微生物学通报  2019, Vol. 46 Issue (3): 541−547

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梅建凤, 赵文渊, 易喻, 陈建澍, 张彦璐, 应国清
MEI Jian-Feng, ZHAO Wen-Yuan, YI Yu, CHEN Jian-Shu, ZHANG Yan-Lu, YING Guo-Qing
基因重组大肠杆菌表达血红素加氧酶-1及培养条件优化
Expression of heme oxygenase-1 in gene recombinant Escherichia coli and optimization of its cultivation
微生物学通报, 2019, 46(3): 541-547
Microbiology China, 2019, 46(3): 541-547
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180190

文章历史

收稿日期: 2018-03-13
接受日期: 2018-05-02
网络首发日期: 2018-06-11
基因重组大肠杆菌表达血红素加氧酶-1及培养条件优化
梅建凤 , 赵文渊 , 易喻 , 陈建澍 , 张彦璐 , 应国清     
浙江工业大学药学院    浙江  杭州    310014
摘要: 【背景】 血红素加氧酶-1 (HO-1)具有抗氧化应激、抗凋亡和抗纤维化等多种生理效应,有望成为一种新型药物应用于临床疾病的治疗。【目的】 构建表达HO-1的基因重组大肠杆菌(Escherichia coli),并优化其表达培养条件,实现HO-1高产率的表达。【方法】 PCR法克隆集胞藻(Synechocystis sp.) PCC 6803的HO-1基因(ho1),构建重组质粒pET-28a-ho1,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,单因素实验优化表达培养基的种类、诱导剂添加时间、诱导培养时间、诱导剂浓度和诱导培养温度。【结果】 构建了表达HO-1的基因重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-ho1菌株,用甘油(GY)培养基培养至菌体浓度OD600约为0.8时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导,30 ℃诱导培养6 h,HO-1的表达量最高,Ni-NTA柱分离纯化得到的HO-1收率占细胞总蛋白的10.9%。【结论】 获得了可溶性表达HO-1的基因重组大肠杆菌及其较佳的培养条件,为进一步研究集胞藻来源的HO-1的酶学性质和应用奠定了基础。
关键词: 血红素加氧酶    原核表达    大肠杆菌    表达条件优化    
Expression of heme oxygenase-1 in gene recombinant Escherichia coli and optimization of its cultivation
MEI Jian-Feng , ZHAO Wen-Yuan , YI Yu , CHEN Jian-Shu , ZHANG Yan-Lu , YING Guo-Qing     
College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou, Zhejiang 310014, China
Abstract: [Background] Heme oxygenase-1 (HO-1) has many physiological effects, such as anti-oxidative stress, anti-apoptosis and anti-fibrosis, and is expected to become a new drug for the treatment of clinical diseases. [Objective] A gene recombinant Escherichia coli was constructed for expressing HO-1, and its culture conditions were optimized to achieve the high yield of HO-1. [Methods] The gene of HO-1 (ho1) was cloned from the cell of Synechocystis sp. PCC 6803, and was recombined with the plasmid of pET-28a. The recombinant plasmid (pET-28a-ho1) was transformed into E. coli BL21(DE3). The single factor experiment was applied to optimize the type of medium, inducer adding time, cultivation time, inducer concentration and cultivation temperature for the expression of HO-1. [Results] A gene recombinant E. coli strain, BL21(DE3)/pET-28a-ho1, was successfully constructed for expressing HO-1. When the strain was cultured in glycerol medium (GY), and as the cell OD600 was about 0.8, IPTG with the final concentration of 0.1 mmol/L was added, the highest yield of HO-1 could be obtained after induction cultivation for 6 h at 30 ℃. Separation of HO-1 by Ni-NTA column accounted for 10.9% yield of the total cell protein. [Conclusion] A gene recombinant E. coli strain, and its optimal cultivation conditions were achieved for the expression of soluble HO-1, which laid a foundation for further study on the enzymatic properties and application of HO-1 from Synechocystis sp.
Keywords: Heme oxygenase    Prokaryotic expression    Escherichia coli    Optimization of cultivation    

