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文章信息
- 梅建凤, 赵文渊, 易喻, 陈建澍, 张彦璐, 应国清
- MEI Jian-Feng, ZHAO Wen-Yuan, YI Yu, CHEN Jian-Shu, ZHANG Yan-Lu, YING Guo-Qing
- 基因重组大肠杆菌表达血红素加氧酶-1及培养条件优化
- Expression of heme oxygenase-1 in gene recombinant Escherichia coli and optimization of its cultivation
- 微生物学通报, 2019, 46(3): 541-547
- Microbiology China, 2019, 46(3): 541-547
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180190
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文章历史
- 收稿日期: 2018-03-13
- 接受日期: 2018-05-02
- 网络首发日期: 2018-06-11
血红素加氧酶(Heme oxygenase,EC 1.14.99.3,HO)是将血红素氧化为胆绿素的酶,包括3种类型,即HO-1、HO-2和HO-3,其中HO-1是将血红素氧化为胆绿素的主要限速酶,也称热休克蛋白32 (Hsp32)[1-2]。近些年来,关于HO-1的功能以及与疾病的关系逐渐被发现报道。首先,HO-1分解血红素,避免了血红素对细胞的损伤,催化过程中消耗了O2,减少了氧自由基生成[3];其次,HO-1的催化产物Fe2+、CO和胆红素在氧化应激中起着保护组织细胞的作用,其中Fe2+与蛋白结合形成铁蛋白,铁蛋白的形成可降低细胞内Fe2+的浓度,同时HO-1还可以上调内质网上的Fe2+通道,促进细胞内Fe2+泵出,防止由Fe2+介导的氧化应激损伤[4-5];再者,胆红素作为HO-1的代谢产物,能有效地清除氧自由基,防止细胞脂质层过氧化,而且游离胆红素比结合胆红素更能有效地抑制低密度脂蛋白分解[6]。大量研究结果表明:HO-1具有抗炎、抗氧化应激、抗凋亡、抗纤维化等生理效应,有望成为一种有效的治疗药物应用于临床[7]。
目前大量文献主要集中于研究原核表达大鼠HO-1[8-10],事实上,在藻类和植物中也同样存在HO-1,但鲜有关于原核表达集胞藻来源的HO-1的研究报道。Migita等[11]指出集胞藻PCC 6803中HO-1与哺乳动物HO-1的总体结构和氨基酸序列相似度较高,且与人HO-1相似度达67%,同时预测集胞藻HO-1的三级结构与人HO-1十分相似。所以来自藻类细胞的HO-1也具有动物来源的HO-1的活性。克隆集胞藻来源的HO-1基因在大肠杆菌中表达,则具有表达效率高、成本低等优点。本文克隆了集胞藻(Synechocystis sp.) PCC 6803的HO-1基因在大肠杆菌中表达,并优化了其表达HO-1蛋白的培养条件,实现HO-1高产率的表达,为进一步研究集胞藻来源的HO-1的酶学性质和应用奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 菌株与质粒集胞藻(Synechocystis sp.) PCC 6803、大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)感受态细胞、DH5α感受态细胞和质粒pET-28a由本实验室保存。
1.2 培养基LB培养基(g/L):酵母浸出粉5.0,蛋白胨10.0,NaCl 10.0,pH 7.4,1×105 Pa灭菌30 min。
甘油(GY)培养基(g/L):甘油20.0,酵母浸出粉20.0,(NH4)2SO4 5.0,NaCl 5.0,Na2HPO4 15.0,KH2PO4 3.0,MgSO4 0.5,pH自然,1×105 Pa灭菌30 min。
1.3 主要试剂和仪器引物P1和P2、平端DNA片段添dA试剂盒、T载体PCR产物克隆试剂盒(含质粒pUCm-T)、DNA胶回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;PrimeSTAR Max DNA聚合酶、琼脂糖、限制性内切酶(Nde I和Xho I),宝日医生物技术(北京)有限公司;镍-琼脂糖微球FF,杭州费乐尔生物科技有限公司。
PCR仪,Eppendorf有限公司;超声波细胞粉碎机,宁波新艺超声设备有限公司;紫外-可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司;凝胶成像系统,Bio-Rad有限公司;核酸蛋白检测仪、层析图谱采集分析仪,上海沪西分析仪器厂有限公司。
1.4 表达HO-1重组大肠杆菌的构建集胞藻RT-PCR的方法参见文献[12],设计引物P1 (5′-GGGAATTCCATATGAGTGTCAACTTA GC-3′)和P2 (5′-CCGCTCGAGCTCGAGCTAGCCTTCGGA G-3′)扩增ho1基因(Genbank:BA000022.2: 317127- 317849)。PCR反应体系:上、下游引物(100 μmol/L)各2 μL,PrimeSTAR Max DNA聚合酶25 μL,集胞藻cDNA (约100 ng) 1 μL,ddH2O补至50 μL。PCR反应条件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物3′端加碱基A后连接pUCm-T载体,转化E. coli DH5α菌株,提取阳性克隆质粒酶切验证,测序鉴定。
