2019, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 宋淑芬, 杨帆, 高绣纺, 马立安
- SONG Shu-Fen, YANG Fan, GAO Xiu-Fang, MA Li-An
- 湿地法处理生活污水对仙桃湿地地表水微生物群落结构的影响
- Effects of sewage treatment on microbial community structure of surface water in Xiantao wetland
- 微生物学通报, 2019, 46(3): 512-521
- Microbiology China, 2019, 46(3): 512-521
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180222
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文章历史
- 收稿日期: 2018-03-21
- 接受日期: 2018-05-11
- 网络首发日期: 2018-06-06
2. 湿地生态与农业利用教育部工程研究中心 湖北 荆州 434025;
3. 武汉天一辉远生物科技有限公司 湖北 武汉 430000;
4. 长江大学地球环境与水资源学院 湖北 武汉 430000
2. Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland, Ministry of Education, Jingzhou, Hubei 434025, China;
3. Wuhan TianYi HuiYuan Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Hubei 430000, China;
4. School of Earth Environment and Water Resources, Yangtze University, Wuhan, Hubei 430000, China
湿地技术是20世纪70年代兴起的一种新型环保的生态污水处理工程技术[1]，因管理简单、运行费用低、生态景观相容性好等优点已被成功应用于暴雨洪水、生活污水以及富营养化水体水质净化[2-4]等方面。人工湿地系统中微生物不仅是吸附和降解污染物的主要生物群体，还是评价污染物净化能力的重要指标[5]。近年来分子生物学方法得到快速发展，尤其是低成本、自动化的高通量测序技术[6-7]不仅可以同时检测样品中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种，还能快速准确地获得样品中的微生物群落组成，在河流[8]、湖泊水库[9]等水体细菌群落结构研究中得到广泛应用。
目前关于湿地法处理污染物去除问题、湿地植物的选型、基质材料的开发与组合、湿地的构造等深入的研究较多，例如Zurita等[10]、Valipour等[11]、吕晓建等[12]的研究主要集中在如何提高人工湿地法污水处理效果方面，但湿地法污水处理对地表水的微生物群落影响研究较少，特别是在不影响特殊时期分洪条件下的闲置分洪道内半天然半人工湿地来处理城市生活污水，分洪道、湿地及其利用、微生物、生活污水处理、地表水这几项完全组合所开展的研究，即分洪道内的微生物在处理区域的生活污水及地表水水体的种群和数量变化几乎是空白。本课题着重于研究湿地法处理生活污水沿水流纵向(断面)水平位置地表水中微生物群落的结构和变化。利用分子生物学及高通量测序方法研究微生物多样性，从微观水平上探讨湿地地表水环境中微生物种群的变化情况，了解湿地地表水微生物种群和相对含量在不同水平面上的变化情况，从而了解湿地法运行过程中对湿地地表水微生物群落的影响，为后续工作提供相应的理论实践支持。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集地表水取样是从G318国道(湿地系统入口)开始向下游的中心路处200、400、600、3 000、5 000 m，以及在湿地生活污水处理厂的上游2 000 m的地方选取取样参考点，具体地理位置见图 1。水样的采集是直接将采样器放入水面下0.10−0.30 m，收集水样1 L储存在填充了足够冰块的保温箱内，使运输过程中所取样品的温度保持在4 ℃以下。到达实验室后，使用微孔滤膜(0.22 μm)过滤收集微生物菌体于滤膜上，将附集有微生物菌体的滤膜放入−80 ℃保存备用。
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| 图 1 仙桃市人工湿地方位图 Figure 1 Xiantao wetland azimuth map |
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Water DNA Kit，Omega公司；DNA纯化回收试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；核糖核酸酶RNase A，Sigma公司。PCR仪，Bio-Rad公司；超微量分光光度计，Quawell公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司。
