2019, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 陈秀娟, 周成, 龚劲松, 史劲松
- CHEN Xiu-Juan, ZHOU Cheng, GONG Jin-Song, SHI Jin-Song
- 芽孢杆菌N1碱性蛋白酶的克隆表达及酶学性质
- Cloning, expression and characterization of an alkaline protease from Bacillus sp. N1
- 微生物学通报, 2019, 46(4): 685-694
- Microbiology China, 2019, 46(4): 685-694
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180270
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文章历史
- 收稿日期: 2018-04-04
- 接受日期: 2018-08-28
- 网络首发日期: 2018-06-21
2. 中国科学院微生物研究所 微生物资源前期开发国家重点实验室 北京 100101
2. State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
蛋白酶广泛应用于医药[1]、皮革[2-3]、食品[4-5]、化妆品[6]等领域。其中，碱性蛋白酶用量占蛋白酶总量的50%左右。蛋白酶在动物[7]、植物[8]、微生物[9-10]中均存在。
国内外研究的碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌。目前，大量研究表明，芽孢杆菌来源蛋白酶具有较好的脱毛效果，可以应用在制革工业中[11]。在制革工业中，利用酶法脱毛比传统灰碱法脱毛的污染更小，而且反应条件温和、水解效率高，可以有效提高制革工业的生产效率和经济效益。但是，酶法脱毛会对皮革中的胶原蛋白产生降解，因此筛选出脱毛效果较好且不会损伤胶原蛋白的蛋白酶具有十分重要的意义[12]。同时，在工业生产中经常使用大量的化学试剂，因此对表面活性剂耐受性、抗氧化性以及耐碱性等是蛋白酶的重要特性。黄东彦等[13]对蜡样芽胞杆菌YSQ08来源的碱性蛋白酶基因进行研究，并成功在酵母系统进行表达，此蛋白酶最适反应温度为55℃，最适pH为8.0，但Ni2+、Hg2+等金属离子显著抑制其活性。来源于芽孢杆菌A21的丝氨酸蛋白酶分子量为29 kD，在pH 7.0-11.0稳定性较好，当pH升至12.0时，酶活迅速下降至20%以下，且氧化剂H2O2对其活性抑制作用明显[14]。
本实验室前期从内蒙古盐碱湖中筛选得到一株产碱性蛋白酶菌株，其粗酶液对表面活性剂、金属离子、氧化剂和还原剂等耐受性较好。因此本研究中采用基因组文库法克隆其碱性蛋白酶基因，尝试对筛选得到的蛋白酶进行表达及酶学性质研究，并对此蛋白酶脱毛效果进行评价。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌株和质粒芽孢杆菌N1从内蒙古盐碱湖中筛选得到；大肠杆菌DH5α和BL21(DE3) pLysS感受态，北京全式金生物技术有限公司；克隆载体pUC118 BamH I/BAP，宝生物工程(大连)有限公司；表达载体pET-28a(+)，本实验室保藏。
1.1.2 主要试剂和仪器实验中所用dNTPs、rTaq、λ-Hind Ⅲ digest、500 bp DNA ladder、DL2000 DNA marker，TaKaRa公司；Sau3A I、Buffer 1.1，Bio-Labs公司；蛋白胨、酵母粉，OXOID公司；脱脂奶粉，碧迪医疗器械有限公司。高速冷冻离心机，安徽嘉文仪器有限公司；pH计，德国赛多利斯(Sartorius)公司。
1.1.3 培养基野生菌培养基(g/L)：酵母膏1.0，胰蛋白胨10.0，氯化钠30.0，硫酸镁0.2，氯化钙0.1，磷酸氢二钾1.0，用10%碳酸钠调节pH至10.5；
筛选培养基：LB培养基中添加10.0 g/L脱脂牛奶，用10%碳酸钠调节pH至7.0；
1.2 实验方法 1.2.1 基因组文库构建及功能基因筛选将已活化的芽孢杆菌N1培养液按照1%接种量转接于200 mL野生菌培养基，培养至OD600约为0.6，收集菌体。采用酚/氯仿/异戊醇法进行芽孢杆菌N1总DNA的提取。Sau3A I酶切芽孢杆菌N1基因组，回收其中的3-8 kb酶切片段，连接至pUC118 BamH I/BAP载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，复苏后涂布至筛选培养基。筛选具有透明圈的菌落，扩大培养后提取重组质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将所获得的基因序列在NCBI上比对分析，并与相似性最高的几个蛋白酶序列进行比对。
