苗期,而苗期分泌IAA能力强的根内生细菌菌株比例高于成熟期,这可能由于作物不同时期生理条件不同,苗期是作物生长旺盛的时期,需要较多生长素,因此细菌分泌IAA能力较高,到了后期作物无需过多生长素即可满足自身的生长需求,所以细菌分泌IAA能力有所下降,而此时是抵御外界病害入侵的时期,所以拮抗菌株含量较多。

我们从水稻根内筛选获得一株既能分泌IAA又能抑制植物病原真菌的促生和拮抗菌株SM13。SM13菌株具有广谱性抑菌作用,对玉米新月弯孢菌、大豆菌核病菌、稻瘟病菌、禾谷镰刀菌的抑菌率分别为59.38%、78.13%、53.12%、37.50%。以前的研究也报道了不同的枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquoefaciens)、蜡状芽孢杆菌(B. cereus)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)、多粘芽孢杆菌(B. polymyxa)和芽孢杆菌亚种(Bacillus sp.)等可作为有前途的抗真菌病害生物防治剂[20-25],其根内生细菌的分离方法基本相同,唯独样品采集地点有所差异。本研究中的样品采自大庆盐碱地区,分离的SM13菌株可在pH 11.0和盐浓度10%的NA培养基中生长良好,盐浓度15%的NA培养基中也可生长。张国庆等[26]研究发现,拮抗芽孢杆菌P-25菌株在盐度范围为2%−10%、pH 5.0−8.0时均能生长,而赵庆新等[27]研究发现,耐盐碱性的枯草芽孢杆菌ZQX8可在pH 7.0−9.0和0.5−1.0 mol/L NaCl浓度下较好地生长,SM13菌株与P-25菌株和ZQX8菌株相比具有较高的耐盐碱性,在拮抗菌株[5-9, 20-25]报道中未见菌株耐盐碱性方面检验。SM13菌株与Patel等[6]、Akbaba等[7]、赵龙飞等[8]、谢学文等[9]等所分离细菌相比,具有广谱性抑菌作用,与赵龙飞等[8]、谢学文等[9]所分离细菌相比,SM13菌株能够分泌IAA。SM13菌株分泌IAA的能力为5.56±0.41 μg/mL (n=6)。不同浓度生长素对植物根系作用不同,低浓度促进根系生长,超过一定浓度则抑制根系生长。李欣欣等[28]研究表明低浓度的IAA (0.05 μg/mL和0.5 μg/mL)能够促进大豆主根伸长及侧根发育。Chen[29]研究表明0.3 μmol/L的IAA能够促进烟草BY-2细胞的伸长,对细胞分裂并无影响,在相对较高的IAA浓度下,细胞分裂加快,而细胞的伸长却受到抑制。经计算统一单位后SM13分泌IAA的能力为0.20±0.015 μmol/L,推测SM13菌株可促进水稻生长,但有待进一步验证。

从生理生化和分子生物学两个角度对SM13进行了鉴定,从生理生化方面可鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus),分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌(98.72%)或者解淀粉芽孢杆菌(98.92%)。选取3个不同功能基因进一步确定为枯草芽孢杆菌,与Bacllius subtilis MH25相似度最高(98.82%)。一般认为,16S rRNA基因序列相似性大于99%可以认为属于同一种,相似性为95%−98%可认为是同属不同种,相似性在95%以下可以认为属于不同属[26, 30-31]。SM13菌株的16S rRNA基因最高相似性均大于98%而小于99%,所以认为SM13菌株是一株枯草芽孢杆菌的新亚种。

表面活性素、伊枯草菌素和丰原素3种抗菌素是主要由芽孢杆菌通过非核糖体合成途径产生的一类抗菌肽[32],也是芽孢杆菌产生的主要活性物质,可抑制农作物病害[33],具有抗菌谱广、作用迅速强大、不易产生耐药性等优点[34]。Ambrico等[35]研究表明,枯草芽孢杆菌ET-1可产生伊枯草菌素,对柠檬的绿霉病(P. digitatum)和草莓的灰霉病(B. cinerea)防效分别为68.6%和74.1%,伊枯草菌素也可有效抑制真菌菌丝的扩展。伊枯草菌素除了抑制病原真菌也可有效防治害虫。Kumar等[36]研究表明,由解淀粉芽孢杆菌RHNK22产生的伊枯草菌素可有效抑制斜纹夜蛾(Spodoptera litura)的主要消化酶α-淀粉酶的合成,从而起到杀死害虫的作用。SM13菌株的PCR扩增结果仅获得ituA基因,未获得另两个基因,此结果与徐菱菱[18]研究结果一致,SM13菌株可能分泌Iturin类抗生素。未扩增出srfAfenB基因的原因推测有3种可能:(1) SM13菌株没有Surfactin和Fengein的合成基因;(2) SM13菌株有相关基因,但本实验中直接利用菌体进行PCR扩增导致基因丰度低而未扩增出;(3) SM13菌株的相关基因在不同生长阶段丰度不同,导致在实验生长阶段中未获得。

近年来农作物的病害日趋严重,对作物病害的生物防治是农业可持续发展的研究热点,能用来防治植物病害的拮抗菌株是生物防治的关键。因此,筛选拮抗菌株、研发生防制剂成为防治植物病害的一种安全、有效的途径。本研究从大庆盐碱稻田中分离到一株耐盐碱的水稻根内生拮抗细菌SM13,初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。水稻根内生细菌具有较多的益处,而从盐碱地水稻植物中分离出具有拮抗和促生作用内生菌的研究鲜有报道。本研究为盐碱地水稻稻瘟病以菌治菌提供了良好的菌种资源,为生物肥料和生物农药的研究提供了更多材料,希望在农业生产上具有良好的应用前景,但菌株SM13的抑菌机理、活性物质的提取以及大田施用方法等问题有待进一步研究。

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