pUCm-T-ho1与pET-28a质粒经Nde I和Xho I双酶切后,目的基因和开环pET-28a经T4 DNA连接酶连接,重组质粒pET-28a-ho1转化E. coli BL21(DE3),提取阳性克隆质粒酶切验证,并经测序鉴定正确后,接种重组菌E. coli BL21(DE3)/ pET-28a-ho1至含卡那霉素(Kan)抗性的LB培养基中制备种子液,3%体积分数接种到Kan抗性的LB培养基,37 ℃培养2 h,加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,30 ℃、100 r/min诱导20 h,取1 mL菌液离心收集菌体,SDS-PAGE分析HO-1,SDS-PAGE的方法参见文献[13]。
1.5 重组菌表达HO-1的条件优化重组大肠杆菌于Kan抗性的LB培养基,37 ℃、180 r/min培养12 h,按3%体积分数接种至HO-1表达培养的LB和GY培养基,30 ℃、100 r/min培养至菌液达到一定OD600后,加入IPTG或2%的乳糖诱导,继续培养一段时间,取1 mL菌液离心收集菌体,SDS-PAGE分析HO-1表达量。
首先对表达培养基的种类进行选择,然后依次对诱导剂添加时间、诱导培养时间、诱导剂浓度和诱导培养温度进行优化。
2 结果与分析 2.1 表达HO-1的重组大肠杆菌的构建 2.1.1 HO-1基因的PCR扩增以集胞藻总RNA逆转录得到的cDNA为模板,设计的引物P1和P2引入Nde I和Xho I酶切位点,PCR产物的电泳图见图 1,可见在750 bp左右存在单一的条带,与目的基因ho1片段大小(723 bp)一致。
2.1.2 克隆载体pUCm-T-ho1的构建用PrimeSTAR Max DNA聚合酶扩增出的PCR产物为平末端,PCR产物3′端加碱基A后连接pUCm-T载体,转化E. coli DH5α菌株,提取阳性克隆质粒,经Nde I和Xho I双酶切鉴定,电泳图见图 2,可见在750 bp处存在明显条带,测序结果与目的基因序列一致(比对结果略),说明pUCm-T-ho1构建成功。
2.1.3 表达载体pET-28a-ho1的构建pUCm-T-ho1与pET-28a质粒分别经Nde I和Xho I双酶切,目的基因ho1和开环pET-28a经T4 DNA酶连接后,转化E. coli BL21(DE3)菌株,提取阳性克隆质粒,经Nde I和Xho I双酶切,电泳图见图 3,可见在750 bp处存在明显条带,测序结果与目的基因序列一致(比对结果略),说明表达载体pET-28a-ho1构建成功。
2.1.4 重组菌表达HO-1的检测重组ho1的E. coli BL21(DE3)菌株(E. coli BL21(DE3)/pET-28a-ho1)使用LB培养基培养2 h (OD600约为0.7),加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导培养20 h,SDS-PAGE电泳分析见图 4。可见IPTG诱导的菌体(泳道2),在26.0 kD与33.0 kD之间出现一明显条带,与预估的HO-1蛋白分子量29 kD相符,未重组ho1培养的菌体,相同位置无此条带,判断该蛋白即为重组蛋白HO-1。
2.2 重组菌表达HO-1的培养条件优化 2.2.1 诱导培养基的选择考察采用LB和GY培养基培养重组菌表达HO-1的表达量。重组菌培养至2 h后,LB培养基分别加0.5 mmol/L的IPTG和2%的乳糖诱导,GY培养基加0.5 mmol/L的IPTG诱导,继续培养20 h,SDS-PAGE分析重组菌表达HO-1的结果见图 5。
由图 5可知,GY培养基(泳道3)培养重组菌,经0.5 mmol/L的IPTG诱导表达HO-1,蛋白条带的颜色深度显著高于LB培养基培养的2种诱导方式,所以采用GY培养基较为合适。
2.2.2 诱导剂添加的时间采用GY培养基,重组菌培养至OD600分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2时,加入0.5 mmol/L的IPTG,30 ℃、100 r/min培养20 h,SDS-PAGE分析HO-1表达量的结果见图 6。
由图 6可知,HO-1表达量随着诱导前菌液OD600的增加而提高。当诱导前菌液OD600约为0.8后,HO-1的表达量不再显著增加,所以较佳的IPTG添加时间为诱导前菌液OD600约为0.8。
2.2.3 诱导培养的时间于GY培养基培养重组菌至OD600约为0.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,30 ℃、100 r/min培养2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 h,SDS-PAGE分析相同菌体浓度下的HO-1表达量结果见图 7。
