2019, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 缪莉, 杨佳凡, 姜薇, 周惠茹, 周恒, 董昆明
- MIAO Li, YANG Jia-Fan, JIANG Wei, ZHOU Hui-Ru, ZHOU Heng, DONG Kun-Ming
- 银杏内生真菌Aspergillus oryzae YX-5抗肿瘤活性物质的分离与鉴定
- Isolation and identification of antitumor substance from endophytic fungus Aspergillus oryzae YX-5 isolated from Ginkgo biloba
- 微生物学通报, 2019, 46(4): 842-849
- Microbiology China, 2019, 46(4): 842-849
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180301
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文章历史
- 收稿日期: 2018-04-13
- 接受日期: 2018-09-17
- 网络首发日期: 2018-11-09
2. 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室 广东 广州 510301
2. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong 510301, China
生活在健康植物组织和组织间隙内的内生真菌通常能够产生生长激素或抗生素类化合物，刺激宿主植物生长，帮助植物抵御生物或非生物环境胁迫[1]。由于植物种类繁多，其内生真菌所处生态环境特殊，这使得植物内生真菌具有代谢途径多样性，可产生与宿主相同或独特的生物活性物质的能力[2-3]。因此，植物内生真菌已成为微生物天然产物的一个重要来源。
银杏，别名白果树，是重要的观赏树种和药用树种。银杏的外种皮、果实、树叶、树皮、树根等均有良好的药用价值，具有防治心脑血管疾病、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、消炎、抗血小板活化因子、延缓衰老和美容等医疗和保健功效[4-5]。然而银杏生长缓慢，严重制约其药用功效的开发。因此，从其内生真菌中寻找天然活性物质有望为银杏类药物或其他生物活性物质的开发提供新来源[6]。
目前银杏内生真菌活性物质的研究主要集中在抗菌和抗氧化活性上，有关其抗肿瘤活性的报道较少。我们在前期研究植物内生真菌抗肿瘤活性时发现14株分离自银杏树皮的内生真菌对EC109食道癌细胞具有一定的抗肿瘤活性，其中一株米曲霉Aspergillus oryzae YX-5对多种癌细胞具有显著的细胞毒活性[7-8]。张峥嵘等[9]也发现17株银杏内生真菌对A549肺癌细胞或HepG2肝癌细胞具有一定的抑制作用。因此，银杏内生真菌在抗肿瘤活性方面也应具有一定的应用潜力。本研究对菌株YX-5进行了发酵培养，以活性为导向，从其发酵产物中分离到4个化合物，其中一个化合物具有很高的抗肿瘤活性。
1 材料与方法 1.1 实验材料所采用的真菌菌株YX-5为分离自安徽阜阳银杏树皮组织的米曲霉菌Aspergillus oryzae，取材部位为距地1.5 m左右的主干树皮，厚度约3 mm−8 mm，银杏树龄30−40年，树干直径50 cm−60 cm。采用的指示肿瘤细胞为人宫颈癌HeLa细胞，购自上海复祥生物科技有限公司。
主要试剂和仪器：噻唑蓝MTT，Amresco公司；RPMl1640培养基，Gibco公司；色谱用硅胶，青岛海洋化工公司。分析型高效液相色谱仪，HITACHI公司；半制备高效液相色谱仪，北京LabTech公司；离心浓缩仪，LABCONCO公司；旋转蒸发仪，BUCHI公司；CO2培养箱，New Brunswic公司；酶标仪，上海新科公司；旋光仪，Rudolph公司；核磁共振仪、超高分辨飞行时间质谱仪，Bruker公司。
1.2 培养基细胞培养基(g/L)：RPMI-1640细胞培养基10.4，NaHCO3 2.4，HEPES 2.0，10%灭活的新生牛血清和1%二抗母液(104 U/mL青霉素和104 U/mL链霉素)，pH 7.1−7.3，经0.22 μm孔径滤膜过滤除菌，于4 ℃保存。
察氏培养基(g/L)：NaNO3 3.0，K2HPO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，FeSO4 0.01，蔗糖30.0，pH 7.0，1×105 Pa灭菌20 min。