1.2.2 重组菌构建设计引物GSF-1 (5'-CATGCCATGGATATGATT GAAGCACCAGCC-3')、GSF (5'-CATGCCATGGAT TTGAGTAAAGTGAGCCTGATTCC-3')和GSR (5'-C CGCTCGAGTAATTTAGAAGAGCTAGTTGTATATTCG-3')，以芽孢杆菌N1基因组为模板进行PCR。PCR反应体系：10×Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，引物(20 mmol/L)各1 μL，rTaq 0.25 μL，模板DNA (100 ng/μL) 0.4 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；58 ℃ 45 s；72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。用Nco I和Xho I分别双酶切PCR产物及载体pET-28a(+)，切胶回收后进行连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLysS，挑取转化子，用pET-28a(+)的通用引物T7、T7t进行PCR验证，并测序验证。
1.2.3 蛋白酶表达将重组菌按1%接种量转接至表达培养基，37℃、200 r/min培养2-3 h，至OD600约为0.6-0.8，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，20 ℃诱导20 h，室温8 000 r/min离心10 min收集菌体，破碎细胞测酶活，并进行SDS-PAGE验证。
1.2.4 酶活测定采用福林酚法进行蛋白酶活性测定，将50 μL酶液与150 μL 1%酪蛋白溶液均匀混合，在一定温度下反应10 min后，以200 μL 20%三氯乙酸溶液终止反应。室温13 000×g离心10 min后，取50 μL上清液与250μL 0.4 mol/L Na2CO3溶液混匀后，加入50 μL福林酚试剂，混合溶液置于40 ℃显色20 min，测定680 nm下的吸光度值。酶活力定义：在一定的反应条件下，蛋白酶每分钟分解产生1 μg氨基酸所需的酶量。
1.2.5 酶学性质(1) 最适温度及温度稳定性
在pH 10.0条件下，分别测定在20、30、40、45、50、55、60、65、70、80和90 ℃下AprG蛋白酶活性，以最高酶活为100%，确定最适反应温度。将AprG酶液分别放置在40、50和60 ℃分别处理10、20、30、40、50和60 min，在50 ℃和pH 10.0条件下测定其反应残余酶活，以未处理的AprG活性为100%。
(2) 最适pH及pH稳定性
在最适反应温度下，分别测定在pH 6.0、7.0、8.0、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0和12.0条件下的AprG蛋白酶活性，以最高酶活为100%，确定AprG最适反应pH。将酶液分别放置在pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和13.0处理60 min，在最适反应条件下测定AprG残余酶活，以未处理的AprG活性为100%。
(3) 金属离子对酶活的影响
向反应体系中添加不同金属离子溶液(CaCl2、KCl、MgCl2、MnCl2、BaCl2、CoCl2、LiCl、FeCl3、AlCl3、NaCl、FeCl2、ZnCl2)，使反应体系中各金属离子终浓度分别为1 mmol/L和5 mmol/L。在最适反应条件下测定AprG酶活，以未添加金属离子蛋白酶活性为100%。
(4) 表面活性剂和氧化还原剂对蛋白酶酶活的影响
向反应体系中添加不同化学试剂(吐温-20、40、60、80，Triton X-4、100，DTT和H2O2)，使反应体系中各种试剂的终浓度为1%。将SDS和β-巯基乙醇添加至反应体系中，使其终浓度为0.25%。在最适反应条件下测定AprG酶活，以未添加任何试剂的蛋白酶活性为100%。
(5) 底物特异性
配制1%不同的底物溶液，包括天青角蛋白、偶氮酪蛋白、胶原蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白、角蛋白、明胶、羊毛和羽毛，在最适反应条件下测定AprG酶活，以酪蛋白为底物时的AprG酶活性为100%。
(6) 酶学动力学参数测定
以酪蛋白为底物进行AprG酶学动力学检测，底物浓度分别配制成1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 mg/mL，按照标准酶活测定方法，在最适反应条件下进行活性检测，用GraFit软件作图并进行酶反应动力学参数计算。
1.2.6 应用研究将羊皮和兔皮切成约1 cm×1 cm的小块。将羊皮和兔皮分别放置在50 mL的缓冲剂(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)中，AprG蛋白酶含量为10 000 U，不添加AprG蛋白酶的缓冲液作为空白对照，将含有羊皮和兔皮的混合溶液置于37 ℃、120 r/min振荡培养16 h。
