禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)属于肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic E. coli，ExPEC)，主要引起鸡、鸭和其他禽类局部或全身性感染，表现为气囊炎、蜂窝织炎、输卵管炎、腹膜炎以及败血症等炎症，给养禽业造成了巨大的经济损失。研究表明，APEC与人类ExPEC具有许多共同的O血清型、毒力因子及致病机制^[1-3]。另外，由于抗生素的大规模不当使用，使APEC产生了广泛的耐药性。APEC是人类致病性大肠杆菌的毒力基因和耐药基因贮库，可通过禽类及其产品传播给人类，对人类健康造成潜在威胁^[1-3]。因此，加强对APEC的长期监测和研究，对养禽业和公共卫生具有重要意义。

毒力因子在APEC致病过程中发挥着重要作用，与APEC致病相关的毒力因子已被相继报道，如黏附素、侵袭素、铁摄取系统、分泌系统等。目前，在革兰阴性菌中鉴定了6种不同的分泌系统，其中Ⅴ型分泌系统(Type Ⅴ secretion system，T5SS)的分泌装置最为单一，仅由一个蛋白分泌家族组成，其序列包括信号肽区、自分泌重复序列、膜外功能区和跨膜区。T5SS属于Sec依赖型分泌系统，首先N端的Sec信号肽介导功能区转运至外周质间隙，然后C端的β结构域在外膜上形成一个通道，从而将膜外功能区运送至胞外，整个过程不消耗能量。由于T5SS将自身蛋白分泌至胞外，因此又被称为自分泌转运系统。根据序列及结构特征的差别，Ⅴ型分泌系统分为5种亚型(Va、Vb、Vc、Vd、Ve)^[4-5]。研究表明，T5SS在大肠杆菌的感染致病过程中发挥重要作用，主要参与大肠杆菌的黏附、生物被膜形成、凝集沉降等过程^[6]。研究者在不同致病型大肠杆菌中鉴定了20多个T5SS，包括肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E. coli，EHEC)的EhaA/EhaB/ EhaC、尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E. coli，UPEC)的UpaB/UpaC/UpaG，其在EHEC和UPEC黏附宿主的过程中发挥重要作用^[7-8]。在APEC中已经鉴定的T5SS包括温度敏感性血凝素(Temperature-sensitive hemagglutinin，Tsh)、空泡形成毒素(Vacuolating autotransporter toxin，Vat)、APEC自分泌黏附素AatA和AatB等，这些T5SS广泛分布于APEC中并参与APEC对宿主的黏附定殖及呼吸道感染过程^[9]。

本研究对APEC分离株中不同致病型大肠杆菌的T5SS分布进行了检测，并进一步分析了T5SS分布与APEC的大肠杆菌进化分群、毒力基因之间的关联性，发现不同致病型大肠杆菌的T5SS广泛存在于APEC菌株中，且部分T5SS与大肠杆菌进化分群存在相关性，为进一步解析T5SS在APEC感染过程中的作用及相关防控技术研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 菌株

禽致病性大肠杆菌临床分离株由本实验室在2013-2015年间分离于安徽、河南、江苏和上海等地区养殖场的病禽^[10]。

1.2 主要试剂和仪器

2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker，北京康为世纪生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。PCR仪，ABI公司；核酸电泳仪、全自动凝胶成像系统，上海天能科技有限公司。

1.3 引物设计

根据已报道的大肠杆菌T5SS的基因序列，设计特异性检测引物(表 1)，由华津生物科技有限公司合成。

1.4 基因组DNA的提取

根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书分别提取APEC临床分离株的基因组DNA。

1.5 大肠杆菌系统进化分群

参考Clermont等^[11]建立的方法，根据chuA、yiaA基因和DNA片段TspE4.C2合成3对引物(表 1)，通过三重PCR方法对APEC临床分离株进行系统进化分群。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，放置紫外灯下观察扩增片断大小，并根据PCR扩增结果判定APEC分离株的进化分群。

