2019, Vol. 46扩展功能
文章信息
- 龚梦馨, 孙庆惠, 张茜茜, 黄志伟, 杨洪江
- GONG Meng-Xin, SUN Qing-Hui, ZHANG Xi-Xi, HUANG Zhi-Wei, YANG Hong-Jiang
- 路德维希肠杆菌噬菌体的分离及生物学特性
- Isolation and characterization of an Enterobacter ludwigii phage, GM20
- 微生物学通报, 2019, 46(11): 3040-3047
- Microbiology China, 2019, 46(11): 3040-3047
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190010
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文章历史
- 收稿日期: 2019-01-03
- 接受日期: 2019-05-07
- 网络首发日期: 2019-07-16
2. 海南医学院 海南 海口 570102
2. Hainan Medical College, Haikou, Hainan 570102, China
噬菌体是细菌病毒，可以杀死宿主细菌，包括耐药性细菌。噬菌体数量庞大，地球上约有1032个，是细菌数量的10倍，能够感染约108种细菌[1]。不同噬菌体对细菌的裂解作用保持了生物圈中细菌数量和种类平衡，同时推动了噬菌体和细菌的共同进化[2-3]。在后基因组时代，新型抗菌素的发现处于停滞状态，由耐药性细菌引起的感染可能危及生命，从而激发了人们以噬菌体作为治疗手段的兴趣[4-5]。近年来，噬菌体作为一种替代抗菌素或补充治疗方法，取得了巨大的进展[6]。
路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)为革兰氏阴性菌，属于肠杆菌属(Enterobacter)。该细菌与其它5种肠杆菌染色体DNA相似性较高，约在61%-67%之间，同属于阴沟肠杆菌群(Enterobacter cloacae complex)，该群包括阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、神户肠杆菌(Enterobacter kobei)和超压肠杆菌(Enterobacter nimipressuralis)，普遍存在于土壤、污水、水和肠道等环境中[7]。近年来，不断有研究发现路德维希肠杆菌可导致腹部、泌尿道、脑膜和外科部位感染。路德维希氏肠杆菌对第一代头孢菌素具有内在的抗性，并具有AmpC类β内酰胺酶，能够耐受第三代头孢菌素和窄谱β内酰胺等抗菌素；路德维希肠杆菌细胞膜孔道蛋白突变能够导致对碳青霉烯类抗菌素耐受，从而限制了治疗过程中抗菌素的选择。另外，路德维希肠杆菌能够合成生物被膜，作为物理屏障来抵御多种抗生素的攻击[8-9]。更令人担忧的是，在过去10年中发现了多株临床菌株获得携带多个外源的抗菌素抗性基因，从而对多种抗菌素产生抗性[10-11]。
本研究以实验室保存的路德维希肠杆菌X20为指示菌，从环境样品中分离了一株噬菌体GM20，并进一步分析了该噬菌体的结构蛋白，以及耐噬菌体突变株的自发突变率、释放量和抑菌效率等。目前关于路德维希肠杆菌噬菌体的研究处于空白，本研究分离鉴定的路德维希肠杆菌噬菌体可以应用于路德维希肠杆菌感染的预防和控制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 环境样品及菌株样品采集自天津科技大学校园河道淤泥，用于分离噬菌体。本实验室分离保存的菌株X20经分析16S rRNA基因的序列鉴定为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)，相关序列上传至NCBI的GenBank，获得登录号为MG254540.1。
1.1.2 主要试剂和仪器及培养基蛋白胨，酵母浸粉，琼脂粉，Oxoid公司；PEG6000、蛋白酶K，北京鼎国生物技术有限责任公司；Premixed Protein Marker (Low)，宝生物有限公司。
全自动凝胶成像仪，北京原平皓生物技术有限公司；酶标仪，Broadcom Corporation公司。
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，pH 7.0-7.2；半固体琼脂培养基：琼脂粉5 g/L，加热溶解；刚果红固体LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，胰蛋白胨10.0，刚果红40.0，考马斯亮蓝0.02，pH 7.0-7.2。所有培养基均1×105 Pa灭菌20 min使用。
1.2 噬菌体的分离纯化与保存将路德维希肠杆菌X20于30 ℃、160 r/min振荡培养过夜后，以2%接种量转接于100 mL液体LB培养基中，30 ℃、160 r/min振荡培养至OD600为0.6，向对数期的指示菌菌液中加入3 mL处理好的样品，继续振荡培养48 h。