血红素加氧酶(Heme oxygenase,EC 1.14.99.3,HO)是将血红素氧化为胆绿素的酶,包括3种类型,即HO-1、HO-2和HO-3,其中HO-1是将血红素氧化为胆绿素的主要限速酶,也称热休克蛋白32 (Hsp32)[1-2]。近些年来,关于HO-1的功能以及与疾病的关系逐渐被发现报道。首先,HO-1分解血红素,避免了血红素对细胞的损伤,催化过程中消耗了O2,减少了氧自由基生成[3];其次,HO-1的催化产物Fe2+、CO和胆红素在氧化应激中起着保护组织细胞的作用,其中Fe2+与蛋白结合形成铁蛋白,铁蛋白的形成可降低细胞内Fe2+的浓度,同时HO-1还可以上调内质网上的Fe2+通道,促进细胞内Fe2+泵出,防止由Fe2+介导的氧化应激损伤[4-5];再者,胆红素作为HO-1的代谢产物,能有效地清除氧自由基,防止细胞脂质层过氧化,而且游离胆红素比结合胆红素更能有效地抑制低密度脂蛋白分解[6]。大量研究结果表明:HO-1具有抗炎、抗氧化应激、抗凋亡、抗纤维化等生理效应,有望成为一种有效的治疗药物应用于临床[7]

目前大量文献主要集中于研究原核表达大鼠HO-1[8-10],事实上,在藻类和植物中也同样存在HO-1,但鲜有关于原核表达集胞藻来源的HO-1的研究报道。Migita等[11]指出集胞藻PCC 6803中HO-1与哺乳动物HO-1的总体结构和氨基酸序列相似度较高,且与人HO-1相似度达67%,同时预测集胞藻HO-1的三级结构与人HO-1十分相似。所以来自藻类细胞的HO-1也具有动物来源的HO-1的活性。克隆集胞藻来源的HO-1基因在大肠杆菌中表达,则具有表达效率高、成本低等优点。本文克隆了集胞藻(Synechocystis sp.) PCC 6803的HO-1基因在大肠杆菌中表达,并优化了其表达HO-1蛋白的培养条件,实现HO-1高产率的表达,为进一步研究集胞藻来源的HO-1的酶学性质和应用奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 菌株与质粒

集胞藻(Synechocystis sp.) PCC 6803、大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)感受态细胞、DH5α感受态细胞和质粒pET-28a由本实验室保存。

1.2 培养基

LB培养基(g/L):酵母浸出粉5.0,蛋白胨10.0,NaCl 10.0,pH 7.4,1×105 Pa灭菌30 min。

甘油(GY)培养基(g/L):甘油20.0,酵母浸出粉20.0,(NH4)2SO4 5.0,NaCl 5.0,Na2HPO4 15.0,KH2PO4 3.0,MgSO4 0.5,pH自然,1×105 Pa灭菌30 min。

1.3 主要试剂和仪器

引物P1和P2、平端DNA片段添dA试剂盒、T载体PCR产物克隆试剂盒(含质粒pUCm-T)、DNA胶回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;PrimeSTAR Max DNA聚合酶、琼脂糖、限制性内切酶(Nde I和Xho I),宝日医生物技术(北京)有限公司;镍-琼脂糖微球FF,杭州费乐尔生物科技有限公司。

PCR仪,Eppendorf有限公司;超声波细胞粉碎机,宁波新艺超声设备有限公司;紫外-可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司;凝胶成像系统,Bio-Rad有限公司;核酸蛋白检测仪、层析图谱采集分析仪,上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.4 表达HO-1重组大肠杆菌的构建