1.6 T5SS基因分布检测

采用PCR方法检测T5SS在APEC分离株中的分布。PCR反应体系：2×PCR Mix 12.5 μL，引物(10 μmol/L)各取0.5 μL，基因组DNA模板(100 ng/μL) 2.0 μL，最后补灭菌超纯水至25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30-50 s，30个循环；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR产物，于1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察记录PCR结果。胶回收PCR产物，送华津生物科技有限公司进行测序。

1.7 APEC毒力基因检测

根据本实验室建立的多重PCR方法^[10]分析APEC临床分离株的14个毒力基因进行检测，并分析毒力基因与T5SS的相关性。

2 结果与分析 2.1 APEC临床分离株的系统进化分群

通过三重PCR方法扩增chuA、yiaA和DNA TspE4.C2，分析APEC临床分离株的系统进化分群。结果显示，APEC临床分离株属于A、B1、B2和D进化分群的比例分别为29.71%、28.99%、13.77%和22.46%，表明APEC主要属于A、B1和D进化分群，B2群较少(表 2)。然而，根据Clermont等^[11]建立的方法，无法对7株(5.07%) APEC分离株进行分群。

2.2 T5SS在APEC中的分布

对15个T5SS基因进行PCR检测，分别扩增出与预期大小相符的片段(部分检测结果，图 1)，PCR产物测序结果与GenBank中T5SS的序列相似性均在99%-100%。PCR检测结果显示，ydeK和pplfP的分布率最高，分别为98.55%和92.03%；其次是apaC、ehaG、ehaC，其存在于65.94%-89.86%的APEC分离株中；而yejO、upaG、ehaA、ag43/flu、upaB、ehaB的分布率介于28.26%-48.55%；但是pic和upaC的分布率均低于10.00% (表 3)。结果表明，不同T5SS在APEC中广泛分布，但不同T5SS的分布率差别较大。

2.3 T5SS分布与进化分群的关系

通过结合大肠杆菌系统进化分群分析T5SS分布与大肠杆菌进化分群的相关性。结果表明，T5SS在大肠杆菌进化分群中的分布差别较大。其中，ydeK、ehaC和pplfP在所有大肠杆菌进化分群中的分布率均较高。61.29% (19/31)的D群APEC菌株含有ehaA和ehaB基因，而68.29% (28/41)的A进化分群APEC分离株为ag43/flu阳性，显示其分布与大肠杆菌进化分群存在一定的关联性。ehaG和apaC阳性APEC菌株主要属于A及B1进化分群，而pic和vat主要分布于B2及D进化分群APEC菌株中。但是upaB、upaG主要分布于B1、B2及D进化分群APEC菌株中，在A进化分群中的分布率较低(表 4)。

通过分析阳性菌株与大肠杆菌进化分群发现，41.30% (19/46)、48.72% (19/39)、50.00% (6/12)、45.00% (9/20)的ehaA、ehaB、pic、vat阳性APEC菌株属于D进化分群；而upaC阳性APEC菌株主要属于B2进化分群。upaB和yejO主要存在于B1群APEC菌株中；但是ehaG、ag43/flu和apaC的阳性APEC菌株主要属于A及B1进化群(表 5)。然而，其他T5SS与大肠杆菌进化分群无明显的关联性。

2.4 T5SS与其他APEC毒力基因的关联性分析

结合本实验室前期的APEC毒力基因分子流行病学调查结果，分析APEC分离株的T5SS及其他毒力基因分别的相关性。结果显示T5SS与APEC其他毒力基因(fimC、papC、tsh、mat、irp2、fyuA、iroN、iucD、iss、cva/cvi、neuC、ompA、ibeA、ibeB)的分布均无显著关联性。

