沙门菌(Salmonella)是重要的人畜共患病病原菌，在自然界广泛存在。由于抗生素的不合理使用及复杂的耐药机制^[1]，其多重耐药(Multidrug resistanc，MDR)现象日趋严重。新近有研究表明，双组分信号转导系统(Two-component system，TCS)与细菌的致病性、耐药性密切相关，被认为是具有应用潜力、可降低耐药性和毒力的抗菌作用新靶点^[2]。在沙门菌中，调控耐药性的TCS有CpxAR、PhoPQ和BaeSR^[3-4]，而BaeSR在鼠伤寒沙门菌中研究较少。BaeSR由定位在细胞膜上的组氨酸蛋白激酶(Histidine kinase，HK) BaeS和胞浆中与DNA结合的反应调节因子(Response regulator，RR) BaeR组成^[5]，在膜压力作用下，活化的BaeS导致BaeR磷酸化，从而激活相关基因转录^[6]。

研究表明，BaeSR能够调节外排系统AcrD和MdtABC的过表达而增加沙门菌的MDR，在mdt-bae操纵子和acrD下游发现与baeR盒相似的序列，baeR蛋白可以与该序列结合，表明baeR直接调节mdt-bae操纵子及acrD的表达^[7]。此外，baeR能激活多功能通道蛋白基因tolC的表达，但在tolC基因下游区域没有发现类似baeR的共有序列，表明baeR可能间接激活tolC的表达^[8]。除此之外，BaeSR通过对外排泵基因adeA和adeB的正调节影响鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感性^[9]。在AcrAB缺失的情况下，BaeSR激活YegMNOB (MdtABCD)转运蛋白基因簇在大肠杆菌中的转录并增加其对新霉素和脱氧胆酸(Deoxycholate)的抗性^[10]。但在鼠伤寒沙门菌中，BaeSR具体对哪些耐药基因具有调控作用及其调控机制均有待阐明，在单一药物诱导耐药株中对BaeSR的研究尚未见报道。

因此，为探究双组分系统BaeSR对鼠伤寒沙门菌的耐药调控机制，本研究采用自杀质粒介导的同源重组技术^[11]，对体外诱导CIP耐药株(CR)的baeSR基因进行敲除，并构建回补重组质粒，接合到缺失株中构建回补株CR CΔbaeSR。初步分析baeSR缺失前后鼠伤寒沙门菌对抗菌药物的敏感性变化、生长特性、运动性和生物膜形成能力，为进一步研究BaeSR对沙门菌耐药性的调控机制提供试验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒

自杀质粒pLP12、回补表达质粒pBAD、E. coli DH5α λpir、E. coli β2163感受态细胞均购自广州诺晶生物科技有限公司；鼠伤寒沙门菌CIP耐药株(CR)、E. coli ATCC 25922由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器及培养基

PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNA marker购自宝生物工程(大连)有限公司；2, 6-二氨基庚二酸(DAP)、D-Glucose、L-阿拉伯糖购自Sigma-Aldrich公司；质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；11种抗菌药物均购自中国兽医药品监察所。PCR仪购自Bio-Rad公司；稳压稳流定时电泳仪购自北京市六一仪器厂；凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；超微量紫外/可见分光光度计购自Quawell公司。LB液体培养基购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank中公布的鼠伤寒沙门菌baeSR基因序列，分别设计baeSR的上、下游同源臂引物baeSR-MF1/MR1和baeSR-MF2/MR2 (baeSR-MF1 5′端携带自杀质粒pLp12基因序列；baeSR-MR2 5′端携带自杀质粒pLp12基因的反向互补序列；baeSR-MR1和baeSR-MF2反向互补)，同时设计质粒引物pLP-UF/UR用于构建重组质粒检测，根据baeSR上、下游基因设计baeSR-TF/TR用于缺失检测；构建及检测回补株的引物RP4-F2/R2、baeSR-RF/RR、pBAD-ZF/ZR及pBAD-mcf-TF/TR，引物序列见表 1。

