1917年，德国多布罗加暴发了严重的志贺菌感染。德国细菌学家Alfred Nissle从一名未感染士兵的粪便中分离出了一株细菌，并且用它阻止了这场感染的扩散，这株细菌之后被称为Nissle1917，简称EcN^[1]。现以EcN作为主要成分制为成药“Mutaflor”。至今，EcN的生物学特性及其功能研究已经比较透彻。研究发现EcN不仅对多种肠道致病菌具有拮抗作用，还能调节体内免疫因子的分泌，增强宿主免疫防御能力等功能^[2]。近年，对细菌抗肿瘤作用有更进一步的认识，EcN也表现出其独特的优势。本文将对EcN功能的研究及其进展进行介绍。

1 EcN的生物学特性

大肠埃希菌E. coli Nissle1917 (EcN)的特殊生物学结构决定了它不同于其他致病性的大肠埃希菌。一般来说，致病大肠埃希菌可通过其脂多糖(Lipopolysacch aride，LPS)在宿主体内抵抗血清补体系统的清除，研究发现这与细菌表面O抗原侧链的长度有关。EcN属血清O6:K5:H1型，其LPS表达半粗糙型O6抗原，由于抗原上的聚合酶wzy基因终止点突变导致了其侧链较短，且侧链由单个寡糖重复单位组成，其K5型夹膜具有血清敏感性，这导致EcN在体内遇血清极易被清除，是其不同于其他大肠埃希菌的特性之一。EcN缺乏与它同种的病原菌株中普遍存在的致病因子，不携带毒力因子，因此不具有致病性^[3-7]。EcN的H1型鞭毛通过单个菌之间的相互作用以及锚定识别作用，形成了肠道上皮紧密的网络结构，进而可以抑制病原菌对肠道上皮细胞的黏附及侵袭^[8-9]。EcN基因编码3种菌毛F1A、F1C及卷曲菌毛，是其在肠道内持续性定殖及肠道上皮强黏附的有力助推器^[10-11]。EcN的这些生物学特性为其功能及应用打下了基础。

2 EcN在肠道炎症中的作用机制

EcN在临床主要用于胃肠功能障碍性疾病的治疗，例如：克罗恩病、炎症性肠病及慢性便秘等，其中在治疗炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)的疗效是最为可观的^[12]，其作用的机理可概括：(1)增强肠道黏膜屏障，防止病原体对肠道的入侵；(2)通过与病原体竞争肠道内营养物质，分泌细菌素等方式拮抗病原体黏附肠道上皮；(3)调节机体免疫因子的分泌，刺激宿主产生免疫反应，间接杀死病原体^[13-14]。

2.1 增强黏膜屏障

EcN在肠道上皮细胞间可以形成细菌-细胞间的“串扰”(即宿主细胞信号传导)进而增强肠道黏膜屏障^[15]。实验研究建立人肠内单层细胞T84模型，使用致病性大肠埃希菌(Enteropatho-genic Escherichia coli，EPEC)标准株E2348/69感染细胞后加入EcN，监测感染细胞的屏障，通过基因测序、Western blot、RT-PCR等方法检测EcN对细胞的作用，结果表明加入EcN后，T84细胞上的300种不同的基因表达发生改变，其中闭锁带蛋白zo-2的表达明显升高，且向细胞边缘分布^[16]。EcN对肠道黏膜的保护及修复功能在肠道炎症的治疗中起着关键的作用，用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎小鼠模型，EcN灌胃小鼠进行治疗观察，发现治疗组小鼠的体重下降、结肠缩短的情况较模型小鼠组相比得到缓解，且发现EcN组小鼠的结肠上皮细胞的zo-1表达显著上调，表明EcN在结肠炎的缓解中起到了黏膜保护和修复的作用^[17]。我们研究小组应用AOM/DSS诱导结直肠炎模型，在诱导后第60天时，将小鼠处死观察肠道变化、模型组的肠道长度稍短于正常组，EcN组的结直肠长度大于模型组，接近正常组的长度。将小鼠的结直肠进行HE染色，病理结果显示：与正常组小鼠结直肠相比，模型组小鼠的结直肠可见炎症浸润，核增大，出现异形性灶及癌前病变；EcN组可见有炎症浸润，肉芽组织，但病变程度较模型组低^[18]。EcN这些研究结果均表明EcN可通过维护肠道黏膜屏障功能，预防及治疗肠道疾病。