由图 7可知,重组蛋白HO-1在诱导剂加入2 h (泳道2)后开始大量积累,随着诱导培养时间的延长,相同菌体生物量的HO-1表达量在6 h (泳道4)达到最高;继续培养,HO-1的表达量逐渐下降,其原因可能是在培养后期,胞内蛋白水解酶活性逐渐增强,对HO-1产生降解作用,所以较佳的诱导时间为6 h。
2.2.4 诱导剂添加的浓度于GY培养基培养重组菌至OD600约为0.8时,分别加入终浓度为0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0和1.25 mmol/L的IPTG,30 ℃、100 r/min培养6 h,SDS-PAGE分析HO-1表达量的结果见图 8。
由图 8可知,在IPTG浓度为0.1-0.5 mmol/L时,对HO-1表达的影响不显著,高于0.75 mmol/L后,HO-1表达量显著减少,所以较佳的IPTG诱导浓度为0.1-0.5 mmol/L。
2.2.5 诱导培养的温度于GY培养基培养重组菌至OD600约为0.8时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,分别在25、30和37 ℃下,100 r/min培养6 h和20 h,SDS-PAGE分析HO-1表达量的结果见图 9。
由图 9可知,25、30、37 ℃下诱导培养20 h,HO-1的表达量均低于6 h。在相同诱导培养时间下,30 ℃诱导培养下的HO-1表达量显著高于37 ℃,所以较佳的诱导培养温度为30 ℃。
2.3 重组菌表达HO-1的收率采用Ni-NTA柱分离纯化表达的HO-1,用含200 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液(20 mmol/L,500 mmol/L NaCl,pH 6.5)洗脱,SDS-PAGE分析洗脱液中HO-1的结果表明,分离得到的HO-1有较高的纯度(图 10),HO-1蛋白收率占细胞总蛋白的10.9%,表明构建的重组菌株BL21(DE3)/pET-28a- ho1,在经过培养条件优化后,HO-1表达量较高。
3 讨论与结论近些年来,对血红素加氧酶的功能、与疾病之间的关系以及作为药物应用于临床疾病的治疗都有大量研究报道,血红素加氧酶作为药物开发的前景巨大。长期以来,血红素加氧酶主要通过分离分级法从肝、脾、脑等组织细胞中提取分离[14],但其缺点在于程序繁琐、产量和产率较低,虽然可供进行酶学研究,但无法满足作为临床药物开发的需求,因此迫切需要开发基因工程方法制备血红素加氧酶。本研究克隆了集胞藻(Synechocystis sp.) PCC 6803中的ho1,构建了BL21(DE3)/pET-28a-ho1菌株,表达的重组蛋白HO-1相对分子质量约为29 kD。采用单因素实验优化了表达HO-1的培养条件,使用GY培养基,在菌体浓度培养至OD600约为0.8下加入终浓度为0.1 mmol/L的诱导剂IPTG,30 ℃诱导培养6 h,HO-1表达量最高。初步采用Ni-NTA柱分离纯化重组大肠杆菌表达的HO-1,用含200 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液(20 mmol/L,500 mmol/L NaCl,pH 6.5)洗脱,获得的HO-1有较高的纯度,HO-1蛋白收率占细胞总蛋白的10.9%,表明构建的BL21(DE3)/pET- 28a-ho1基因重组菌株,在经过培养条件优化后,能高效地表达HO-1,结果为进一步研究集胞藻来源的HO-1的酶学性质和应用奠定了基础。
[1] |
Maines MD. The heme oxygenase system:update 2005[J]. Antioxidants and Redox Signaling, 2005, 7(11/12): 1761-1767. |
[2] |
Cerny-Reiterer S, Meyer RA, Herrmann H, et al. Identification of heat shock protein 32(Hsp32) as a novel target in acute lymphoblastic leukemia[J]. Oncotarget, 2014, 5(5): 1198-1211. |
[3] |
Kikuchi G, Yoshida T, Noguchi M. Heme oxygenase and heme degradation[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 338(1): 558-567. DOI:10.1016/j.bbrc.2005.08.020 |
[4] |
Torti FM, Torti SV. Regulation of ferritin genes and protein[J]. Blood, 2002, 99(10): 3505-3516. DOI:10.1182/blood.V99.10.3505 |
[5] |
Barañano DE, Wolosker H, Bae BI, et al. A mammalian iron ATPase induced by iron[J]. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(20): 15166-15173. DOI:10.1074/jbc.275.20.15166 |