1.3 真菌的发酵培养及代谢产物的粗提取取50 mL察氏培养基分装于250 mL三角瓶中，将活化后的菌株YX-5挖块接种于培养基中，25 ℃、110 r/min振荡培养3 d，再转入装有1.2 L培养基的2 L三角瓶中继续培养14 d。将发酵液用8层纱布过滤，用等体积乙酸乙酯萃取滤液3次，经旋转蒸发仪减压浓缩蒸干，称重后于4 ℃冰箱中避光保存。
1.4 代谢产物的分离纯化与鉴定采用减压硅胶柱、减压C18 ODS (50 µm)柱对提取到的代谢物进行初步分离。将代谢物或分离到的组分与等质量的100−200目硅胶或ODS混合搅拌研磨均匀，过夜待干；在减压柱中装入200−300目硅胶或ODS，柱高5 cm，用真空泵抽真空4 h；将拌好的样品加入减压柱中，轻轻敲打柱身使样品层表面水平，抽真空20 min，再加入1 cm高的硅胶或ODS和棉花做保护层；配制4−5个柱体积的洗脱剂，梯度洗脱，收集洗脱组分，浓缩蒸干后称重，测定活性。
采用葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20对活性组分进行进一步分离。湿法装柱，上样，以甲醇进行洗脱，控制流速25 s/滴，观察色带移动情况，待所有色带都洗脱后停止。用试管收集洗脱液，每管收集8 mL左右，每隔10管蒸干一次，用薄层层析法确定其组成是否相似，将相似的组分合并，测定抗肿瘤活性。
采用分析型HPLC对柱层析收集到各组分进行分析，采用Apollo RP-18色谱柱(5 µm，4.6 mm×250 mm)，甲醇/0.1%甲酸水梯度洗脱，流速1 mL/min，检测波长210 nm。采用半制备HPLC对活性组分进行分析制备，选用Kromasil RP-18色谱柱(10 mm×250 mm)，甲醇/0.1%甲酸水等度洗脱，流速1.5 mL/min，检测波长210 nm。对分纯的样品采用真空干燥后溶于0.5 mL氘代DMSO中进行核磁共振(NMR)分析，另取少量样品溶于二氯甲烷进行高分辨质谱(HR-ESI-MS)分析，结合核磁图谱确定活性物质结构。
1.5 抗肿瘤活性测试采用MTT法进行样品的抗肿瘤活性测定。将处于对数生长期的Hela细胞消化后稀释成6×104个/mL细胞悬液，每孔80 μL接种于96孔板中，于37 ℃的5% CO2细胞培养箱中培养24 h。用DMSO将待测样品配制成20 mg/mL，再用培养基适当稀释，每孔加入20 μL稀释后的样品液，使样品终浓度达到检测浓度。以纯细胞培养基为空白对照，添加20 μL含0.5% DMSO的培养基为阴性对照。每个处理设3个重复。继续培养48 h后，每孔添加5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37 ℃培养4 h，吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，低速振荡，待颜色均匀后用酶标仪于490 nm波长处测定OD490值，按以下公式计算抑制率：
抑制率(%)=(阴性对照组OD490值−测试组OD490值)/(阴性对照组OD490值−空白组OD490值)×100%。
2 结果与分析 2.1 发酵产物提取采用察氏液体培养基于25 ℃、110 r/min发酵真菌YX-5，共60 L，发酵液经8层纱布过滤，滤液以等体积乙酸乙酯萃取3次，浓缩蒸干后称重得到粗提物22.91 g。
2.2 代谢产物分离及抗肿瘤活性测试 2.2.1 减压柱层析采用减压硅胶柱层析对粗提物进行粗分。将粗提物用二氯甲烷溶解，与等质量硅胶拌样，干法上柱，采用纯二氯甲烷、80:1、60:1、40:1、30:1、20:1、15:1的二氯甲烷/甲醇溶液和纯甲醇作为洗脱剂，分别以5个柱体积进行梯度洗脱，收集各组分浓缩蒸干后称重，得到了8个组分，抗肿瘤活性测定显示8个组分都有一定的活性。采用HPLC进行分析检测，流动相甲醇和0.1%甲酸水溶液，30 min内洗脱梯度从5%甲醇升至100%甲醇，等梯度变化发现各组分间有较大重叠，因此将活性相对较高的几个中低极性组分混合后标记为F2，共7.23 g。
采用ODS减压柱对混合组分F2进行分离，选择40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%甲醇水溶液梯度洗脱。收集洗脱液蒸干后称重，依次标记为F2-1 (2.96 g)、F2-2 (1.66 g)、F2-3 (1.23 g)、F2-4 (0.77 g)、F2-5 (0.15 g)、F2-6 (0.55 g)、F2-7 (0.05 g)、F2-8 (0.03 g)，并测定各组分对HeLa细胞的抑制率。结果显示：前3个组分集中了大部分的代谢产物，且活性都比较高。其中以组分F2-3的抗肿瘤活性最高，在浓度为100 μg/mL时对HeLa细胞的抑制率为92.22%，在25 μg/mL时依然有74.36%的抑制率；组分F2-2的抗肿瘤活性在各测试浓度下也均高于60%；组分F2-1在较高浓度时(100 μg/mL和50 μg/mL)对HeLa细胞的抑制率在75%以上，当浓度降至25 μg/mL时其抗肿瘤活性显著下降，抑制率仅为35.17%；其他组分均无明显的抗肿瘤活性(图 1)。由于组分F2-2和F2-3极性比较接近，以极性为依据分离的方式难以将活性物质分离出来，因此采用葡聚糖凝胶进一步分离。