吸取富集液1 mL，12 000 r/min离心10 min，上清使用直径为0.22 μm的滤膜过滤除菌，再将滤液用液体LB以10倍比梯度稀释，将200 μL路德维希肠杆菌的菌液分别和100 μL噬菌体富集液混合并侵染，10 min后结束侵染，将混合物加入到3 mL已经融化好的软琼脂中，混匀后将软琼脂倾倒于LB平板培养基上，待软琼脂凝固后，将平板倒置于30 ℃培养箱内培养。
通过噬菌体的纯化实验，将大小、形态均一的噬菌体扩增培养和过滤除菌。取600 μL裂解液(已除菌)与600 μL 60%无菌甘油混匀，于-80 ℃保存。
1.3 噬菌体颗粒SDS-PAGE分析吸取1 mL噬菌体裂解液加入培养至对数期的300 mL路德维希肠杆菌X20培养液中，30 ℃、160 r/min振荡培养4 h。在裂解液中加入DNase I及RNase A至终浓度各为5 μg/mL，37 ℃作用1 h。按每100 mL液体加入0.5 g NaCl的比例加入NaCl，混匀溶解，冰浴1 h，10 000 r/min离心20 min。收集上清，加入固体PEG6000至终浓度10% (质量体积比)，充分振荡溶解，4 ℃静置过夜。10 000 r/min离心20 min，弃上清，收集沉淀。用500 μL TM溶液重悬沉淀，加入与重悬液等体积的氯仿/异戊醇(24:1，体积比)，在振荡器上振荡1 min，10 000 r/min离心10 min，收集上层水相，重复3次，彻底将PEG6000去除，直至中间层再无白色蛋白膜。加入等体积纯氯仿抽提2次，得到粗提的噬菌体颗粒，用分子量为100 kD的超滤膜浓缩噬菌体。
1.4 噬菌体透射电镜观察浓缩的噬菌体颗粒用0.1 mmol/L的醋酸铵溶液(pH 7.0)洗涤3次，去除宿主的可溶性生物小分子片段。噬菌体溶液直接用2%的磷钨酸钠(pH 6.7)进行负染色，利用HT7700透射电子显微镜在100 kV电压下观察[12]。
1.5 一步生长曲线按照文献[13]中方法，将指示菌路德维希肠杆菌X20过夜培养物以2%的接种量转接至100 mL液体LB培养基中，培养至对数生长期(OD600为0.6)，4 000 r/min离心7 min富集菌体。将菌体用500 μL无菌液体LB重悬后移至1.5 mL无菌离心管中，加入500 μL噬菌体裂解液(滴度为104 PFU/mL，保证MOI < 0.1)，室温静置吸附1 min后，立即13 000 r/min离心30 s弃去上清，去除游离的噬菌体颗粒。将沉淀用1 mL液体LB重悬后倒入100 mL菌液中，30 ℃、160 r/min培养并开始计时，每隔5 min取样100 μL，进行系列稀释后测滴度。
1.6 耐噬菌体突变株的自发突变率采用终点滴定-反浊法[14]，对耐噬菌体菌株的自发突变率进行测定。具体方法为：将路德维希肠杆菌X20培养至OD600为0.6左右，涂板计数为4.29×109 CFU/mL。10倍比稀释细菌终浓度分别为4.29×101、4.29×102、4.29×103、4.29×104、4.29×105、4.29×106、4.29×107 CFU/mL后，分别加入10 μL滴度为7.65×109 PFU/mL的噬菌体GM20原液混匀，终浓度为7.65×107 PFU/mL。另外，取10 μL噬菌体GM20原液加入到1 mL液体LB中作为对照，30 ℃、160 r/min振荡培养24 h，做10个平行。
1.7 噬菌体杀菌效力噬菌体对宿主菌的抑菌曲线按照文献[15]中方法测定。在96孔板中每个孔加入4 μL培养至OD600为0.6左右的路德维希肠杆菌X20和4 μL噬菌体(MOI=0、0.000 01、0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10)，然后补加192 μL液体LB培养基。30 ℃、160 r/min振荡培养，每隔30 min用酶标仪测定培养物的OD600，测270 min，做6个平行。
1.8 噬菌体对生物被膜形成的抑制将指示菌路德维希肠杆菌X20过夜培养物和噬菌体裂解液分别按2%的比例接种于200 μL LB液体培养基的96孔板中，感染复数分别为0、0.000 01、0.000 1、0.001、0.01、0.1和1加入噬菌体，30 C静置培养48 h。倒掉孔径中的培养物，清水洗2次，用滤纸吸干；加入280 μL结晶紫染色20 min后倒掉，清水洗2次，用滤纸吸干；加入280 μL无水乙醇，静置20 min，用酶标仪测定OD600的吸光度[16]。
1.9 噬菌体对宿主细菌菌落的影响取5 μL培养至对数期的路德维希肠杆菌X20与5 μL无菌噬菌体GM20，分别以感染复数为0、0.000 01、0.000 1、0.001、0.01、0.1和1混合均匀，将混合物点在加入刚果红的固体LB培养基上，30 C静置培养48 h后观察并拍照记录菌落形态[17]。