1.2 方法 1.2.1 DNA的提取及Illumina MiSeq测序采用Water DNA Kit提取水样中DNA。DNA提取的具体步骤：用剪刀将附集有微生物菌体的滤膜剪成若干小份，放入50 mL的离心管中。加入3 mL SLX buffer和500 mg玻璃珠。在漩涡混合仪上混匀样品，70−90 ℃ (难降解的细菌)水浴10 min，在水浴过程中悬混2−3次。加入1 mL SP2 buffer混匀30 s，冰浴5 min，然后再按照试剂盒上的步骤提取水样中DNA。DNA的扩增使用的是16S rRNA基因V4区的515F和909R引物，引物序列为515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和909R (5′-CC CCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)。PCR反应体系(25 µL)：DNA样品10.0 µL，1×PCR buffer 2.5 µL，dNTPs (10 mmol/L) 4.0 µL，MgCl2 (25 mmol/L) 1.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1.0 µL，Taq DNA聚合酶(5 U/µL) 1.0 µL，ddH2O补足25 µL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。最后将纯化产物送至中国科学院成都生物研究所在Illumina MiSeq平台进行高通量测序。
1.2.2 水样环境因子指标的测定水样理化指标的测定：地表水(CODCr)按GB 11914-1989[13]测定，TN按HJ 636-2012[14]测定，TP按GB 11893-1989[15]测定，NH4+-N按GB 7479-1987[16]测定。
1.2.3 序列及统计分析测序得到的原始数据需先用Flash软件进行双末端序列融合，然后通过添加的Barcode将序列拆分回归到相应样品。先对序列质量进行质控和过滤，之后进行OTU聚类分析。计算各文库的文库覆盖率、多样性指数。再用PAST对数据进行主坐标分析，用SPSS 20.0统计软件对数据进行相关性分析的计算。高通量测序得到的原序列数据储存于NCBI，登录号为SRS3045895。
2 结果与分析 2.1 地表水样品的理化指标分析仙桃市人工湿地污水生态处理系统位于汉江杜台分洪道内，该体系包括2个95 m×50 m×5 m沉淀池和2个450 m×130 m×4 m氧化塘，以及用中间3 m宽道路分隔左右两端的350 m×6 000 m生态土壤渗滤床，其中人工栽植芦苇10万株、香蒲5万株、水生苦草种植7.5×104 m2。生物多样性调查表明，共记录鸟类34种，隶属10目20科。其中鸊鷉目、鹈形目、鹳形目、雁形目、鹤形目9科18种，现有鱼类13种。自2004年5月投入运行以来，运行状况良好，周围生态环境也保持了原有的一定秩序，仙桃市环保部门每月定期对进出水口及受纳水体的水质进行监测，监测结果显示均可达标排放。本研究在湿地生活污水处理厂的上游2 000 m的地方选取取样参考点，记为JC (−2 000 m)，在前处理完后进入湿地的200 m处设立取样点1，记为J1 (200 m)，以此类推设立取样点，分别记为J2 (400 m)、J3 (600 m)、J4 (3 000 m)、J5 (5 000 m)，各点的理化指标结果如表 1所示。
| Samples | Location (m) | COD (mg/L) | TP (mg/L) | NH4+-N (mg/L) | TN (mg/L) |
| Contrast JC | −2000 | 31.50 | 0.08 | 0.50 | 1.85 |
| J1 | 200 | 203.52 | 5.22 | 9.10 | 21.11 |
| J2 | 400 | 182.53 | 5.14 | 8.81 | 19.17 |
| J3 | 600 | 151.66 | 4.98 | 8.43 | 16.51 |
| J4 | 3 000 | 111.16 | 3.45 | 6.55 | 14.21 |
| J5 | 5 000 | 38.59 | 0.15 | 0.80 | 2.28 |
由表 1可见，生活污水经湿地法处理后湿地地表水化学需氧量(Chemical oxygen demand，COD)的范围为31.50−203.52 mg/L。J5经湿地法处理后的COD浓度为38.59 mg/L达到GB 18918-2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》[17]一级标准(COD < 50 mg/L)；类似地，J5经处理后总磷(Total phosphorus，TP)浓度0.15 mg/L达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级标准(TP < 0.5 mg/L)，J5经处理后氨态氮(NH4+-N)浓度0.8 mg/L达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级标准[c(NH4+-N) < 5 mg/L]，J5经处理后总氮(Total nitrogen，TN)浓度2.28 mg/L，达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级标准(TN < 15 mg/L)。