向250 mL三角瓶添加0.5 g羽毛，并分别添加500 U/mL的AprG酶液及市售碱性蛋白酶各50 mL，置于37 ℃、220 r/min条件下降解羽毛，48 h后对两种蛋白酶降解效果进行比较。
2 结果与分析 2.1 基因组文库构建按照基因组文库构建法，在大约4万个克隆子中，筛选获得一株产透明圈的重组菌，对该重组菌进行分离纯化，提取质粒并测序。
2.2 序列分析测序结果显示插入片段大小为2 254 bp，含有完整的开放阅读框raprG和aprG。raprG起始于ATG，大小为894 bp，编码297个氨基酸的蛋白(rAprG)，rAprG理论分子量为31.7 kD，等电点为4.65。aprG起始于TTG，大小为972 bp，编码323个氨基酸的蛋白(AprG)，AprG理论分子量为34.5 kD，等电点为4.74。AprG比rAprG多出26个氨基酸的短肽(NP)。
进一步分析发现，AprG与肽酶S8家族蛋白酶序列相似性最高，活性中心为Asp (49)、His (86)和Ser (250)。AprG氨基酸序列分别与来源于嗜碱芽孢杆菌(B. pseudofirmus) (WP_075681765.1和WP_012960798.1)、芽孢杆菌(B. marmarensis) DSM 21297 (WP_022629500.1)以及芽孢杆菌(Bacillus sp.) NKS-21 (BAA07142.1)的蛋白酶相似性最高，均高于98%，序列比对结果如图 1所示。除此之外，AprG与来自芽孢杆菌(Bacillus sp.) FJAT-45037的蛋白酶(WP_100374256.1)具有74%的相似性。上述蛋白酶中仅芽孢杆菌NKS-21的蛋白酶ISP-1有研究报道[15]，但仅限于初步的酶学性质，因而系统开展AprG的研究仍有必要。
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| 图 1 AprG序列比对 Figure 1 Multiple sequences alignment of AprG 注：实线框分别标记蛋白酶活性位点Asp、His和Ser；虚线框标记N端短肽NP. Note: The active sites Asp, His and Ser were labeled with solid boxes, respectively; N-terminal peptide was labeled with the dashed box. |
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分别以GSF-1/GSR、GSF/GSR为引物构建重组质粒pET-28a-raprG和pET-28a-aprG，将重组菌分别涂布于牛奶平板。发现重组大肠杆菌BL21(DE3) pLysS/pET-28a-raprG未产生透明圈(图 2A)，酶活测定发现无活性。而AprG重组蛋白具有蛋白水解活性(图 2B)，SDS-PAGE可见一条大小约为34 kD的蛋白条带(图 2C)，且该酶对宿主蛋白的降解进一步验证了AprG蛋白酶的表达。此结果说明，短肽NP对蛋白酶AprG的活性具有重要影响。
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| 图 2 重组菌水解平板及SDS-PAGE Figure 2 Electrophoretic analysis and hydrolysis circle of the recombinant strain 注：A：重组大肠杆菌BL21(DE3) pLysS/pET-28a-raprG；B：重组大肠杆菌BL21(DE3) pLysS/pET-28a-aprG (→：水解圈)；C：AprG蛋白电泳. M：蛋白分子标准；1：AprG粗酶液；2：大肠杆菌BL21(DE3) pLysS/pET-28a破碎液. Note: A: Recombinant strain E. coli BL21(DE3) pLysS/pET-28a-raprG; B: Recombinant strain E. coli BL21(DE3) pLysS/pET-28a-aprG (→: Hydrolysis circle); C: SDS-PAGE of AprG. M: Protein marker; 1: Crude enzyme of AprG; 2: Fractured fluid of E. coli BL21(DE3) pLysS/pET-28a. |
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图 3A为AprG酶活的最适温度曲线，其最适反应温度为50 ℃，在20-90 ℃范围内均能保留较高相对酶活，表明AprG最适反应温度范围较宽。AprG温度稳定性结果(图 3B)表明，AprG在50 ℃下具有良好的稳定性，即使处理60 min残余酶活仍有50%以上，而在60 ℃热处理10 min后残余酶活为55%，此后酶活剧烈下降。