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| 图 1 减压ODS柱分离后各组分抗肿瘤活性 Figure 1 The antitumor activity of each fractions after vacuum ODS column separation (n=3, x±SD) |
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在高200 cm、直径4 cm的开放柱中加入溶胀的葡聚糖凝胶LH-20至150 cm高处，将组分F2-2和F2-3混合，标记为F3，质量为2.89 g，取出1.0 g用少量甲醇溶解，在装好的葡聚糖凝胶柱上湿法上柱，用甲醇溶液进行洗脱。用试管收集洗脱液，根据薄层层析判定其组成是否相似，将相似组分合并，共得到18个组分，分别测定各组分的抗肿瘤活性。结果显示：所得各组分均具有不同程度的抗肿瘤活性。在浓度为25 μg/mL时，对HeLa细胞的抑制率在70%以上的有组分F3-1 (2.6 mg)、F3-6 (16.9 mg)、F3-8 (10.1 mg)、F3-11 (34.5 mg)、F3-14 (22.1 mg)、F3-15 (15.9 mg)、F3-16 (76.5 mg)，其中组分F3-1、F3-14、F3-15的活性最高，抑制率均在85%以上(图 2)。
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| 图 2 葡聚糖凝胶柱分离后各组分抗肿瘤活性 Figure 2 The antitumor activity of each fractions after Sephadex column separation (n=3, x±SD) |
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采用半制备液相色谱对组分F3-14、F3-15进行检测，洗脱剂为甲醇:0.1%甲酸水=1:1 (体积比)。色谱显示，F3-14和F3-15纯度较高且具有相同的主峰，标记其为化合物1 (38 mg, Rt=34.75 min，图 3)。进一步测定化合物1的抗肿瘤活性，结果显示，其对HeLa细胞具有显著的细胞毒活性，半抑制浓度IC50为1.07 μg/mL (即在该浓度下化合物1对HeLa细胞的抑制率为50%)。
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| 图 3 组分F3-14的HPLC谱图 Figure 3 The HPLC spectrum of F3-14 Note: RP-18, 10×250 mm, MeOH:H2O (0.1% HCOOH)=1:1, 1.5 mL/min, 210 nm, Rt=34.75 min. |
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采用半制备HPLC对质量相对较多、活性较高的组分F3-11和F3-16进行制备，洗脱剂为甲醇:0.1%甲酸水=1:1 (体积比)。从组分F3-11中分离纯化得到化合物2 (3.1 mg)和3 (2.6 mg)，从组分F3-16中分离得到化合物1 (5.3 mg)和化合物4 (4.8 mg)。进一步测定这些化合物的抗肿瘤活性，结果显示，在测试浓度为100 μg/mL时，化合物2对HeLa细胞没有细胞毒活性，化合物3对HeLa细胞的抑制率为17.5%，化合物4对HeLa细胞具有一定的细胞毒活性，其半抑制浓度IC50为45.77 μg/mL。
2.3 化合物的结构鉴定化合物1：浅黄色油状物；[α]D25+28.8° (c 0.50，MeOH)；HR-ESI-MS分析显示准分子离子峰m/z 263.136 6 [M+Na]+ (calcd. 263.137 2)，分子组成为C12H20N2O3，不饱和度为4；13C NMR谱显示化合物有12个碳，结合HSQC，归属了相对应的氢质子。12个碳中有4个CH3 (δc 8.6，24.3，2×22.7)，2个CH2 (δc 31.9，41.4)，2个CH (δc 121.3，26.2)，4个季碳(δc 156.9，147.9，142.6，72.6)，其中C7 (δc 72.63)为氧取代季碳。从1H-1H COSY谱中连接出2个结构片段H8 (δH 1.93，2H，q，J=7.1 Hz)-H9 (δH 0.80，3H，t，J=7.1 Hz)和H11 (δH 2.54，2H，overlap)-H12 (δH 2.18，1H，m)-H13 (δH 0.89，3H，d，J=6.4 Hz)-H14 (δH 0.88，3H，d，J=6.4 Hz)。HMBC谱中H5 (δH 7.30，1H, s)和H9 (δH 0.80，3H，t，J=7.1 Hz)都与C7相关，H10与C8 (δc 31.9)及C6 (δc 142.6)相关，H11与C2 (δc 156.9)、C13 (δc 22.7)和C14 (δc 22.7)相关。结合相关文献[10]的数据，推断该物质的结构为羟基曲霉酸，其关键1H-1H COSY和HMBC相关如图 4所示。化合物1的1H和13C NMR数据归属见表 1。