3 讨论与结论

APEC能够引起鸡、鸭、火鸡等多种禽类的大肠杆菌病，给养禽业造成了严重的经济损失。研究表明，毒力因子在APEC致病过程中发挥着重要作用，其中T5SS广泛存在于不同致病型大肠杆菌中并参与黏附、生物被膜形成、凝集沉降等过程^[6]。为了分析不同致病型大肠杆菌的T5SS在APEC中分布及规律，本研究通过PCR方法检测T55S的分布。结果发现，15个大肠杆菌T5SS广泛存在于APEC中，其中T5SS ydeK和pplfP在APEC中分布率最高，而pic、upaC在APEC中分布率低于10%。值得注意的是，EHEC的T5SS ehaA、ehaB、ehaC、ehaD、ehaG和UPEC的T5SS upaB、upaC、upaG也广泛存在于APEC分离株中，说明某些T5SS可能存在不同致病型大肠杆菌中，与国外学者的结论一致^[7]，进一步提示APEC可能是人源致病性大肠杆菌的毒力基因贮库^[1]。

依据Clermont等^[11]的方法，可将大肠杆菌分为A、B1、B2、D四个系统进化分群。本研究利用该方法分析了APEC分离株的系统进化分群，发现APEC主要属于A、B1、D进化分群，B2群较少，该结果与我们以前的调查结果一致^[12-13]。然而，国外学者通过调查发现不同国家及地区APEC分离株的主要进化分群不同，有些国家的优势进化分群为B2群，但有些国家地区主要为A和B1进化分群APEC^{[2, 14]}。国内学者检测了100株APEC发现A和B2为主要进化分群^[15]，与我们的研究结果有些差异，这主要是由于不同地区的APEC流行菌株及优势血清型差异导致的。另外，本研究检测的APEC菌株主要分离于水禽病料，其也可能是APEC菌株进化分群不同的原因之一。结合APEC进化分群分析，发现T5SS在进化分群中的分布不一。T5SS ehaA、ehaB、ehaD、pic、vat在D群APEC中分布率较高，upaC主要存在于B2群APEC中，而ehaG、ag43/flu、apaC主要分布于A及B1群APEC中。类似的，Zude等的研究表明部分T5SS和大肠杆菌进化分群存在一定的相关性，通过研究发现ehaA、ehaG主要分布于B1群，这些结果与本文结果存在一定的差异^[7]。Zude等检测了致病性大肠杆菌及正常的非致病性大肠杆菌中的T5SS分布，由于不同致病型大肠杆菌的进化分群差异较大，其可能是导致与我们结果不一致的原因之一。通过分析发现T5SS与APEC毒力基因分布之间不存在明显的关联性，与其他研究结论一致^[7]。

目前，由于抗生素的滥用，导致细菌耐药性日趋严重，因此研发新型药物或疫苗来防控细菌性疾病显得尤为重要。由于T5SS在病原菌感染宿主第一步，即黏附过程中发挥重要作用，且其属于胞外蛋白，具有一定的免疫原性，因此T5SS成为潜在的疫苗靶标。近50年，有许多T5SS已成功用作疫苗成分，如百日咳杆菌黏附素(Pertactin)、流感副血菌的自分泌黏附素Hap等^[16]。我们前期研究也发现，免疫纯化表达的APEC及鼠伤寒沙门菌T5SS可刺激机体产生高水平的抗体，并对APEC及鼠伤寒沙门菌感染提供免疫保护作用^[17]。另外，由于T5SS的抗原性及自分泌蛋白特性，T5SS还被作为载体用于保护性抗原的表面展示^[18]。已有研究通过大肠杆菌AIDA和奈瑟菌IgA表达并转运恶性疟原虫的蛋白，并可以刺激机体产生高水平抗体^[19-20]。鉴于T5SS广泛存在于APEC，且参与APEC感染及致病过程，因此需要进一步深入研究T5SS的致病机制及作为疫苗候选成分，从而为防控禽大肠杆菌病奠定基础。