[6] |
Clark JE, Foresti R, Sarathchandra P, et al. Heme oxygenase-1-derived bilirubin ameliorates postischemic myocardial dysfunction[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 2000, 278(2): H643-H651. DOI:10.1152/ajpheart.2000.278.2.H643 |
[7] |
Abraham NG, Kappas A. Pharmacological and clinical aspects of heme oxygenase[J]. Pharmacological Reviews, 2008, 60(1): 79-127. |
[8] |
Ishikawa K, Sato M, Yoshida T. Expression of rat heme oxygenase in Escherichia coli, as a catalytically active, full-length form that binds to bacterial membranes[J]. European Journal of Biochemistry, 1991, 202(1): 161-165. DOI:10.1111/ejb.1991.202.issue-1 |
[9] |
Wilks A, Ortiz PR. Rat liver heme oxygenase.High level expression of a truncated soluble form and nature of the meso-hydroxylating species[J]. Journal of Biological Chemistry, 1993, 268(30): 22357-22362. |
[10] |
Wu CY, Pang QF, Zeng YM, et al. Expression of rat heme oxygenase-1 gene in Lactococcus lactis[J]. Acta Universitatis Medicinalis Nanjing (Natural Science), 2006, 26(2): 101-104. (in Chinese) 吴长毅, 庞庆丰, 曾因明, 等. 大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的表达[J]. 南京医科大学学报:自然科学版, 2006, 26(2): 101-104. |
[11] |
Migita CT, Zhang XH, Yoshida T. Expression and characterization of cyanobacterium heme oxygenase, a key enzyme in the phycobilin synthesis[J]. European Journal of Biochemistry, 2003, 270(4): 687-698. DOI:10.1046/j.1432-1033.2003.03421.x |
[12] |
Yang GD, Zhang JY, Chen WL. Improving methods for preparating quantitative PCR template from the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2016, 35(6): 44-51. (in Chinese) 阳桂丹, 张巨源, 陈雯莉. Synechocystis sp.strain PCC 6803定量PCR模板制备方法的改进[J]. 华中农业大学学报, 2016, 35(6): 44-51. |
[13] |
Liu F.Cloning, expression and functional analysis of two heme oxygenase genes in Roughskin sculpin (Trachidermus fasciatus)[D].Weihai: Master's Thesis of Shandong University, 2014(in Chinese) 刘芳.松江鲈(Trachidermus fasciatus)两种血红素加氧酶基因的克隆、表达与功能分析[D].威海: 山东大学(威海)硕士学位论文, 2014 |
[14] |
Ryter SW, Kvam E, Tyrrell RM.Heme oxygenase activity current methods and applications[A]//Walker JM, Keyse SM.Methods in Molecular Biology[M].New York: Springer Publisher, 2000: 369-391
|