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| 图 3 AprG蛋白酶最适反应温度和温度稳定性 Figure 3 Effect of temperature on the activity of AprG protease and its thermo-stability 注：A：AprG最适反应温度；B：AprG温度稳定性. Note: A: Effect of temperature on the activity of AprG protease; B: The thermo-stability of AprG. |
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AprG是十分典型的碱性蛋白酶，最适反应pH实验结果(图 4A)表明，当pH为10.0时AprG酶活最大，而在pH < 6.0时活性基本丧失，当pH > 11.0后酶活也会急剧下降。稳定性实验结果(图 4B)表明，AprG蛋白酶在pH 6.0-11.0处理1 h后残余酶活仍达到60%以上，而在pH 5.0或pH > 12.0时，AprG酶活损失较严重。
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| 图 4 AprG蛋白酶最适反应pH和pH稳定性 Figure 4 Effect of pH on the activity of AprG protease and its pH-stability 注：A：AprG最适反应pH；B：AprG pH稳定性. Note: A: Effect of pH on the activity of AprG protease; B: The pH-stability of AprG. |
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测定了不同离子对AprG酶活性的影响，结果如表 1所示，1 mmol/L Ba2+增强AprG活性达135%，而5 mmol/L Ba2+对AprG有轻微抑制作用。其他金属离子在1 mmol/L时对AprG活性的影响都比较小，其中Ca2+、Mn2+、Mg2+和Co2+对活性有促进作用。不同离子浓度为5 mmol/L时均能抑制AprG活性，其中Al3+的抑制作用最明显。5 mmol/L Zn2+和Fe3+对蛋白酶的抑制效果也比较明显，分别为61%和63%。从表 1数据可以看出，大部分金属离子对AprG活性影响较小。
| 金属离子Metal ions | 相对活性Relative activity (%) | |
| 1 mmol/L | 5 mmol/L | |
| K+ | 102.00±3.58 | 87.36±2.45 |
| Na+ | 106.85±1.43 | 90.61±10.50 |
| Li+ | 94.644±0.08 | 90.50±7.40 |
| Ca2+ | 109.84±2.38 | 87.66±2.34 |
| Ba2+ | 134.62±2.91 | 80.27±3.73 |
| Mn2+ | 109.00±3.77 | 80.37±2.98 |
| Mg2+ | 114.75±5.19 | 94.40±5.34 |
| Co2+ | 111.30±1.86 | 95.88±6.35 |
| Fe2+ | 100.06±5.17 | 87.24±4.85 |
| Zn2+ | 98.59±2.06 | 60.96±2.54 |
| Fe3+ | 105.79±1.34 | 62.61±0.46 |
| Al3+ | 98.27±1.05 | 33.27±1.92 |
化学试剂对AprG活性的影响结果如表 2所示，表面活性剂吐温-20、40、60、80和Triton X-4、100对AprG活性影响较小，氧化剂H2O2存在时AprG活性为87.34%，在强还原剂DTT存在时AprG活性为97.71%，然而0.25%的β-巯基乙醇完全抑制AprG酶活。巯基乙醇能够还原蛋白中的二硫键，破坏蛋白结构的完整性，进而影响蛋白的高级功能。而AprG分子中存在5个半胱氨酸，推测这些氨基酸间存在二硫键，且在维系酶蛋白的催化活性中发挥重要作用。
| 化学试剂Reagents | 浓度Concentration (%) | 相对活性Relative activity(%) |
| Tween 20 | 1.00 | 93.92±0.14 |
| Tween 40 | 1.00 | 94.06±7.70 |
| Tween 60 | 1.00 | 100.45±4.43 |
| Tween 80 | 1.00 | 107.22±1.63 |
| Triton X-4 | 1.00 | 106.57±1.55 |
| Triton X-100 | 1.00 | 100.56±2.55 |
| SDS | 0.25 | 51.44±0.84 |
| DTT | 1.00 | 97.71±4.08 |
| H2O2 | 1.00 | 87.34±1.38 |
| β-Mercaptoethanol | 0.25 | 0±6.46 |
