微生物学通报  2019, Vol. 46 Issue (3): 638−644

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朱梦莲, 王丽, 李健春, 樊均明
ZHU Meng-Lian, WANG Li, LI Jian-Chun, FAN Jun-Ming
流感嗜血杆菌ATCC49247来源的IgA酶理化性质及其对低糖基化IgA1的分解作用
Physicochemical properties of IgA protease from Haemophilus influenzae ATCC49247 and its decomposition of IgA1 with low glycosylation
微生物学通报, 2019, 46(3): 638-644
Microbiology China, 2019, 46(3): 638-644
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180519

文章历史

收稿日期: 2018-07-04
接受日期: 2018-12-06
网络首发日期: 2018-12-25
流感嗜血杆菌ATCC49247来源的IgA酶理化性质及其对低糖基化IgA1的分解作用
朱梦莲1,2 , 王丽2 , 李健春2 , 樊均明2,3     
1. 西南医科大学附属中医医院肾病内科    四川  泸州    646000;
2. 西南医科大学附属中医医院  中西医结合研究中心    四川  泸州    646000;
3. 成都医学院    四川  成都    610000
摘要: 【背景】 近年来,能够特异性切割人IgA1分子的IgA蛋白酶(IgA酶)被认为是治疗IgA肾病(IgAN)的潜在药物,但各种物理化学因素均可能影响其生物学活性。【目的】 研究流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) ATCC49247 IgA酶的理化性质,确定IgA酶最适的作用条件后观察IgA酶对低糖基化IgA1的作用。【方法】 从细菌培养液中分离纯化IgA酶,SDS-PAGE电泳后银染法分别检测多种理化条件下IgA酶的水解活性及其对低糖基化IgA1的消化作用。【结果】 H. influenzae ATCC49247 IgA酶可耐受的反应温度较广,最适温度为50 ℃;在高于60 ℃的环境中,IgA酶便不可逆地丧失了稳定性;IgA酶在pH 6.0-9.0的环境下能够保持完整催化活性;1 mmol/L的PMSF和高于10 mmol/L的SDS能够强烈地抑制IgA酶的活性,DTT和EDTA对IgA酶活性无明显影响;所有浓度的Al3+、Fe3+和高浓度的Cu2+、Zn2+、Fe2+对IgA酶均表现出强烈的抑制作用,同时Co2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+和Mg2+都对IgA酶活性没有明显影响。选择了最适宜的IgA酶作用条件,发现IgA酶能够有效降解低糖基化IgA1底物。【结论】 确定IgA酶最适宜的作用条件能保持良好的酶活性,更好地发挥了IgA酶对低糖基化IgA1的降解作用,为IgA酶的临床研究和药用价值的进一步开发提供一定的依据。
关键词: IgA酶    Haemophilus influenzae ATCC49247    理化性质    IgAN    
Physicochemical properties of IgA protease from Haemophilus influenzae ATCC49247 and its decomposition of IgA1 with low glycosylation
ZHU Meng-Lian1,2 , WANG Li2 , LI Jian-Chun2 , FAN Jun-Ming2,3     
1. Department of Nephrology, The Affiliated Traditional Medicine Hospital of Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan 646000, China;
2. Research Center of Integrated Chinese and Western Medicine, The Affiliated Traditional Medicine Hospital of Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan 646000, China;
3. Chengdu Medical College, Chengdu, Sichuan 610000, China
Abstract: [Background] Recently, IgA proteases that specifically cleave human IgA1 molecules have been considered as potential drugs for the treatment of IgA nephropathy (IgAN), but its biological activity may be affected by various physical and chemical factors. [Objective] To explore the physicochemical properties of Haemophilus influenzae ATCC49247 IgA protease for determining the optimal conditions and then to observe its decomposition of low glycosylated IgA1. [Methods] IgA protease was isolated and purified from the bacterial culture solution and the hydrolysis activity of IgA protease and its decomposition of low glycosylated IgA1 were detected by SDS-PAGE electrophoresis under various physicochemical conditions. [Results] H. influenzae ATCC49247 IgA protease tolerated a wide range of temperatures and the optimum temperature is 50 ℃. IgA protease irreversibly lost stability above 60 ℃. IgA protease maintained full catalytic activity between pH 6.0 and 9.0. PMSF of 1 mmol/L and SDS of above 10 mmol/L strongly inhibited the activity of IgA protease, whereas DTT and EDTA had no significant effect on its activity. IgA protease was obviously inhibited by all concentrations of Al3+, Fe3+ and high concentration of Cu2+, Zn2+ and Fe2+, whereas Co2+, Mn2+, Ca2+, Ni2+ and Mg2+ had no significant effect on its activity. By selecting the most suitable conditions for IgA protease, we found that most of the low-glycosylated IgA1 substrate could be degraded by IgA protease. [Conclusion] IgA protease can maintain good enzyme activity under the optimal conditions, when exerting the degradation of low glycosylated IgA1 and the result lays the fundation for the clinical research and the further development of the medicinal value for IgA protease.
Keywords: IgA protease    Haemophilus influenzae ATCC49247    Physiochemical character    IgAN    