1.2.2 baeSR上、下游同源臂的扩增

以鼠伤寒沙门菌CR的菌液为模板，用引物baeSR-MF1/MR1和baeSR-MF2/MR2分别进行PCR扩增，获得baeSR上游和下游同源臂片段。PCR反应体系(50 μL)：PrimeSTAR Max Premix (2×) 25 μL，引物F/R (10 μmol/L)各1 μL，模板1 μL，ddH₂O 22 μL。PCR反应条件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物经1%琼脂糖进行凝胶电泳后回收纯化。以上、下游同源臂片段为模板，baeSR-MF1/MR2为引物进行Overlap PCR扩增(模板50−100 ng)，Overlap PCR反应体系(50 μL)：PrimeSTAR Max Premix (2×) 25 μL，引物F/R (10 μmol/L)各1 μL，上游同源臂A 0.5 μL (50−100 ng)，下游同源臂B 0.5 μL(50−100 ng)，ddH₂O 22 μL。反应条件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，7个循环；98 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，获得融合片段AB。

1.2.3 pLP12-baeSR重组质粒的构建及鉴定

用重组酶Exnase^TM Ⅱ (ClonExpress Ⅱ，Vazyme)将AB纯化片段与自杀质粒pLP12进行无缝克隆连接，37 ℃恒温水浴30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min，−20 ℃储存待转化。

采用化学转化法将重组产物转化至E. coli DH5α λpir感受态细胞，涂布于含有20 μg/mL氯霉素和0.3% D-Glucose的LB固体平板，37 ℃培养过夜。随机挑取转化子，于5 mL LB液体培养基中37 ℃、180 r/min培养过夜，以菌液为模板，以pLP-UF/pLP-UR为引物进行PCR扩增，筛选AB插入的重组克隆pLP12-baeSR-DH5α λpir。PCR反应体系(25 μL)：2×PCR mix 12.5 μL，引物F/R (10 μmol/L)各1 μL，模板1 μL，ddH₂O 9.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min 30 s；94 ℃ 30 s，54 ℃ 25 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物用1%琼脂糖进行凝胶电泳(后续所有克隆检测均以该体系及条件进行)，将鉴定正确的阳性克隆纯化后扩大培养，并提取质粒pLP12-baeSR，−20 ℃保存。

1.2.4 pLP12-baeSR-β2163的制备

将pLP12-baeSR转化到E. coli β2163感受态细胞，转化产物涂布于含20 μg/mL氯霉素、0.3 mmol/L DAP和0.3% D-Glucose的LB固体培养基，挑取阳性克隆，划线纯化培养，命名为pLP12-baeSR- β2163。

1.2.5 缺失突变株的构建及鉴定

挑大肠杆菌pLP12-baeSR-β2163与鼠伤寒沙门氏菌CR单菌落，分别于LB液体培养基中37 ℃、180 r/min培养过夜，进行接合试验。各取100 μL菌液混合，10 000 r/min离心1 min，收集菌体沉淀以等量LB重悬，再离心，去掉上清，加入10 μL LB重悬，涂布于含0.3 mmol/L DAP和0.3% D-Glucose的LB固体培养基，37 ℃培养6 h，挑取平板上的单菌落于同等条件5 mL LB液体培养基中扩大培养，10 000 r/min离心1 min收集菌体沉淀，以1 mL LB重悬。取100 μL涂布于含20 μg/mL氯霉素和0.3% D-Glucose的LB固体培养基上。挑取纯化后的单克隆扩大培养，以野生株为对照，以baeSR-MF1/baeSR-MR2为引物，对克隆进行PCR检测(插入突变1 054 bp，野生株3 051 bp)，将阳性插入突变株命名为pLP12-baeSR-CR。

将pLP12-baeSR-CR接种于含0.3% D-Glucose的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养过夜，划线于含0.4% L-阿拉伯糖的LB固体培养基，37 ℃培养过夜，挑取平板上的克隆扩大培养后按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以野生株为对照，用引物baeSR-TF/baeSR-TR进行PCR检测，并将PCR产物纯化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.6 回补株的构建及鉴定