以不同的底物测定AprG的酶活性来评价其对底物的专一性，结果见图 5。AprG对角蛋白具有较强的水解活性，以可溶性角蛋白为底物时相对酶活为69.92%，且对羊毛和羽毛这两种不同结构的角蛋白也能够进行水解，表现出的活性分别为21.77%和41.63%。AprG对胶原活性较低，其酶活仅为4.56%，因而将其作为脱毛蛋白酶使用时理论上对皮革的胶原蛋白层产生的伤害较小。AprG对其他底物也具有降解作用，在以偶氮酪蛋白为底物时，AprG活性高达246%。
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| 图 5 底物特异性 Figure 5 Substrate specificity of AprG 注：1：天青角蛋白；2：偶氮酪蛋白；3：胶原蛋白；4：牛血清白蛋白；5：酪蛋白；6：可溶性角蛋白；7：明胶；8：羊毛；9：羽毛. Note: 1: Azure keratin; 2: Azocasein; 3: Collagen; 4: BSA; 5: Casein; 6: Soluble keratin; 7: Gelatin; 8: Wool; 9: Feather. |
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以酪蛋白为底物探究重组蛋白酶AprG的酶学动力学参数中，Km和Vmax分别为12.25 mg/mL和56.60 U/(mL·min) (图 6)。
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| 图 6 重组酶的酶反应动力学参数 Figure 6 Kinetic parameters of recombinant protease |
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AprG的脱毛作用在图 7A-D中显示，由图 7可以看出，AprG对羊皮和兔皮均有显著的脱毛效果。经蛋白酶AprG脱毛后的羊皮和兔皮表面十分光滑，质地比较柔软。与化学法脱毛相比，酶法脱毛更加经济高效，对环境污染较小，适用于绿色制革生产工艺。相比于市售碱性蛋白酶，AprG降解羽毛更彻底，如图 7E-H所示。
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| 图 7 AprG蛋白酶脱毛及羽毛降解效果 Figure 7 Dehairing performance and feather degradation by the AprG protease 注：A：处理前山羊皮；B：处理后山羊皮；C：处理前兔皮；D：处理后兔皮；E：AprG处理前羽毛；F：AprG处理后羽毛；G：碱性蛋白酶处理前羽毛；H：碱性蛋白酶处理后羽毛. Note: A: The goat skin before dehairing; B: The goat skin after dehairing; C: The rabbit skin before dehairing; D: The rabbit skin after dehairing; E: The feathers before degradation by AprG protease; F: The feathers after degradation by AprG protease; G: The feathers before degradation by alkaline protease; H: The feathers after degradation by alkaline protease. |
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本文通过基因组文库法从芽孢杆菌N1基因组中克隆得到了蛋白酶基因aprG，构建了重组大肠杆菌BL21(DE3) pLysS/pET-28a-aprG，实现了AprG在大肠杆菌中的表达，并对AprG蛋白酶进行了系统的酶学性质及应用研究。
蛋白酶一般由前导肽和C端成熟肽组成，前导肽对蛋白酶的正确折叠至关重要。本文中rAprG蛋白是一个完整的成熟蛋白酶结构域，在大肠杆菌中表达时却无活性，只有在N端同时表达NP短肽时才会展现出蛋白酶活性，因此NP短肽可能是一段前导肽序列，在蛋白表达过程中影响AprG的正确折叠。另外，由于AprG能够降解宿主菌自身蛋白，会对蛋白表达产生影响，因此AprG表达时应在低温条件下进行，本文选择在20℃下诱导AprG蛋白酶表达。
AprG酶学数据显示，其最适反应温度为50 ℃，且AprG在40、50和60 ℃时活性都比较高，最适温度范围较宽。AprG最适反应温度与其他芽孢杆菌来源蛋白酶不同，如来自芽孢杆菌QD-1的蛋白酶最适反应温度为20 ℃[9]；来自地衣芽孢杆菌(B. licheniformis) 2709的蛋白酶最适反应温度为50 ℃[16]；来自枯草芽孢杆菌(B. subtilis) I15的高温蛋白酶最适反应温度为65 ℃[10]。不同行业需要的蛋白酶反应温度不同，低温蛋白酶可以用于洗涤行业[9]，而高温蛋白酶可用于纺织及食品加工等行业[17]。蛋白酶ISP-1的最适温度为55 ℃，但在40 ℃时其活性仅为60%左右，并且在反应温度为60 ℃时活性仅为25%左右[15]，本文中的AprG蛋白酶在40-80 ℃反应时活性均超过60%。同时，AprG在40 ℃和50 ℃下稳定性较好，且在60 ℃处理10 min后残留活性仍然超过50%，而蛋白酶ISP-1 60 ℃处理10 min后丧失70%活性。AprG最适反应pH为10.0，表明AprG属于碱性蛋白酶，且AprG在pH 6.0-11.0范围内较稳定，因此AprG可以在工业上应用[18-19]。