2.2 地表水样品的α多样性分析由表 2可知，6个地表水样的高通量测序共获得了7 777−24 785条序列，80 524条高品质的序列(平均13 421)，单个水样的OTU数量为730.8−966.7 (平均868)。Shannon-Wiener是反映样品中微生物多样性的指数，香农值越大，说明群落多样性越高。6个样品香农值的平均值为8.5，J1到J3香农值相差较小，说明微生物群落结构多样性相差较小。到J4时处于较低水平，说明原始状态下的一些微生物因无法适应新的环境而逐渐被抑制、淘汰，群落多样性降低。但是到J5处时，细菌群落多样性却出现了增长趋势，可能是水体环境达到标准后产生了某些新的微生物，因而与对照组地表水中微生物群落的多样性相似。类似地，Chaol指数的平均值为2 793.5，Chao1越大，群落种类的数量越高，最大值出现在J1，最小值出现在J5，说明200 m处微生物种类的数量高于5 000 m，可能是前期监测取样处的污染物总氮、总磷浓度太高而呈现富营养化状态，因此微生物数量多，后期理化指标值降低，营养物质少而造成微生物数量较少。各样本文库的覆盖率(Coverage)范围均在61%以上，基本能够代表湿地法处理生活污水中地表水细菌群落的真实情况。
| Samples | Total reads | Observed OTUs | Shannon Wiener | PD_whole tree | Good’s coverage | Chao1 |
| J1 | 8 910 | 912.8 | 8.4 | 58.4 | 0.62 | 3 092.1 |
| J2 | 8 237 | 966.7 | 8.7 | 59.3 | 0.61 | 3 055.5 |
| J3 | 11 839 | 937.0 | 8.7 | 60.8 | 0.63 | 2 638.8 |
| J4 | 24 785 | 730.8 | 7.6 | 57.6 | 0.70 | 2 535.6 |
| J5 | 18 976 | 802.6 | 8.7 | 53.5 | 0.70 | 2 393.2 |
| JC | 7 777 | 860.7 | 8.7 | 53.8 | 0.65 | 2 985.9 |
由图 2得知，湿地法处理后地表水环境中占主导地位的门(某一样品相对丰度 > 1%均列出)包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)。其中变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是样品中最丰富的门。5 000 m样品与前3 000 m样品及对照组相比优势门有4类，包括放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和绿弯菌门(Chloroflexi)。由此说明，经湿地法处理后的湿地地表水达标区微生物的多样性要高于理化指标值较高的区域。
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| 图 2 样品在不同门水平的相对丰度 Figure 2 Relative abundance of abundant within different phyla across the studied samples |
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某一样品相对丰度 > 2%在表 3中均列出，由表 3得出，在前600 m地表水中优势菌属共有6个，包括Methylotenera、黄杆菌属(Flavobacterium)、弓形杆菌属(Arcobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Methylophaga和Malikia，因前期理化指标值浓度较高，这些优势菌的出现可能与污水富营养程度有关。类似地，5 000 m地表水中优势菌属共有7个，包括Albidiferax、Candidatus Planktophila、Marine metagenome、Phalacroma mitra、HgcI clade、Pseudarcicella和Fluviicola。后期理化指标均达到排放标准，而这些菌属的出现可能是因为污水的净化达到标准。
| 属Genus | J1 | J2 | J3 | J4 | J5 | JC | P值P value |
| Methylotenera | 37.71 | 34.53 | 33.23 | 37.82 | 1.73 | 3.91 | 0.016 |
| Flavobacterium | 8.04 | 5.57 | 6.89 | 4.81 | 0.93 | 30.42 | 0.080 |
| Albidiferax | 3.45 | 4.32 | 3.11 | 1.52 | 14.12 | 5.90 | 0.032 |
| Arcobacter | 4.82 | 3.58 | 4.21 | 10.07 | 0.06 | 0.00 | 0.055 |
| Candidatus Planktophila | 0.14 | 0.17 | 0.27 | 0.05 | 8.52 | 0.25 | 0.311 |
| Polynucleobacter | 0.37 | 0.62 | 0.43 | 0.42 | 0.89 | 4.72 | 0.136 |
| Marine metagenome | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 4.61 | 0.00 | 0.363 |
| Phalacroma mitra | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 4.15 | 0.00 | 0.363 |