2 结果与分析 2.1 噬菌体的分离纯化以路德维希肠杆菌X20为指示菌，用双层平板法从淤泥样品中分离出一株路德维希肠杆菌X20噬菌体，命名为GM20。噬菌斑边缘有晕环，经游标卡尺测得噬菌斑直径平均为0.47 mm。加入500 μL噬菌体到300 mL指示菌培养物中，培养8 h后裂解液中噬菌体滴度达到7.65×109PFU/mL，显示GM20为烈性噬菌体(图 1)。
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| 图 1 噬菌体GM20的噬菌斑(A)和直径(B) Figure 1 Plaques (A) and diameter (B) of phage GM20 |
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将纯化的噬菌体GM20颗粒进行SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝G250染色和脱色后获得蛋白质组图谱。在凝胶上观察到1个主要结构蛋白和12个次要的结构蛋白，分子量位于44.3 kD和60.0 kD之间，主要结构蛋白大小为53.8 kD左右(图 2)。
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图 2 噬菌体GM20的结构蛋白
Figure 2 Structure protein of phage GM20
注：M:混合标记蛋白(Low)； 表示数量多的蛋白质条带； 表示数量少的蛋白质条带.
Note: M:Premixed protein marker (Low); Solid arrows indicate major protein bands; Blank arrows show minor protein bands.
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噬菌体电镜观察结果如图 3所示，噬菌体GM20头部为20面体结构，尾部由一个可伸缩的外层尾鞘和一个内部尾管组成。头部直径约为80.0 nm，尾部结构长106.7 nm。电镜照片显示，噬菌体GM20属于有尾噬菌体目(Caudovirales)的肌尾噬菌体科(Myoviridae)。
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| 图 3 噬菌体GM20透射电镜照片 Figure 3 Transmission electron micrograph of phage GM20 |
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噬菌体GM20的一步生长曲线如图 4所示，GM20感染宿主菌在15 min内的滴度没有显著改变，表明其潜伏期约为15 min；从15 min后滴度开始上升，20 min后效价趋于稳定。经过比较平台期(P)与潜伏期(L)的滴度，计算出释放量为164.3 PFU/infection center。结果显示，该噬菌体在宿主菌X20中具有较强的繁殖能力。
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| 图 4 噬菌体GM20的一步生长曲线 Figure 4 One-step growth curve of phage GM20 注：L：潜伏期；R：暴发期；P：稳定期. Note: L: Incubation period; R: Burst period; P: Stable period. |
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将指示菌培养物和噬菌体GM20振荡培养24 h，观察试管中培养物的反浊情况，能返浊的最低浓度管中所含细菌数的倒数即为耐受突变的频率。结果如图 5所示，突变频率范围为2.33×10-7-2.1×10-5(最后一个返浊的试管中，存在1-9个对噬菌体耐受的突变细胞)，平均突变频率为1.06×10-5。
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| 图 5 耐噬菌体GM20突变株的自发突变率 Figure 5 Spontaneous mutation frequency of the mutants resistant to phage GM20 注：实验组路德维希肠杆菌X20的浓度为4.29×100-4.29×107 CFU/mL，对照(Control)不加指示菌.所有试管的噬菌体GM20滴度为7.65×107 PFU/mL. Note: In the experiment group, the bacteria concentrations were 4.29×100-4.29×107 CFU/mL and no indicator cells were added in the control. Phage titer was 7.65×107 PFU/mL in all test tubes. |