工业生产过程中会用到很多金属离子，因此要求所用蛋白酶对金属离子有一定的耐受作用[20]，本文中AprG蛋白酶受金属离子影响不大，符合工业生产要求。而表面活性剂能够与蛋白形成复合物，破坏蛋白质的盐键、氢键和疏水键，因此会对蛋白活性产生重大影响，本文中AprG在吐温、Triton等表面活性剂存在下，活性保持稳定，此结果与相似性最高的ISP-1蛋白酶一致[15]。而苍白空气芽胞杆菌(Aeribacillus pallidus) C10来源的碱性蛋白酶同样受金属离子影响较小，但在1%吐温-20、80和Triton X-100存在下，活性均小于50%[21]。同时DTT和H2O2对AprG活性影响较小。这些特性表明碱性蛋白酶AprG应用于工业生产时具有一定优势。
本文中AprG蛋白酶对羊皮和兔皮均具有脱毛作用。AprG蛋白酶底物谱研究发现，AprG胶原蛋白活性很低，而ISP-1蛋白酶胶原活性达到以酪蛋白为底物的20%以上[15]。动物皮质中含有大量的胶原蛋白，为了减少对动物皮革中胶原层的损坏，脱毛过程中需要低胶原活性蛋白酶。本文中碱性蛋白酶AprG对羽毛降解作用明显，羽毛中主要成分为角蛋白，角蛋白中半胱氨酸含量较高，易形成二硫键，使羽毛结构较为稳定，不容易被降解。而碱性蛋白酶能够作用于侧链为苯环的氨基酸或者疏水氨基酸，半胱氨酸是疏水氨基酸，能够被碱性蛋白酶降解，降解后的羽毛粉可以在皮革填充中得到应用[22]。另外，鉴于AprG酶学性质方面的优势，其在制革领域具有潜在的应用价值。本文对AprG在制革行业中的应用提供了研究基础。
| [1] |
Stenn KS, Link R, Moellmann G, et al. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase[J]. Journal of Investigative Dermatology, 1989, 93(2): 287-290. DOI:10.1111/1523-1747.ep12277593 |
| [2] |
Senthilvelan T, Kanagaraj J, Mandal AB. Application of enzymes for dehairing of skins: cleaner leather processing[J]. Clean Technologies and Environmental Policy, 2012, 14(5): 889-897. DOI:10.1007/s10098-012-0458-5 |
| [3] |
Hu J, Xiao ZB, Zhou RJ, et al. Ecological utilization of leather tannery waste with circular economy model[J]. Journal of Cleaner Production, 2011, 19(2/3): 221-228. |
| [4] |
Abdel-Naeem HHS, Mohamed HMH. Improving the physico-chemical and sensory characteristics of camel meat burger patties using ginger extract and papain[J]. Meat Science, 2016, 118: 52-60. DOI:10.1016/j.meatsci.2016.03.021 |
| [5] |
Ha M, Bekhit AEA, Carne A, et al. Characterisation of commercial papain, bromelain, actinidin and zingibain protease preparations and their activities toward meat proteins[J]. Food Chemistry, 2012, 134(1): 95-105. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.02.071 |
| [6] |
Seite S, Colige A, Piquemal-Vivenot P, et al. A full-UV spectrum absorbing daily use cream protects human skin against biological changes occurring in photoaging[J]. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine, 2000, 16(4): 147-155. |