2.2 拮抗病原体

EcN对多种病原体均能产生拮抗作用。Leatham等^[19]将链霉素处理后的小鼠进行EcN预定殖，感染肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)，实验对照使用益生菌K12预定殖，发现EcN组能有效的抑制EHEC的生长，但K12组并没有产生这样的结果。Kleta等^[20]将EPEC与肠道上皮细胞IEPC-2共培养，研究EcN对EPEC拮抗的作用机制，结果表明EcN通过其F1型菌毛及H1型鞭毛对肠上皮细胞的黏附，在局部持续性分泌抗菌素，从而抑制了EPEC对肠道上皮细胞的黏附。Jiang等^[21]将EcN与产气荚膜梭菌Cp4共培养，检测EcN对Cp4的增长及其生物膜和炎症因子分泌的影响，结果显示EcN对Cp4以剂量依赖方式抑制了Cp4生长数量、产气量，降低致肠道组织坏死的B毒素的水平，竞争性影响Cp4生物膜的形成，降低Cp4引起的炎症因子高表达。评估EcN在极化的人结肠癌细胞HT-29中，空肠杆菌(Campylobacter jejuni，C. jejuni)对其的感染和黏附，发现EcN预处理4 h，空肠弯曲杆菌感染HT-29细胞24 h之后，检测发现预处理的HT-29无胞内空肠弯曲杆菌，且实验发现其他益生菌(鼠李糖杆菌LGG、双歧杆菌Bb-12、嗜酸乳杆菌LA)均没有达到同等的效果。分析表明EcN预处理24 h后与编码CLDN一系列的基因表达发生变化，这与紧密连接蛋白较有关，因此实验表明EcN能够增加肠道屏障功能的相关基因表达，增加细胞紧密链接完整性^[22]。这样的抗菌作用在人体内研究也得到相应的验证。在溃疡性结肠炎的病人中，进行为期6周连续口服EcN的试验，对病人口服前后进行肠道微生物数量及种类的分析，6周后黏膜组织镜下活检及PCR定量等实验结果显示肠道黏膜致病菌及厌氧菌数量均较服用前降低^[23]。在新生儿随机双盲试验中，治疗组连续口服5 d的EcN (1 mL/d)，在口服后第二天开始，对粪便样本进行微生物检测，与安慰剂对照组相比，发现在EcN治疗组中新生儿的潜在致病菌及病原菌的数量明显低于安慰剂对照组，且随着时间的延长而表现出更为明显的差异^[24]。因此，EcN一方面通过提高肠上皮细胞的闭锁蛋白和紧密连接蛋白的表达从而修复和维护了肠道上皮的完整性，间接抵抗了病原菌的黏附和侵袭；另一方面还可直接分泌抗菌素和黏附素参与竞争性拮抗病原菌。

2.3 调节机体免疫因子分泌

EcN干预后肠道细胞因子表达的变化，可能是EcN在抗肠道疾病中发挥保护作用的机制之一^[18]。研究发现EcN通过NF-Kβ和AP-1的途径刺激宿主体内肠道上皮细胞产生人β防御(HBD-2)。在IBD患者中进行体内诱导HBD-2产生的评测，使用EcN干预后，宿主体内的HBD-2产量较干预前增加了10−15倍，结果表明在IBD患者体内使用EcN刺激机体免疫应答对治疗起了关键的作用^[25-26]。研究表明EcN对细胞因子IL-2、TNF-γ的表达有明显的抑制作用，但对IL-10的分泌有促进作用，在TLR-2受体基因敲除小鼠实验中得以证实EcN对淋巴细胞的抑制作用是呈TLR-2受体依赖性的^[27-28]；Grabig等^[29]发现在用DSS诱导结肠炎小鼠模型中，EcN通过TLR-2和TLR4依赖途径改善炎症状况。给炎症性模型小鼠灌胃EcN观察其改善炎症的影响，实验发现服用EcN治疗组的小鼠中，虽然抗炎因子IL-10的水平变化不大，但是TNF-γ、IL-5、IL-6炎症因子表达相对模型组均得以下调^[30]。研究认为，这种免疫调节作用与细胞株有很密切的关系，在细胞株HCT-15中，EcN降低了TNF-α介导的细胞因子IL-8的分泌，呈剂量依赖性^[31]；而在使用细胞Caco2中，EcN是通过刺激宿主产生HBD-2缓解了炎症^[32]。综上，EcN在参与宿主免疫调节方面，能通过介导细胞因子分泌，参与宿主体内的免疫应答调控，从而维持了肠道内稳态平衡。