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| 图 4 化合物1的关键1H-1H COSY和HMBC相关 Figure 4 The key 1H-1H COSY and HMBC correlation of compound 1 |
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| 位置 Position |
碳化学位移 δC |
氢化学位移 δH |
氢-氢相关 1H-1H COSY |
碳氢三键相关 HMBC |
| 2 | 156.9 (C) | − | − | − |
| 3 | 147.9 (C) | − | − | − |
| 5 | 121.3 (CH) | 7.30 (1H, s) | − | 7 |
| 6 | 142.6 (C) | − | − | − |
| 7 | 72.6 (C) | − | − | − |
| 8 | 31.9 (CH2) | 1.93 (2H, q, J=7.1 Hz) | 9 | − |
| 9 | 8.6 (CH3) | 0.80 (3H, t, J=7.1 Hz) | 8 | 7 |
| 10 | 24.3 (CH3) | 1.45 (3H, s) | − | 6, 8 |
| 11 | 41.4 (CH2) | 2.54 (2H, overlap) | 12 | 2, 13, 14 |
| 12 | 26.2 (CH) | 2.18 (1H, m) | 11, 13, 14 | − |
| 13 | 22.7 (CH3) | 0.89 (3H, d, J=6.4 Hz) | 12 | − |
| 14 | 22.7 (CH3) | 0.88 (3H, d, J=6.4 Hz) | 12 | − |
| OH | − | 7.54 (brs) | − | − |
| 注：−：无信号. Note: −: No signal. |
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化合物2：无色油状；[α]D25+14.5° (c 1.0，MeOH)；易溶于甲醇；HRESI-MS m/z 283.106 3 [M+Na]+ (calcd. 283.105 9)，分子组成为C14H16N2O3。1H NMR (600 MHz，DMSO-d6)：δH 1.52 (1H，m，H-3a)，1.94 (1H，m，H-3b)，3.06 (2H，dd，J=5.2，12.4 Hz，H2-3ʹ)，3.16 (1H，dd，J =3.8，12.0 Hz，H-5a)，3.54 (1H，dd，J=4.6，12.0 Hz，H-5b)，4.19 (1H，t，J=5.2 Hz，H-2′), 4.32 (1H，dd，J=6.2，11.2 Hz，H-2)，4.42 (1H，m，H-4)，5.12 (1H，brs，4-OH)，7.20 (1H，m，H-7′)，7.26−7.30 (4H，overlap，H-5′, 6′, 8′, 9′), 8.02 (1H，brs，苯丙氨酸NH)。APT (DMSO-d6, 150 MHz): 35.1 (t，C-3)，37.1 (t，C-3')，53.7 (t，C-5)，55.6 (d，C-2)，56.9 (d，C-2′)，66.7 (d，C-4)，126.2 (d，C-7′)，128.2 (d，C-6′/8′)，129.7 (d，C-5′/9′)，137.3 (s，C-4′)，165.1 (s，C-1′)，169.4 (s，C-1)。结合相关文献[11]的数据，确定该化合物为环(4-羟脯氨酸-苯丙氨酸)，结构如图 5所示。
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| 图 5 化合物2−4的化学结构 Figure 5 Chemical structures of the compounds 2−4 |