| [7] |
Gong C, Zhou AM, Dai JL, et al. Study on the characterization of alkaline proteases from the intestine of Nile tilapia[J]. Science and Technology of Food Industry, 2010, 31(9): 197-200. (in Chinese) 龚翠, 周爱梅, 戴结玲, 等. 尼罗罗非鱼肠道碱性蛋白酶性质的研究[J]. 食品工业科技, 2010, 31(9): 197-200. |
| [8] |
Guo DQ, Ji FJ, Gao J, et al. Study on comparison of extraction methods of ficin and enzymatic characterization[J]. Hubei Agricultural Sciences, 2011, 50(6): 1258-1260. (in Chinese) 郭冬青, 纪付江, 高健, 等. 无花果蛋白酶的不同提取方法比较及酶学性质研究[J]. 湖北农业科学, 2011, 50(6): 1258-1260. DOI:10.3969/j.issn.0439-8114.2011.06.052 |
| [9] |
Wang FW, Duan SJ, Tong LJ, et al. Identification of producing low-temperature alkaline protease strains from Undaria pinnatifida and fermentation conditions and enzymatic properties[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2017, 17(2): 85-91. (in Chinese) 王凤舞, 段书娟, 仝令君, 等. 产低温碱性蛋白酶菌株QD-1的鉴定及产酶条件和酶学性质[J]. 中国食品学报, 2017, 17(2): 85-91. |
| [10] |
Weng HB, Jing WR, Yang DL, et al. Screening and characterization of an thermophilic alkaline crude protease from an isolated strain of Bacillus subtilis I15[J]. Journal of Zhengzhou University (Engineering Science), 2010, 31(1): 70-74. (in Chinese) 翁海波, 敬蔚然, 杨丹丽, 等. 产高温碱性蛋白酶菌株筛选及酶学性质研究[J]. 郑州大学学报:工学版, 2010, 31(1): 70-74. |
| [11] |
Pan J, Huang Q, Zhang YZ. Gene cloning and expression of an alkaline serine protease with dehairing function from Bacillus pumilus[J]. Current Microbiology, 2004, 49(3): 165-169. |
| [12] |
Zhang RX, Gong JS, Su C, et al. Biochemical characterization of a novel surfactant-stable serine keratinase with no collagenase activity from Brevibacillus parabrevis CGMCC 10798[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 93: 843-851. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2016.09.063 |
| [13] |
Huang DY, Mazu S, Zhu H, et al. Recombinant expression of the alkaline protease aprA gene from Bacillus cereus YSQ08 in Pichia pastoris[J]. Modern Food Science and Technology, 2016, 32(12): 105-112. (in Chinese) 黄东彦, Mazu S, 朱辉, 等. 蜡样芽胞杆菌YSQ08碱性蛋白酶aprA基因在毕赤酵母中的表达[J]. 现代食品科技, 2016, 32(12): 105-112. |
| [14] |