IgA肾病(IgAN)是常见的原发性肾小球肾炎疾病,也是终末期肾脏疾病的主要病因,目前尚无有效治疗手段。其确切发病机制至今未明,但现已广泛认为机体异常糖基化(低糖基化) IgA1及其免疫复合物的形成和沉积是IgAN疾病发生的共同特点和中心环节,因此以清除低糖基化IgA1及其免疫复合物为治疗靶点的药物设计和研发具有广阔前景。IgA蛋白酶(IgA酶)是由许多致病细菌分泌的一组内切肽酶,可以特异性切割人IgA1分子的铰链区,具有对IgA1底物的高度专一性[1],它在不同物种和菌株之间也显示出活性多样性[2-3],通常其活性可以通过对IgA1底物的消化作用来评估。IgA酶对IgA1分子特异性切割的这种独特优势被创造性地用于IgAN治疗研究,如Lamm等早在2008年报道了流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)来源的IgA酶在体内能有效地清除Passive IgAN小鼠模型中沉积于肾小球的IgA1免疫复合物[2],但这是针对正常的IgA1分子,并不能完全模拟IgAN病理条件下IgA1的异常糖基化状态,因此我们的团队前期做了一些创新性探索,研究了不同病原菌来源的IgA酶对低糖基化IgA1的作用[4-5],并通过筛选了多种细菌菌株后最终鉴定出了流感嗜血杆菌ATCC49247来源的IgA酶具有最高的活性[6-7],但IgA酶的生物学活性容易受作用底物的特性、温度、pH值和抑制剂等物理化学因素的影响。

考虑到理化因素对IgA酶活性的影响不利于其药用价值的进一步开发,因此本研究首次从6个方面对高活性的H. influenzae ATCC49247 IgA酶进行了系统性理化性质研究分析,在确定了IgA酶最适宜的作用条件后选择了最优作用条件观察了IgA酶对低糖基化IgA1的降解作用,这将更好地保持IgA酶的活性从而发挥其对IgAN的治疗作用。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 流感嗜血杆菌和IgA酶

流感嗜血杆菌ATCC49247购自上海川翔生物科技有限公司,IgA酶来源于流感嗜血杆菌ATCC49247。

1.1.2 主要试剂和仪器

血琼脂基础,OXOID公司;脱纤维兔血,自制;快速银染试剂盒(P0017S),上海碧云天生物技术有限公司;人骨髓瘤患者IgA1,Fitzgrald公司;苯甲基磺酰氟(PMSF),南京凯基生物有限公司;唾液酸酶(NA)、β-半乳糖苷酶(GA)、生物素标记的HAA凝集素、HRP-avidin二抗、二硫苏糖醇(DTT)、十二烷基磺酸钠(SDS)和EDTA,Sigma公司。CO2培养箱,Thermo公司;化学发光成像系统、梯度PCR仪、小型Trans-Blot®转印槽,Bio-Rad公司。

1.1.3 培养基

称取3.9 g血琼脂基础,100 mL双蒸水溶解后经1×105 Pa灭菌20 min,待冷却至50 ℃左右于无菌条件下加入脱纤维兔血5 mL,摇匀后立即倾注灭菌平板或制成斜面,待凝固后4 ℃保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 流感嗜血杆菌的培养和IgA酶的提取与纯化