参照1.2.5，将缺失株与含有回补质粒pBAD的E. coli β2163进行接合，以RP4-F2/RP4-R2为引物对克隆进行检测，确定回补表达质粒pBAD (273 bp)可于缺失株基因组中复制；以鼠伤寒沙门菌CR的基因组为模板，以baeSR-RF/baeSR-RR为引物扩增baeSR基因表达片段(2 177 bp)；以pBAD质粒为模板，以引物pBAD-ZF/pBAD-ZR进行扩增获得pBAD载体片段(5 529 bp)；将纯化的baeSR基因扩增片段与pBAD载体扩增片段进行无缝克隆连接，构建重组质粒pBAD-baeSR；将其转化于E. coli DH5α感受态细胞，转化产物涂布含20 μg/mL氯霉素的LB平板，37 ℃培养过夜，以引物pBAD-mcf-TF/pBAD- mcf-TR筛选重组克隆进行PCR鉴定(2 281 bp)；提取质粒转化到E. coli β2163中，转化产物涂布含20 μg/mL氯霉素和0.3 mmol/L DAP的LB固体培养基，与缺失株CRΔbaeSR进行接合，以含有20 μg/mL氯霉素的LB抗性平板筛选克隆，以pBAD-mcf-TF/ pBAD-mcf-TR为引物进行PCR检测(2 281 bp)，并将PCR产物纯化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.7 最小抑菌浓度试验

CIP等抗菌药物MIC值的测定参照美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)抗菌药物敏感性试验操作标准^[12]，微量肉汤稀释法测定11种抗菌药物的MIC值，E. coli ATCC 25922为质控菌，试验重复3次，结果取平均值。

1.2.8 生长曲线的测定

挑取野生株、缺失株及回补株的单菌落，于2 mL LB培养基中37 ℃、180 r/min振荡培养12−14 h，以此作为母液。将母液调整至相同的OD₆₀₀值，分别取100 μL接种于5 mL LB培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养，用超微量紫外/可见分光光度计分别测定培养0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h时间点菌液的OD₆₀₀值。根据OD₆₀₀值绘制出3株菌的生长曲线，比较生长曲线的差异。

1.2.9 运动性的测定

使用LB半固体培养基进行运动性的测定试验。挑取野生株、缺失株及回补株的单菌落，于5 mL LB培养基中37 ℃、180 r/min培养过夜至菌液OD₆₀₀为1.0，蘸取菌液扎在LB半固体培养基(0.3%琼脂)中心，正置于培养箱中37 ℃恒温培养16 h，测量菌圈直径，比较差异。试验平行3次，用SPSS软件对数据进行t检验，P < 0.05即有统计学意义。

1.2.10 生物膜形成能力的测定

参照文献[13]，在无菌96孔细胞培养板加入OD₆₀₀值为0.2的野生株、缺失株及回补株菌液各200 μL，每株菌3个平行，用等量的LB液体培养基作为对照，置于湿盒37 ℃培养36 h。弃去菌液和培养液，甲醇固定15 min，无菌PBS洗3次，自然风干；每孔加200 μL 0.5%结晶紫染色30 min，PBS洗3次，自然风干，每孔加200 μL乙酸溶解30 min，用酶标仪测定OD₅₇₀值。试验平行3次，用SPSS软件对数据进行t检验，P < 0.05即有统计学意义。

2 结果与分析 2.1 baeSR基因上、下游同源臂及融合片段的扩增

以鼠伤寒沙门菌CR的DNA为模板，用引物baeSR-MF1/MR1和baeSR-MF2/MR2分别进行PCR扩增，获得baeSR基因上游(片段A，527 bp)和下游(片段B，527 bp)同源性DNA片段，割胶纯化PCR产物后经Overlap PCR扩增，获得融合片段AB (1 054 bp)，见图 1。

2.2 重组自杀质粒的构建及鉴定

pLP-UF/pLP-UR筛选AB插入的重组克隆，阳性克隆为1 304 bp，空载250 bp，见图 2。

2.3 缺失株的构建及鉴定

挑取纯化后单克隆液体培养，提取基因组，以引物baeSR-TF/baeSR-TR进行检测，以野生株为对照，正确的缺失突变克隆扩增产物片段大小为1 241 bp，野生株扩增片段大小为3 238 bp，见图 3。

2.4 回补株的构建及鉴定

将baeSR基因扩增后克隆于载体pBAD中，构建重组表达质粒pBAD-baeSR，将其转化于CRΔbaeSR后获得回补菌株CR CΔbaeSR。以缺失株为对照，以pBAD-mcf-TF/pBAD-mcf-TR为引物进行PCR检测，阳性克隆大小为2 281 bp，见图 4。