| Hydrogenophaga | 1.10 | 1.02 | 0.80 | 0.97 | 0.76 | 3.91 | 0.036 |
| HgcI clade | 0.09 | 0.17 | 0.07 | 0.05 | 3.42 | 0.00 | 0.308 |
| Sulfurimonas | 0.87 | 0.68 | 1.10 | 3.25 | 0.00 | 0.00 | 0.101 |
| Pseudomonas | 3.17 | 2.44 | 2.41 | 0.85 | 0.47 | 0.62 | 0.017 |
| Methylophaga | 2.11 | 1.87 | 2.84 | 0.46 | 0.00 | 0.00 | 0.058 |
| Pseudarcicella | 0.09 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 2.61 | 1.74 | 0.174 |
| Fluviicola | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.04 | 2.49 | 0.62 | 0.252 |
| Malikia | 2.16 | 1.36 | 1.00 | 0.70 | 0.61 | 2.30 | 0.006 |
| Sulfuricurvum | 0.32 | 0.45 | 0.57 | 2.03 | 0.06 | 0.12 | 0.104 |
主坐标分析(Principal coordinate analysis，PCoA)是直接将样本的群落构成差异反映在二维坐标图上，横、纵坐标表示最大程度反映群落构成差异的2个特征值，即第一、二主成分。由图 3可知，主坐标分析水体污染程度较高的J1 (200 m)、J2 (400 m)和J3 (600 m) 3个地表水样品的距离很近，说明这3点的微生物群落结构比较相似。J5 (5 000)和JC (−2 000 m)不与任何一个样品靠近，说明与其他样品的群落构成具有一定差异，而且样品根据处理状况(高浓度或达标)有聚类的趋势。
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| 图 3 样品的主坐标分析 Figure 3 Principal coordinate analysis of samples |
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COD是衡量水体中好氧有机物多少的一个重要指标，可直接反映水体的受污染程度[18]。为了分析湿地法处理生活污水对湿地地表水各污染物削减效应之间的关系，采用SPSS 20.0计算了湿地法处理生活污水对湿地地表水各污染物削减效应之间的相关系数。由表 4可知，湿地法处理后的生活污水各理化指标之间存在一定的相关性，COD与TP、NH4+-N和TN均呈极显著正相关(P < 0.01)，TP与NH4+-N和TN均呈极显著正相关(P < 0.01)，NH4+-N与TN呈极显著正相关(P < 0.01)。
| Index | COD (mg/L) | TP (mg/L) | NH4+-N (mg/L) | TN (mg/L) |
| COD (mg/L) | 1.000 | 0.974** | 0.971** | 0.986** |
| TP (mg/L) | 1.000 | 0.998** | 0.989** | |
| NH4+-N (mg/L) | 1.000 | 0.993** | ||
| TN (mg/L) | 1.000 | |||
| 注：**：极显著相关(P < 0.01). Note:**: Significant level for P < 0.01. |
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截止目前对仙桃分洪道湿地环境方面已有的研究报道仅发现2篇，他们主要以水文地质概况、生活污水处理效果为研究对象，而对该水域微生物多样性和菌群结构组成方面的研究基本还是空白[19-20]。本研究采用分子生物学及高通量测序方法对湿地法处理生活污水后的地表水环境中的微生物群落进行了研究，首次比较分析了微生物群落在生境修复过程中的变化，分析结果显示变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是菌群中最大的门，这与窦娜莎[21]、李思敏[22]研究结果相一致。
在原核生物多样性研究中，相关研究表明[23-24]，原核微生物的16S rRNA基因具有多拷贝，致使16S rRNA基因菌群的多样性分析会引起一定程度的高估。Sun等[23]研究表明16S rRNA基因V4−V5区域在0.03水平上显示最低的高估程度约为3.0%。本文研究针对16S rRNA基因V4区序列进行测序，V4区序列多样性的高估程度相对于其他区域是最小的，因而减少了高估误差，增强了结论的可靠性。
本研究关于湿地法处理生活污水对地表水生物群的影响，通过多样性指数、丰富度指数以及微生物类群的分布可以看出，高浓度或达标地表水中均检测到复杂菌群，但微生物群落构成有差异，5 000 m达标区样品明显表现出了更高的生物多样性(图 1)。