集胞藻RT-PCR的方法参见文献[12],设计引物P1 (5′-GGGAATTCCATATGAGTGTCAACTTA GC-3′)和P2 (5′-CCGCTCGAGCTCGAGCTAGCCTTCGGA G-3′)扩增ho1基因(Genbank:BA000022.2: 317127- 317849)。PCR反应体系:上、下游引物(100 μmol/L)各2 μL,PrimeSTAR Max DNA聚合酶25 μL,集胞藻cDNA (约100 ng) 1 μL,ddH2O补至50 μL。PCR反应条件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物3′端加碱基A后连接pUCm-T载体,转化E. coli DH5α菌株,提取阳性克隆质粒酶切验证,测序鉴定。

pUCm-T-ho1与pET-28a质粒经Nde I和Xho I双酶切后,目的基因和开环pET-28a经T4 DNA连接酶连接,重组质粒pET-28a-ho1转化E. coli BL21(DE3),提取阳性克隆质粒酶切验证,并经测序鉴定正确后,接种重组菌E. coli BL21(DE3)/ pET-28a-ho1至含卡那霉素(Kan)抗性的LB培养基中制备种子液,3%体积分数接种到Kan抗性的LB培养基,37 ℃培养2 h,加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,30 ℃、100 r/min诱导20 h,取1 mL菌液离心收集菌体,SDS-PAGE分析HO-1,SDS-PAGE的方法参见文献[13]。

1.5 重组菌表达HO-1的条件优化

重组大肠杆菌于Kan抗性的LB培养基,37 ℃、180 r/min培养12 h,按3%体积分数接种至HO-1表达培养的LB和GY培养基,30 ℃、100 r/min培养至菌液达到一定OD600后,加入IPTG或2%的乳糖诱导,继续培养一段时间,取1 mL菌液离心收集菌体,SDS-PAGE分析HO-1表达量。

首先对表达培养基的种类进行选择,然后依次对诱导剂添加时间、诱导培养时间、诱导剂浓度和诱导培养温度进行优化。

2 结果与分析 2.1 表达HO-1的重组大肠杆菌的构建

2.1.1 HO-1基因的PCR扩增

以集胞藻总RNA逆转录得到的cDNA为模板,设计的引物P1和P2引入Nde I和Xho I酶切位点,PCR产物的电泳图见图 1,可见在750 bp左右存在单一的条带,与目的基因ho1片段大小(723 bp)一致。

图 1 PCR扩增ho1的电泳图 Figure 1 Electrophoretogram of ho1 by PCR 注:M:Marker;1、2:PCR产物. Note: M: Marker; 1, 2: PCR product.

2.1.2 克隆载体pUCm-T-ho1的构建

用PrimeSTAR Max DNA聚合酶扩增出的PCR产物为平末端,PCR产物3′端加碱基A后连接pUCm-T载体,转化E. coli DH5α菌株,提取阳性克隆质粒,经Nde I和Xho I双酶切鉴定,电泳图见图 2,可见在750 bp处存在明显条带,测序结果与目的基因序列一致(比对结果略),说明pUCm-T-ho1构建成功。

图 2 阳性克隆载体双酶切后电泳图 Figure 2 Electrophoretogram of the digested cloning vector from positive clone 注:M:Marker;1、2:pUCm-T-ho1质粒使用Nde I和Xho I双酶切. Note: M: Marker; 1, 2: Plasmid pUCm-T-ho1 digested by Nde I and Xho I.

2.1.3 表达载体pET-28a-ho1的构建

pUCm-T-ho1与pET-28a质粒分别经Nde I和Xho I双酶切,目的基因ho1和开环pET-28a经T4 DNA酶连接后,转化E. coli BL21(DE3)菌株,提取阳性克隆质粒,经Nde I和Xho I双酶切,电泳图见图 3,可见在750 bp处存在明显条带,测序结果与目的基因序列一致(比对结果略),说明表达载体pET-28a-ho1构建成功。

图 3 阳性表达载体双酶切后电泳图 Figure 3 Electrophoretogram of the digested expression vector from positive clone 注:M:Marker;1:pET-28a-ho1质粒使用Nde I和Xho I双酶切. Note: M: Marker; 1: Plasmid pET-28a-ho1 digested by Nde I and Xho I.