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在不同MOI下测定噬菌体GM20对宿主菌X20的裂解曲线，结果如图 6所示，随着MOI的升高，噬菌体的抑制效果越明显。当MOI=10时，宿主菌几乎不生长；当MOI=0.000 01和0.000 1时，宿主菌一直呈缓慢增长状态；当MOI逐渐增大，宿主菌增长越缓慢，说明噬菌体的数量越多，对宿主菌的降解效果越明显。另外，MOI=0.000 01-1时仍有宿主菌生长，可能在噬菌体的自然选择下，宿主菌自发突变产生耐受菌。因此从应用出发，能够最佳抑制宿主菌生长的MOI为10。
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| 图 6 噬菌体GM20裂解细菌的动态曲线 Figure 6 Lytic kinetics of phage GM20 |
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细菌在物体表面能够形成生物被膜，很难控制。生物被膜已被认为是难治性肺部感染及生物材料相关性感染的重要原因[18]。为了研究噬菌体抑制生物被膜形成的作用，以路德维希肠杆菌株X20为指示菌，分析在噬菌体GM20存在情况下生物被膜量的变化，对照组中不加噬菌体(MOI=0)。结果如图 7所示，当MOI=0.01时，GM20可以抑制宿主菌47%的生物被膜形成，不同MOI的噬菌体对路德维希肠杆菌X20生物被膜的形成都有不同程度的抑制。
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| 图 7 噬菌体GM20对生物被膜的抑制作用 Figure 7 Inhibitory effect of phage GM20 on the biofilm formation |
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刚果红通常用于观察菌落形态，检测胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)的产量，胞外多糖(EPS)会影响生物被膜的形成。将噬菌体与菌液按不同MOI混匀点在刚果红平板上，能够直观地看出噬菌体GM20对路德维希肠杆菌X20形成生物被膜过程中的抑制作用。当MOI=0时，路德维希肠杆菌X20菌落形态比较平滑，说明能够形成生物被膜。由图 8可以看出，随着噬菌体浓度的增大，噬菌体对生物被膜形成的抑制作用越明显。当MOI=10时，几乎没有菌落，噬菌体GM20抑菌效果较好。
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| 图 8 刚果红平板上菌落形态 Figure 8 Colony morphology on the Congo Red plate |
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阴沟肠杆菌群成员不断从临床标本中分离出来，与多种疾病密切相关。在美国的重症监护病房，阴沟肠杆菌群细菌造成大约7%的院内感染[19-21]。路德维希肠杆菌是医院获得性感染的病原菌，临床分离的路德维希肠杆菌菌株一般具有多重耐药性，增加了抗生素治疗失败的风险，临床治疗方案中可以选择的抗菌素非常有限[22-24]。
在阴沟肠杆菌群中，仅对阴沟肠杆菌噬菌体有少量研究。靳静等[6]分离鉴定了阴沟肠杆菌裂解性噬菌体Pyg1，该噬菌体属于肌尾噬菌体，感染其宿主细菌的潜伏期为20 min，释放量为100 PFU/infection center。王丹等[25]从污水中分离鉴定了阴沟肠杆菌噬菌体ФEc53，该噬菌体属于有尾病毒目管尾病毒科。在对噬菌体ФEc53性质分析的基础上，将该噬菌体应用于控制阴沟肠杆菌所致皮下脓肿感染的研究，结果显示噬菌体对阴沟肠杆菌所致皮下脓肿的治疗是有效的[26]。
本文分离鉴定了路德维希肠杆菌噬菌体GM20，在国内外尚属首次。与大肠杆菌噬菌体K99[27](潜伏期200 min)和食源性大肠杆菌噬菌体Ec.P01[28](潜伏期90 min)相比，噬菌体GM20具有较短的潜伏期(15 min)。同时，噬菌体GM20对宿主菌的释放量为164.3 PFU/infection center。这些结果说明噬菌体GM20是裂解能力较强的噬菌体，能够很好地抑制细菌的生长，可以在控制和预防路德维希肠杆菌感染的各种应用中发挥作用，替代或者减少抗菌素的应用。
目前国内关于路德维希肠杆菌的研究较少，主要集中在分析该菌对特定环境污染的修复方面，而关于路德维希肠杆菌的致病性研究尚未见报道，处于空白阶段[29-31]，因此尚无法确定噬菌体GM20的宿主范围。另一方面，还需要对噬菌体GM20的基因组进行测序和功能注释，分析其基因组是否携带整合酶(Integrase)基因、毒力因子基因、抗菌素抗性基因等遗传标记，以保证噬菌体GM20应用的安全性。
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