流感嗜血杆菌常规培养后从细菌培养液中分离纯化IgA酶,IgA酶的提取与纯化参照我们前期的实验[6],纯化后采用ELISA法检测IgA酶的活性,利用抗人IgAI Kappa抗体捕捉人IgA1,与提取的IgA酶37 ℃作用2 h,若样品中具有IgA酶活性,则会消化去除IgA1 Fc段,从而导致酶标抗体不能与之结合,OD值出现下降。

1.2.2 IgA酶最适作用温度的研究

IgA酶与IgA1于30-80 ℃作用2 h,SDS-PAGE电泳后银染分析酶的最适作用温度。

1.2.3 IgA酶热稳定性的研究

IgA酶于30-80 ℃处理30 min后,与IgA1 37 ℃孵育2 h,SDS-PAGE电泳后银染分析温度对酶活性的影响。

1.2.4 IgA酶最适作用pH值的研究

IgA酶于37 ℃与pH 3.0-10.0等体积的缓冲液作用1 h后,与底物IgA1作用2 h,SDS-PAGE电泳后银染分析酶的最适作用pH值。

1.2.5 常用化学试剂对IgA酶活力的影响

蛋白酶抑制剂PMSF、还原剂DTT、金属离子螯合剂EDTA和离子型去污剂SDS是生化反应体系中常用的4种试剂。本研究中IgA酶于37 ℃分别与这4种试剂作用1 h后,与底物IgA1作用2 h,SDS-PAGE电泳后银染分析化学试剂对酶活力的影响。

1.2.6 金属离子对IgA酶活力的影响

IgA酶与等体积的不同浓度(5、10、30、50 mmol/L)的金属离子(Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+) 37 ℃作用1 h后,再加入IgA1作用2 h,SDS-PAGE电泳后银染分析金属离子对酶活性的影响。

1.2.7 IgA酶对低糖基化IgA1的作用

IgA1分别与唾液酸酶(NA)、β-半乳糖苷酶(GA)、唾液酸酶+β-半乳糖苷酶于37 ℃去糖基化处理6 h后,与IgA酶于37 ℃作用2 h,SDS-PAGE电泳后银染分析IgA酶对低糖基化的IgA1分解作用,IgA1的低糖基化程度通过ELISA和Western blot法检测HAA进行验证。

1.3 数据统计与分析

所得统计数据采用平均值±标准差表示,用SPSS 17.0软件进行统计学分析,多组间的比较采用方差分析,多组间的两两比较采用SNK或Dunett法,P < 0.001,差异有统计学意义。

2 结果与分析 2.1 ELISA法检测IgA酶的活性

为了验证H. influenzae ATCC49247分泌的IgA酶相对活性,采用双抗体夹心ELISA法定量检测IgA酶的相对活性。在IgA酶消化IgA1底物前,先将IgA1通过免疫吸附的方式用抗人IgA kappa抗体捕获固定在塑料基质上,酶消化作用可以切割掉被捕获的IgA1的Fc片段,只留下被捕获的Fab片段,然后再用HRP酶标记的抗人IgA1 Fc片段特异抗体进行定量检测,如果IgA酶的活性相对较高,则消化后残留的完整IgA1分子较少,ELISA检测信号值低,反之,则信号值高。按照上述基本原理将IgA酶用以消化免疫吸附固定化的IgA1底物,然后采用ELISA显色方式进行酶相对活性分析,结果如图 1所示,H. influenzae ATCC49247来源的IgA酶显示出良好的酶活性。

图 1 H. influenzae ATCC49247 IgA酶的活性 Figure 1 Catalytic activities of IgA proteases from H. influenzae ATCC49247 注:数据代表 3个独立的重复,每个柱代表与阴性对照(H2O)相比OD值降低百分比的平均值±SEM. Note: Data represent 3 independent replicates and each bar represents mean ± SEM for the percentage of reduction of OD value compared with the negative control (H2O).
2.2 IgA酶理化性质的分析