2.1.4 重组菌表达HO-1的检测

重组ho1E. coli BL21(DE3)菌株(E. coli BL21(DE3)/pET-28a-ho1)使用LB培养基培养2 h (OD600约为0.7),加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导培养20 h,SDS-PAGE电泳分析见图 4。可见IPTG诱导的菌体(泳道2),在26.0 kD与33.0 kD之间出现一明显条带,与预估的HO-1蛋白分子量29 kD相符,未重组ho1培养的菌体,相同位置无此条带,判断该蛋白即为重组蛋白HO-1。

图 4 SDS-PAGE分析HO-1诱导表达 Figure 4 SDS-PAGE analysis of expression of HO-1 注:M:Marker;1:BL21(DE3)/pET-28a;2:BL21(DE3)/pET- 28a-ho1. Note: M: Marker; 1: BL21(DE3)/pET-28a; 2: BL21(DE3)/pET- 28a-ho1.
2.2 重组菌表达HO-1的培养条件优化

2.2.1 诱导培养基的选择

考察采用LB和GY培养基培养重组菌表达HO-1的表达量。重组菌培养至2 h后,LB培养基分别加0.5 mmol/L的IPTG和2%的乳糖诱导,GY培养基加0.5 mmol/L的IPTG诱导,继续培养20 h,SDS-PAGE分析重组菌表达HO-1的结果见图 5

图 5 培养基种类对HO-1表达的影响 Figure 5 Effects of culture medium on the expression of HO-1 注:M:Marker;1:对照组;2:LB加IPTG;3:GY加IPTG;4:LB加乳糖. Note: M: Marker; 1: Control; 2: LB+IPTG; 3: GY+IPTG; 4: LB+lactose.

图 5可知,GY培养基(泳道3)培养重组菌,经0.5 mmol/L的IPTG诱导表达HO-1,蛋白条带的颜色深度显著高于LB培养基培养的2种诱导方式,所以采用GY培养基较为合适。

2.2.2 诱导剂添加的时间

采用GY培养基,重组菌培养至OD600分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2时,加入0.5 mmol/L的IPTG,30 ℃、100 r/min培养20 h,SDS-PAGE分析HO-1表达量的结果见图 6

图 6 诱导剂添加时间对HO-1表达的影响 Figure 6 Effects of IPTG adding time on the expression of HO-1 注:M:Marker;1:对照组;2-7:添加IPTG前不同的菌液OD600 (0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2). Note: M: Marker; 1: Control; 2-7: OD600 of cells before IPTG adding (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 and 1.2).

图 6可知,HO-1表达量随着诱导前菌液OD600的增加而提高。当诱导前菌液OD600约为0.8后,HO-1的表达量不再显著增加,所以较佳的IPTG添加时间为诱导前菌液OD600约为0.8。

2.2.3 诱导培养的时间

于GY培养基培养重组菌至OD600约为0.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,30 ℃、100 r/min培养2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 h,SDS-PAGE分析相同菌体浓度下的HO-1表达量结果见图 7

图 7 诱导培养时间对HO-1表达的影响 Figure 7 Effects of cultivation time after induction on the expression of HO-1 注:M:Marker;1:对照组;2–11:不同诱导培养时间(2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 h). Note: M: Marker; 1: Control; 2–11: Cultivation time after induction (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 h).

图 7可知,重组蛋白HO-1在诱导剂加入2 h (泳道2)后开始大量积累,随着诱导培养时间的延长,相同菌体生物量的HO-1表达量在6 h (泳道4)达到最高;继续培养,HO-1的表达量逐渐下降,其原因可能是在培养后期,胞内蛋白水解酶活性逐渐增强,对HO-1产生降解作用,所以较佳的诱导时间为6 h。

2.2.4 诱导剂添加的浓度

于GY培养基培养重组菌至OD600约为0.8时,分别加入终浓度为0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0和1.25 mmol/L的IPTG,30 ℃、100 r/min培养6 h,SDS-PAGE分析HO-1表达量的结果见图 8

图 8 诱导剂IPTG浓度对HO-1表达的影响 Figure 8 Effects of the concentrations of IPTG on the expression of HO-1 注:M:Marker;1–8:不同IPTG浓度(0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25和1.5 mmol/L). Note: M: Marker; 1–8: Concentrations of IPTG (0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 and 1.5 mmol/L).