Haddar A, Agrebi R, Bougatef A, et al. Two detergent stable alkaline serine-proteases from Bacillus mojavensis A21: purification, characterization and potential application as a laundry detergent additive[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(13): 3366-3373. DOI:10.1016/j.biortech.2009.01.061 |
| [15] |
Yamagata Y, Ichishima E. A new alkaline serine protease from alkalophilic Bacillus sp.: Cloning, sequencing, and characterization of an intracellular protease[J]. Current Microbiology, 1995, 30(6): 357-366. DOI:10.1007/BF00369863 |
| [16] |
Zhang H, Zhang S, Zhang N, et al. Purification and properties of alkaline protease from B. licheniformis 2709[J]. Modern Food Science and Technology, 2010, 26(2): 129-132, 148. (in Chinese) 张浩, 张帅, 张娜, 等. 地衣芽孢杆菌2709蛋白酶分离纯化与性质[J]. 现代食品科技, 2010, 26(2): 129-132, 148. |
| [17] |
Zhang L, Sun M, Liu Y, et al. Research on enzyme characteristics and fermentation conditions of the thermophilic neutral protease-producing strain KN1[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2011, 27(30): 177-181. (in Chinese) 张蕾, 孙萌, 刘岳, 等. 耐高温中性蛋白酶产生菌株KN1的部分酶学性质及发酵条件的研究[J]. 中国农学通报, 2011, 27(30): 177-181. |
| [18] |
Vojcic L, Pitzler C, Körfer G, et al. Advances in protease engineering for laundry detergents[J]. New Biotechnology, 2015, 32(6): 629-634. DOI:10.1016/j.nbt.2014.12.010 |
| [19] |
Anwar A, Saleemuddin M. Alkaline proteases: a review[J]. Bioresource Technology, 1998, 64(3): 175-183. DOI:10.1016/S0960-8524(97)00182-X |
| [20] |
Haddar A, Bougatef A, Agrebi R, et al. A novel surfactant-stable alkaline serine-protease from a newly isolated Bacillus mojavensis A21. Purification and characterization[J]. Process Biochemistry, 2009, 44(1): 29-35. |
| [21] |
Yildirim V, Baltaci MO, Ozgencli I, et al. Purification and biochemical characterization of a novel thermostable serine alkaline protease from Aeribacillus pallidus C10: a potential additive for detergents[J]. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2017, 32(1): 468-477. DOI:10.1080/14756366.2016.1261131 |
| [22] |
Zhao L, Zhou HL, Hua J. New progress in utilization of feather fibers[J]. China Leather, 2011, 40(5): 36-40. (in Chinese) 赵玲, 周华龙, 华坚. 羽毛角蛋白的资源化利用新进展[J]. 中国皮革, 2011, 40(5): 36-40. |