2.2.1 IgA酶最适反应温度的研究

将5 ng IgA酶分别与0.5 g IgA1在30-80 ℃的温度范围内孵育2 h,然后对酶消化产物进行SDS-PAGE凝胶电泳,分析IgA1的降解状况。如图 2A所示,H. influenzae ATCC49247 IgA酶可耐受的反应温度较广,在30-50 ℃范围内表现出强的酶活性,甚至在80 ℃时仍有明显的催化活性。

图 2 流感嗜血杆菌IgA酶理化性质测定 Figure 2 Determination of physicochemical properties of H. influenzae ATCC49247IgA protease 注:图Aa–e分别是温度、热稳定性、pH值、生化试剂对IgA酶活性影响的银染结果;图B是10种常见金属离子对IgA酶活性影响的银染结果;M:蛋白标志物;H和L表示完整的H(α)和L多肽链,Fc和Fd表示IgA蛋白酶在IgA铰链处切割后的H链片段. Note: Figure Aa–e are the results of silver staining of temperature, thermal stability, pH, and biochemical reagents on IgA enzyme activity; Figure B is the result of silver staining of 10 common metal ions on IgA enzyme activity; M: Protein marker; H and L indicate intact H(α) and L polypeptide chains, and Fc and Fd indicate the H chain fragments after IgA protease cleavage at the IgA hinge.

2.2.2 IgA酶热稳定性的研究

预先将5 ng IgA酶在不同的温度(30-80 ℃)下孵育30 min,然后再与0.5 g IgA1 37 ℃共同孵育2 h。如图 2Ab结果显示,H. influenzae ATCC49247 IgA酶在高于60 ℃的环境中,就不可逆地丧失了稳定性/活性,其与IgA酶热变性有关。

2.2.3 pH对IgA酶活性的影响

将5 ng IgA酶在不同pH值的反应缓冲液中37 ℃预处理1 h,然后再加入0.5 g IgA1消化2 h。如图 2Ac结果显示,IgA酶在碱性环境下(包括pH 10.0)可以保持完整的催化活性,而在pH≤5.0时只表现出具有部分活性,可能与IgA酶在酸性环境下丧失了热稳定性有关。结果表明,H. influenzae ATCC49247 IgA酶属于嗜碱性蛋白酶。

2.2.4 常规生化试剂对IgA酶活性的影响

将5 ng IgA酶在含有不同浓度的PMSF/DTT/ EDTA/SDS反应溶液中37 ℃预处理1 h后,再加入0.5 g IgA1底物进行2 h的消化反应,消化产物进行电泳染色分析。如图 2Ad结果所示,1 mmol/L的PMSF便可以强烈地抑制IgA酶的活性,DTT对IgA酶活性则无明显影响。图 2Ae结果显示IgA酶不受EDTA的影响,而高于10 mmol/L的SDS能够完全抑制IgA酶的活性。

2.2.5 金属离子对IgA酶活性的影响

5 ng IgA酶在含不同浓度的Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+反应缓冲液中37 ℃预处理1 h,再加入0.5 g IgA酶消化2 h,SDS-PAGE电泳后银染分析IgA1的降解情况。如图 2B所示,金属离子Al3+和Fe3+对IgA酶均表现出强烈的抑制作用,同时Co2+、Mn2+和Mg2+都对IgA酶活性没有影响,各浓度Ca2+对IgA酶活性无明显抑制作用,且IgA酶在较广浓度范围的Ni2+下仍可以维持一定的活性。另外,IgA酶可以耐受低浓度的Fe2+和Cu2+,但低浓度Zn2+可以部分抑制IgA酶活性,且高浓度Cu2+可以抑制其活性。