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化合物3：无色晶体；[α]D25+23.5 (c 0.6，MeOH)；易溶于甲醇；mp 261-263 ℃；HRESI-MS m/z 283.142 5 [M+Na]+ (calcd. 283.142 2)，分子组成为C15H20N2O2。1H NMR (600 MHz，DMSO-d6)：δH 0.10 (1H，m，H-3a)，0.63 (1H，m，H-3b)，0.54-0.63 (3H，overlap，H-5)，0.54−0.63 (3H，overlap，H-6)，1.40 (1H，m，H-4)，2.85 (1H，dd，J=4.8，13.3，H-3′a)，3.14 (1H, dd，J=3.0，13.3，H-3′b)，3.58 (1H，m，H-2)，4.22 (1H，m，H-2′)，7.13-7.25 (5H，m，H-5′, 6′, 7′, 8′, 9′)，7.90 (1H，brs，亮氨酸NH)，8.14 (1H，brs，苯丙氨酸NH)。结合相关文献[12]的数据，确定该化合物为环(亮氨酸-苯丙氨酸)，结构如图 5所示。
化合物4：白色粉末；[α]D25-26.5 (c 0.5，MeOH)；易溶于甲醇；HRESI-MS m/z 241.094 7 [M+Na]+ (calcd. 241.095 3)，分子组成为C12H14N2O2。1H NMR (600 MHz，DMSO-d6)：δH 0.45 (3H，d，J=6.8 Hz，H3-3)，2.85 (1H，dd，J=5.0，13.0 Hz，H-3′a)，3.10 (1H，dd，J=3.2，13.0 Hz，H-3′b)，3.61 (1H，dd，J=3.2，5.0 Hz，H-2′)，4.17 (1H，q，J=6.8 Hz，H-2)，7.14 (2H，m，H-5′/9′)，7.22 (1H，m，H-7′)，7.27 (2H，m，H-6′/8′), 8.00 (1H，brs，苯丙氨酸NH)，8.10 (1H，brs，丙氨酸NH)。结合相关文献[12]的数据，确定该化合物为环(丙氨酸-苯丙氨酸)，结构如图 5所示。
3 讨论与结论米曲霉具有出色的产酶能力，可产生多种酶类，包括蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等，因此有关米曲霉代谢产物的研究主要集中在其产酶能力及酶活性等方面。如马俊阳等[13]从一株米曲霉中分离纯化到两种蛋白酶，对酪蛋白具有很强的水解活性；Ge等[14]从米曲霉NL-1中分离到一种新的α-L-鼠李糖苷酶，具有很强的转糖基活性。相对而言，有关米曲霉小分子活性物质的研究非常少见。近期Liu等[15]从一株植物内生真菌米曲霉L1020中分离到13个新的生物碱类化合物Asperorydines A-M，其中有3个化合物对神经细胞PC12具有显著的促进增生效果。在前期研究中，我们发现一株银杏内生真菌米曲霉Aspergillus oryzae YX-5具有突出的抗肿瘤活性。因此，在本实验中对该菌株的次级代谢产物进行了进一步的研究，分离得到一个具有很强抗肿瘤活性的化合物羟基曲霉酸以及3个环二肽类化合物，其中环(丙氨酸-苯丙氨酸)和环(亮氨酸-苯丙氨酸)对HeLa细胞具有一定的细胞毒活性。活性测试结果表明，羟基曲霉酸为该菌株的主要活性化合物。实验中共分离得到该化合物43.3 mg，占总浸膏量的0.55%，产率为0.72 mg/L。但是由于还有一些活性组分没有进行分离，可能其中还有在柱层析过程中被分散或损失的羟基曲霉酸，因此，这个活性成分的产率可能应该更高一些。
有关曲霉酸类物质的研究相对较少，仅有的一些报道显示，这类化合物一般具有较好的抗菌活性。从清酒发酵菌米曲霉中分离到的曲霉酸对军团杆菌具有很强的抑制作用[10]；朱峰等[16]从榄钱附生真菌发现了具有抗菌作用的新曲霉酸；秦岭等[17-18]发现几种烟曲霉酸型甾体可以和抗生素组合，对多种耐药菌具有明显的协同抗菌作用，能降低抗生素的用量和副作用，可应用于抗耐药菌药物的生产中；司书毅等[19]分离得到一种新结构曲霉酸类衍生物脱氧新羟曲霉酸，发现其可以上调高密度脂蛋白受体表达和抑制巨噬细胞泡沫化的作用，能用于治疗动脉粥样硬化。关于曲霉酸类物质抗肿瘤活性的报道很少。陈修文等[20]从一株深海来源的曲霉菌16-02-1中分离得到新曲霉酸和新羟基曲霉酸，在100 μg/mL时对K562、LH60、HeLa和BGC-823等肿瘤细胞均具有一定的抑制作用，抑制率在21.8%−53.3%之间。本实验中分离到的羟基曲霉酸对HeLa细胞的IC50达1.07 μg/mL，显示曲霉酸类物质在抗肿瘤方面也具有一定的应用潜力，值得进一步关注。本实验中分离得到的羟基曲霉酸与脱氧新羟曲霉酸结构相似，对于其是否能用于治疗动脉粥样硬化尚需进一步的实验证明。
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