2.4 参与肠道菌群的调节

我们研究小组对野生型C57BL/6小鼠给予EcN灌胃，收集小鼠的新鲜粪便进行细菌定量培养以观察其在小鼠体内停留的时间。结果发现，一次灌服EcN可以在小鼠体内停留2周，与正常小鼠比较，EcN干预小鼠的整体状况无差异，肝脾中未培养出EcN。进一步，用AOM/DSS的方法建立结直肠肿瘤模型，以及16S rRNA基因高通量测序检测肠道菌群的变化，结直肠肿瘤小鼠的肠道菌群与正常小鼠的相比，在门水平上，拟杆菌门的丰度增加，厚壁菌门的丰度下降；在属水平上，拟杆菌属的丰度增高，毛螺菌科菌属的丰度降低。而EcN能够降低拟杆菌门的丰度，增高厚壁菌门的丰度；在属水平上，EcN能够增加毛螺菌科的菌属的丰度，降低拟杆菌属的丰度^[33]。

3 EcN在抗肿瘤中的研究

至今，癌症的攻克仍是一个亟待解决的问题。尽管对其进行了大量的实验研究及临床调查，部分癌症的死亡率、复发及转移率仍然高居不下，且手术及放疗、化疗带来的副作用更是不容小觑。近年来，新的研究及治疗方法不断涌现。其中细菌抗肿瘤的手段也是备受关注的突破点之一。EcN作为益生菌，不仅用于治疗炎症性肠病，在靶向抗肿瘤及细菌载体方面的研究中也均有涉及^[34-36]。EcN能特异性靶向肿瘤组织，将药物载至肿瘤组织中释放，减轻化疗药物带来的副作用；同时，EcN能诱导宿主产生免疫因子，调节肠道菌群等方式提高机体免疫能力。

3.1 特异性靶向肿瘤组织

研究发现某些细菌能特异性靶向定殖于实体瘤中，在肿瘤内大量增殖，进而刺激机体对肿瘤局部的免疫能力。目前研究报道有沙门氏菌^[37-38]、大肠埃希菌^[39-40]、双歧杆菌^[41-42]等均能在肿瘤内富集。Zhao等^[43-44]在对小鼠沙门氏菌A1-R研究中发现细菌对肿瘤的特异性靶向和细胞毒作用，并诱导机体抗肿瘤免疫应答等作用。研究表明EcN同样具有较强的肿瘤靶向及肿瘤内定殖能力。Zhang等^[45]建立了乳腺肿瘤4T1的BALB/c小鼠模型，通过尾静脉注射EcN，检测EcN在肿瘤及体内的定殖情况，结果显示EcN在肿瘤区聚集程度较高，分布均匀且定殖持续时间长达14 d；而对正常组织检测时，从感染的第3天开始EcN就从肝脾等各个器官清除，这表明EcN具有肿瘤内靶向定殖能力，且不会对其他器官造成损害。Stritzker等^[46]将EcN与沙门氏菌分别作尾静脉注射，比较细菌在小鼠肝和脾内的定殖，EcN在肝和脾内的数量远低于沙门氏菌数量，但在肿瘤活性及坏死组织内的定殖与沙门氏菌相同，提示EcN可作为很好的肿瘤治疗载体。

3.2 作为肿瘤治疗的载体

EcN的安全性及肿瘤靶向能力使它成为很有潜力的肿瘤基因治疗载体。肿瘤生长和转移很大程度上依赖于血管的生长，将EcN作为载体，表达人重组基因45-132的抗肿瘤血管生成片段Tum-5，靶向干预小鼠黑色素瘤B16及乳腺瘤T41，检测体内体外Tum-5的分泌及其抗肿瘤效果，结果显示EcN能有效抑制肿瘤的大小。在EcN治疗组中，肿瘤区见大量的炎症细胞浸润，血小板内皮细胞黏附分子PECAM-1/CD31在EcN治疗的小鼠肿瘤组织中的表达相对降低，且小鼠肝脾肾组织形态与对照组无显著性差异^[47]。将载天青蛋白Azurin的EcN靶向干预小鼠B16黑色素瘤模型和小鼠4T1乳腺肿瘤模型，结果表明表达Azurin蛋白的EcN组明显抑制了肿瘤的大小及乳腺癌的肺转移。诶博霉素是临床上常用于抗癌类抗有丝分裂的药物，为了减轻诶博霉素的副作用，充分和最大化利用它的价值，研究者将诶博霉素(Epothilone B，Epo B)负载于经处理后的EcN菌蜕(Bacteria ghosts，BGs)，并将其作用于人宫颈癌细胞Hela，处理24 h后观察细胞的形态，结果发现联用处理组的细胞Caspase3的激活，细胞色素C的释放比单用处理组的更为显著，结果表明载有EPoB的BGs能诱导Hela细胞由线粒体途径介导发生凋亡^[48]。