图 8可知,在IPTG浓度为0.1-0.5 mmol/L时,对HO-1表达的影响不显著,高于0.75 mmol/L后,HO-1表达量显著减少,所以较佳的IPTG诱导浓度为0.1-0.5 mmol/L。

2.2.5 诱导培养的温度

于GY培养基培养重组菌至OD600约为0.8时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,分别在25、30和37 ℃下,100 r/min培养6 h和20 h,SDS-PAGE分析HO-1表达量的结果见图 9

图 9 诱导培养温度对HO-1表达的影响 Figure 9 Effects of cultivation temperature on the expression of HO-1 注:M:Marker;1-3:培养时间6 h (25、30和37 ℃);4-6:培养时间20 h (25、30和37 ℃). Note: M: Marker; 1-3: Cultivation time 6 h (25, 30 and 37 ℃); 4-6: Cultivation time 20 h (25, 30 and 37 ℃).

图 9可知,25、30、37 ℃下诱导培养20 h,HO-1的表达量均低于6 h。在相同诱导培养时间下,30 ℃诱导培养下的HO-1表达量显著高于37 ℃,所以较佳的诱导培养温度为30 ℃。

2.3 重组菌表达HO-1的收率

采用Ni-NTA柱分离纯化表达的HO-1,用含200 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液(20 mmol/L,500 mmol/L NaCl,pH 6.5)洗脱,SDS-PAGE分析洗脱液中HO-1的结果表明,分离得到的HO-1有较高的纯度(图 10),HO-1蛋白收率占细胞总蛋白的10.9%,表明构建的重组菌株BL21(DE3)/pET-28a- ho1,在经过培养条件优化后,HO-1表达量较高。

图 10 经Ni-NTA柱分离纯化的HO-1 SDS-PAGE分析 Figure 10 SDS-PAGE analysis of HO-1 separated by Ni-NTA column 注:M:Marker;1:对照组;2:细胞裂解液;3:经Ni-NTA分离的HO-1. Note: M: Marker; 1: Control; 2: Cell disruption; 3: HO-1 separated by Ni-NTA column.
3 讨论与结论

近些年来,对血红素加氧酶的功能、与疾病之间的关系以及作为药物应用于临床疾病的治疗都有大量研究报道,血红素加氧酶作为药物开发的前景巨大。长期以来,血红素加氧酶主要通过分离分级法从肝、脾、脑等组织细胞中提取分离[14],但其缺点在于程序繁琐、产量和产率较低,虽然可供进行酶学研究,但无法满足作为临床药物开发的需求,因此迫切需要开发基因工程方法制备血红素加氧酶。本研究克隆了集胞藻(Synechocystis sp.) PCC 6803中的ho1,构建了BL21(DE3)/pET-28a-ho1菌株,表达的重组蛋白HO-1相对分子质量约为29 kD。采用单因素实验优化了表达HO-1的培养条件,使用GY培养基,在菌体浓度培养至OD600约为0.8下加入终浓度为0.1 mmol/L的诱导剂IPTG,30 ℃诱导培养6 h,HO-1表达量最高。初步采用Ni-NTA柱分离纯化重组大肠杆菌表达的HO-1,用含200 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液(20 mmol/L,500 mmol/L NaCl,pH 6.5)洗脱,获得的HO-1有较高的纯度,HO-1蛋白收率占细胞总蛋白的10.9%,表明构建的BL21(DE3)/pET- 28a-ho1基因重组菌株,在经过培养条件优化后,能高效地表达HO-1,结果为进一步研究集胞藻来源的HO-1的酶学性质和应用奠定了基础。

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