2.3 IgA酶对人工低糖基化处理IgA1的分解作用

在系统分析IgA酶的理化性质后,选择最适宜的温度,偏碱性的缓冲体系,排除了一些影响其活性的金属离子因素,观察了适宜作用条件下IgA酶对低糖基化IgA1作用。首先,对人多发性骨髓瘤来源IgA1进行唾液酸酶(NA)和半乳糖苷酶(GA)处理,制备低糖基化IgA1,再与IgA酶于37 ℃作用2 h,并采用可以特异结合IgA1去糖基化后暴露的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)末端的蜗牛凝集素(HAA)检测IgA1的糖基化状态,将HAA与ELISA方法相结合,可以定量分析IgA1的糖基化状态。如图 3A所示,正常IgA1经过唾液酸酶(NA)或半乳糖苷酶(GA)处理之后,HAA对IgA1的结合能力变强,而IgA1在经过唾液酸酶和半乳糖苷酶(NA/GA)同时处理之后,凝集素对IgA1的结合力进一步增强,说明唾液酸酶和半乳糖苷酶的处理可以明显降低IgA1的糖基化状态(P < 0.001)。通过Western blot方法确认这种去糖基化酶处理后IgA1的糖基化状态(图 3B)。去糖基化处理后IgA1的变性凝胶电泳蛋白条带分布无明显变化(图 3C3Da),将不同方式低糖基化处理的IgA1经过IgA酶消化后,电泳结果说明,去唾液酸化处理并不会影响IgA酶对底物IgA1的消化作用,但去半乳糖苷酶处理(单独处理或与唾液酸酶合并处理)可以部分抑制IgA酶的降解作用(图 3Db),但大部分低糖基化IgA1底物仍可以被IgA酶充分降解。以上实验数据显示,虽然IgA1的低糖基化状态可以部分抑制IgA酶的分解作用,但IgA酶仍可以降解大部分低糖基化IgA1底物。

图 3 IgA酶对人工低糖基化处理的IgA1分解作用 Figure 3 The effect of IgA protease on IgA1 with low glycosylation 注:A:正常IgA1经过唾液酸酶(NA)和半乳糖苷酶(GA) 37 ℃处理6 h后,采用HAA/ELISA方法检测糖基化状态, 每个处理重复3次,结果表示为Mean OD450±SD;B:Western blot检测IgA1的低糖基化状态(重链),HAA用来特异识别低糖基化IgA1,IgA特异抗体用以识别总IgA1;C:SDS-PAGE变性凝胶电泳分析IgA1人工去糖基化处理体系中等量的IgA1、唾液酸酶、半乳糖苷酶的电泳图谱;D:M:蛋白标志物;IgA1经过不同的去糖基化酶(唾液酸酶和半乳糖苷酶单独处理,或以上两种酶同时处理) 37 ℃处理6 h后,与提取的H. influenzae ATCC49247 IgA酶于37 ℃作用2 h,SDS-PAGE凝胶电泳分析. NA:唾液酸酶处理的IgA1;GA:半乳糖苷酶处理的IgA1;NA/GA:唾液酸酶和半乳糖苷酶同时处理的IgA1. Note: A: Normal IgA1 was treated with neuraminidase and galactosidase for 6 h at 37 ℃, and then the glycosylation status was detected by HAA/ELISA. Each treatment was repeated three times and the results were expressed as mean OD450±SD; B: Western blot was used to detect the hypoglycosylation status (heavy chain) of IgA1. HAA was used to specifically recognize hypoglycosylated IgA1, and IgA-specific antibodies were used to identify total IgA1; C: SDS-PAGE denaturing gel electrophoresis analysis of IgA1 artificial deglycosylation system for the amount of IgA1, neuraminidase, galactosidase electropherogram; D: M: Protein marker; IgA1 was treated with different deglycosylases (neuraminidase and galactosidase alone or simultaneously) and treated at 37 ℃ for 6 h and treated with H. influenzae ATCC49247 IgA Protease at 37 ℃ for 2 h, and then analyzed by SDS-PAGE gel electrophoresis. desIgA1: neuraminidase-treated IgA1, deGalIgA1: galactosidase-treated IgA1, des/deGalIgA1: IgA1 treated simultaneously with neuraminidase and galactosidase.
3 讨论与结论

目前临床上对IgAN无特异性治疗方法,因此开发针对其发病环节的靶向治疗很有价值,而异常糖基化IgA1及其免疫复合物的发生被公认是IgAN致病过程中的关键环节。IgA酶作为病原菌重要的一种毒力因子,能够特异性降解人IgA1分子,我们前期的实验证明不同IgA酶对低糖基化的IgA1及其免疫复合物有良好的降解作用,并筛选出H. influenzae ATCC49247来源IgA酶具有最高的酶活性,但其生物活性容易受各种物理和化学因素影响。以往的研究多集中于IgA酶在遗传多样性、血清型多样性和酶活性与病原菌致病性的关系等方面的探讨,对于IgA酶自身的理化特性研究只有零星报道。因此,本实验展开了对H. influenzae ATCC49247 IgA酶系统性理化性质的研究,观察最适宜的作用条件下IgA酶对低糖基化IgA1的作用。