首先，5 000 m地表水中放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chloroflexi)的微生物所占比例明显比前3 000 m要高。放线菌门(Actinobacteria)是一类原核生物，绝大多数属于异养好氧型，具有很强的分解能力，在甾体转化、石油脱蜡和污水处理中具有重要应用[22]。该菌门在前3 000 m地表水中丰度(< 0.97%)较低，而在5 000 m (22.07%)地表水中较高，说明该菌门更易生存在净水区，可作为生活污水净化的指示性微生物。蓝藻门(Cyanobacteria)可利用太阳光能将CO2还原成有机碳化合物，并释放出自由氧，广泛分布于河流、湖泊、海洋等各种水体中。该菌门在前400 m丰度为0，但在5 000 m (8.09%)地表水中丰度最高，说明可能是后期产生的新微生物，可作为生活污水净化的指示性微生物。疣微菌门(Verrucomicrobia)是被新分类出不久的一类细菌，可培养的种类少，目前识别的种类主要发现于水体、土壤环境和人类粪便中，其生态和代谢作用尚不清楚[25]。该菌门在前3 000 m地表水中丰度(< 0.27%)较低，但5 000 m (5.82%)地表水中较高，暗示其在地表水系统中的重要作用。绿弯菌门(Chloroflexi)常存在于污泥菌胶团絮状体内部，并以絮体骨架的形式存在，为好氧颗粒污泥的结构提供骨架支撑[26]。该菌门在前3 000 m地表水中丰度(< 0.23%)较低，但5 000 m (1.66%)地表水中较高。Kragelund等[27]在对活性污泥中绿弯菌门(Chloroflexi)的生态生理学研究中发现，绿弯菌门(Chloroflexi)具有较好的生物除磷作用。从200 m到5 000 m，绿弯菌门的丰度增加也揭示了这一阶段TP降低达标的原因是绿弯菌门发挥了作用。
其次，在属水平上，构成高浓度或达标地表水主要菌群丰度较高的属也有一定差异。值得注意的是部分菌属相对丰度与环境的互作相似。如湿地地表水环境中Albidiferax、Candidatus Planktophila、Marine metagenome、Phalacroma mitra、HgcI clade、Pseudarcicella、Fluviicola等菌属随着水体污染程度的降低其相对丰度呈上升趋势，而且6个样品中Albidiferax的相对丰度具有显著差异(P < 0.05)，关于这些菌属的相关研究很少，可能是新发现的微生物体。Methylotenera、黄杆菌属(Flavobacterium)、弓形杆菌属(Arcobacter)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Sulfurimonas、Methylophaga、Malikia等菌属随着水体污染程度的降低其相对丰度呈下降趋势。黄杆菌属(Flavobacterium)为严格好养菌，有机化能营养，可将有机物氧化成无机物，同时合成新的微生物体，对于某些难降解有机物具有分解能力[28-29]。有研究发现黄杆菌属擅长降解高分子物质、蛋白质、脂类、纤维素等大分子颗粒有机物，且具有一定的硝化作用和潜在的脱氮能力[30-31]，可能与污水中氮的去除有关。假单胞菌是一种广泛分布于自然界的常见病菌，是自然界中碳、氮循环的重要一环[32]，分解蛋白质和酯酶能力很强[33]。弓形杆菌属(Arcobacter)是一种人畜共患食源性和水源性病原菌[34]，大量存在于各种水体中，包括饮用水、地表水、地下水等。其引起胃肠炎的临床症状与弯曲杆菌病类似[35]。相关研究表明，弓形杆菌属(Arcobacter)是城市污水和城市污水化学生物絮凝池活性污泥的优势菌群，而且具有致病性[36-37]。噬氢菌属(Hydrogenophaga)具有能够编码邻苯二酚2, 3-双加氧酶的功能基因[38]。6个样品中Methylotenera和假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度具有显著差异(P < 0.05)，而且Malikia的相对丰度具有极显著差异(P < 0.01)。
再次，主坐标分析结果表明样本根据处理状况有聚类的趋势，说明可能存在某种群落构成模式与处理后浓度是否达标相关。
综上所述，湿地法处理生活污水对地表水的微生物群落多样性与微生物的量及种类有关，一些菌属的丰度变化可以间接地指示水体污染或净化程度。
4 结论(1) 通过对湿地系统的综合评价，发现前处理后的生活污水经人工湿地处理到达湿地5 000 m时，4个理化指标值均达GB 18918-2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》的一级标准，而且4个理化指标之间的消减效应均呈极显著正相关。
(2) 水体的污染程度对微生物群落结构在比例组成上有较大影响，变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为仙桃湿地地表水微生物群落结构组成中的绝对优势菌群。变形菌门(Proteobacteria)可以作为排放生活污水污染物的指示性微生物，其结构比例可用来评价水体受污染程度。类似地，放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和绿弯菌门(Chloroflexi)可以作为排放生活污水净化的指示性微生物，其结构比例可用来评价水体的净化程度。
(3) 本文首次以分洪道的湿地来处理城市生活污水为研究对象，研究了该类水域微生物多样性和菌群结构组成方面的变化，为后续相关工作提供相应的理论实践支持。
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