3.3 调节炎症因子及抗肿瘤作用

肿瘤与炎症及相关炎症因子表达关系密切。EcN在肠道中能参与免疫调控，降低促炎因子，上调抗炎因子的分泌，从而缓解和治疗包括肿瘤在内的肠道炎症引起的疾病。EcN在对肠道沙门氏菌、李斯特菌等病原体对肠道上皮细胞的侵袭具有积极的拮抗作用，降低促炎因子的表达。Stritzker等^[49]观察到EcN影响人结肠癌细胞HT-9的屏障功能、降低细胞的通透性和侵袭性细菌在细胞内的存活。为了改善和保证EcN使用的安全性，实验将EcN质粒重组，使其缺失msb-B的表达，得到突变型Nissle1917，将小鼠巨噬细胞株J774分别与野生型Nissle1917 (2×>10⁶ CFU)和突变型Nissle1917 (2×>10⁴ CFU)共同孵育4 h，分别测定TNF-α和IL-6的浓度，结果发现EcN突变型诱导细胞因子分泌量少于野生型，同样在肿瘤的治疗中，诱导炎症因子分泌也低于野生组，因此，不管是野生型的EcN还是突变型的，均能刺激机体产生免疫抵抗，相对于野生型的EcN来说，经过基因改造后，诱导炎症因子分泌的程度降低，安全性更加可控。

EcN能刺激宿主免疫保护因子的分泌。我们小组用AOM/DSS建立溃疡性结直肠炎相关的结直肠癌小鼠模型分别在诱导后第60天、第91天及第108天时采用ELISA的方法检测小鼠肠组织炎症因子的表达。观察到在第60天时EcN干预的模型小鼠IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、TNF-α的表达比正常小鼠低，与非干预模型组小鼠表达无明显差异。在第91天时上述5个炎症因子表达在EcN干预的小鼠均高于非干预模型组小鼠。在第108天时，EcN干预组的小鼠表达IL-6、IL-17、IL-23高于非干预模型组。EcN干预后肠道细胞因子表达的变化，可能是EcN在抗肠道肿瘤疾病中发挥保护作用的机制之一。

我们观察并测量记录上述各组小鼠在实验终点时肿瘤生成的个数以及大小。正常鼠的肠壁整洁，未见到赘生物。模型组小鼠的结直肠的肠黏膜增厚以及大小不等的肿瘤结节。与模型组相比，左金丸+EcN组和EcN组的肿瘤的个数及肿瘤的总体积均小于模型组，其中左金丸+EcN组(P < 0.05)和EcN组(P < 0.05)具有统计学差异。这些结果表明，EcN在化学诱导的小鼠结直肠癌模型中，能够抑制结直肠肿瘤的发生发展。EcN作用的机制可能是通过调节肠道菌群和肠道炎症因子的分泌^[18]。EcN的这些功能为微生物抗肿瘤的治疗和研究提供了新的途径和方法，有待更多的探索和挖掘。

4 结语

EcN作为药物，在肠道疾病的治疗中其疗效及安全性评价已经得到认可。在抗肿瘤中，EcN能特异性靶向肿瘤组织，且能诱导宿主产生免疫反应。将EcN用于炎症导致的结直肠癌治疗是未来一个值得期待的研究方向和手段。但是EcN在肿瘤治疗中的作用及机制目前尚未明确，本文作者的研究中发现EcN能诱导结肠癌细胞CT26发生程序死亡，且其死亡机制与Caspase及Bcl-2激活有关(文章尚未发表)，EcN在肿瘤的治疗中的作用仍需更多的研究和探索。细菌抗肿瘤的关键核心在于其使用的安全性和可操控性。虽然EcN的基因功能显示其安全性已经得到证实，但是在新的应用范围中仍需要进一步观察。