在IgA酶理化性质的研究中,我们选择了6个方面进行探讨。热动力学是酶学反应的一个重要特征,热稳定性研究结果显示H. influenzae ATCC49247 IgA酶可耐受的反应温度较广,最适温度可达50 ℃,在80 ℃时仍具有较强的催化作用,这种高温下仍可以进行部分催化反应的酶学特点可能是催化反应在温度上升至可以使酶活性完全丧失的特定温度过程中,酶催化反应已经高效地发生,造成酶反应本身可以耐受较高温度的假象。在热稳定性方面,我们发现IgA酶在高于60 ℃的环境中就丧失了稳定性。我们还发现IgA酶表现出亲碱性环境的特征,甚至可以耐受pH值为10.0的碱性环境,并且没有观察到明显的酶活性抑制,这与人体弱碱性体液环境较一致。此外,几乎所有的丝氨酸蛋白酶类和金属蛋白酶类IgA酶的提取分离和活性测试实验都是在偏碱性或中性的缓冲体系中进行[8-10]。在常见生化试剂对IgA酶影响的实验中,我们进一步证实了H. influenzae ATCC49247 IgA酶的丝氨酸蛋白酶属性[11]。本研究中IgA酶活性不受EDTA和DTT影响,但可以被PMSF强烈抑制,而高于10 mmol/L的SDS可以完全抑制IgA酶的活性,这与其丝氨酸蛋白酶属性的报道相一致。另外,在本研究中,我们首次研究了常见金属离子对丝氨酸蛋白酶类H. influenzae ATCC49247 IgA酶活性的影响。我们的研究结果显示,所有浓度的Al3+、Fe3+和高浓度的Cu2+、Zn2+、Fe2+对IgA酶均表现出强烈的抑制作用,同时Co2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+和Mg2+都对IgA酶活性没有明显影响。以上理化性质部分的实验提示:H. influenzae ATCC49247 IgA酶拥有丝氨酸蛋白酶属性,其提取分离过程适合在偏碱性(pH 5.0-9.0)环境中进行,最适宜的作用温度为35-50 ℃,其活性受Al3+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Fe2+金属离子的影响。

IgA酶的天然底物IgA1蛋白分子在铰链区的丝氨酸/苏氨酸残基存在着广泛的糖基化,但在特定的疾病条件下,如IgAN、IgA1铰链区的糖基化位点通常糖基化不完全,或处于低糖基化状态(半乳糖苷修饰缺失),这种低糖基化状态的IgA1是IgAN进展中重要的因素。在本研究中,为了更好地发挥IgA酶的活性从而提高其对低糖基化IgA1的降解效应,首先对其理化性质进行6个方面的分析,之后对IgA酶的作用处理选择了50 ℃的温度,在偏碱性的缓冲体系中,避免使用影响IgA酶活性的生化试剂和金属离子,研究了IgA酶对低糖基化IgA1的作用。在将不同方式低糖基化处理的IgA1经过H. influenzae ATCC49247 IgA酶消化后,结果显示,虽然半乳糖苷酶处理能降低了IgA1对IgA酶的敏感性,但去唾液酸化处理并不会影响IgA酶对底物IgA1的消化作用,表明IgA酶仍然能够维持良好的生物活性,能有效降解大部分的低糖基化的IgA1底物。

虽然本研究对丝氨酸蛋白酶类H. influenzae ATCC49247 IgA酶理化性质进行了系统性研究,但由于实验技术上的限制,一些理化性质只能得出一个总体效应。总之,我们的研究结果初步揭示了H. influenzae ATCC49247 IgA酶较为详细的理化性质图谱,为IgA酶的作用条件提供了理论基础,有利于IgA生物蛋白酶药用价值的开发。

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