2.5 最小抑菌浓度试验结果

以E. coli ATCC 25922为质控菌进行药物敏感性试验。结果显示，在所测定的11种药物中，缺失株CRΔbaeSR与野生株CR相比，环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、安普霉素(APR)的MIC值分别降低为野生株的1/2，头孢噻呋(CEF)的MIC值降低为野生株的1/4，其他药物的MIC值未出现变化(表 2)。

2.6 生长曲线测定结果

在相同条件下培养细菌，测得的野生株、缺失株及回补株的生长曲线如图 5所示，结果显示缺失株较野生株的生长速率稍显缓慢，最终浓度也相对较低，但并无统计学上的显著差异(P > 0.05)。

2.7 运动性测定结果

对野生株、缺失株及回补株的运动性进行测定，对其运动直径进行测量。图 6结果显示，缺失株的运动性与野生株和回补株相比均显著下降(P < 0.05)；回补株运动能力较缺失株有所回升，但与野生株相比无显著差异(P > 0.05)。

2.8 生物膜形成能力测定结果

对野生株、缺失株及回补株的生物膜形成能力进行测定，图 7结果显示，缺失株的生物膜形成能力与野生株和回补株相比均显著下降(P < 0.01)；回补株生物膜形成能力较缺失株有所回升，但与野生株相比无显著差异(P > 0.05)。

3 讨论与结论

基因敲除是从基因水平研究基因功能常用的方法，Red同源重组系统、CRISPR-Cas9及自杀质粒介导的同源重组是最常见的基因敲除手段。其中，Red同源重组方法操作简单，但需要3种质粒协同提供外源Red重组所需要的3个蛋白，且某些敲除菌株对外源DNA吸收量不足，电转化也会导致细胞大量死亡。CRISPR-Cas9具有制作简单、成本低、作用高效等特点，但由于大多数原核细胞缺乏非同源末端连接修复系统，且人工进行同源重组时常有质粒残留，因此限制了该技术在原核生物中的广泛应用^[14-15]。利用自杀质粒进行同源重组不仅可快速敲除目的基因，而且可不引入任何外源片段，避免了外源基因对缺失株的影响。

本研究所选的pLP12自杀质粒可利用细菌自身广泛存在的RecBCD系统对外源DNA进行同源重组，仅需一段同源区即可定位，实现目标基因的等位替换，使重组载体的构建过程更为简单、方便。以往用于基因敲除过程中反向筛选的sacB基因在同源重组中常发生突变失活导致重组效率低，而pLP12携带的毒性基因vmt具有较大的细胞毒性，在L-阿拉伯糖诱导下进行表达，使得重组失败的菌体死亡，大大减少了第二次重组后缺失突变克隆的筛选工作^[11]。此外，E. coli β2163具有高效的供体菌接合系统，适用范围广泛^[16]，本研究采用细菌接合试验代替电转化的方法将重组质粒导入目的菌株，接合转移率高，避免了传统的电转化导致细胞大量死亡的问题。本研究试验结果表明自杀质粒pLP12和E. coli β2163可协同高效介导鼠伤寒沙门菌的基因敲除，为后续研究该菌的基因功能提供了试验基础。

在沙门菌中，双组分系统BaeSR通过调节SodA的启动子区域调节其对CIP的耐药性^[17]，当baeR过表达时，对CIP的耐药值上升；Nishino等^[7]研究表明，baeR的过表达会增强沙门菌对β-内酰胺类的抗性；Hu等^[18]在耐药沙门菌baeSR基因缺失株中观察到，CEF、CRO的MIC值分别下降为野生株的1/32和1/1 024。在本研究中，baeSR基因缺失后，对氟喹诺酮类CIP、ENR、SAR的耐药值均下降为野生株的1/2，对β-内酰胺类CEF的耐药值下降为野生株的1/4，但是对同类CRO的耐药值无明显变化，这可能与野生株的耐药背景有关。除此之外，缺失株对所选氨基糖苷类药物的耐药值均下降为野生株的1/2。在baeSR基因回补后，这些抗菌药物的MIC值基本回到对野生株的水平，但AMP的MIC值未回到原始水平，这可能是由于在构建回补株时采用pBAD回补质粒，而baeSR基因的表达与回补质粒的表达有关。

细菌生物膜(Bacterial biofilm，BF)是由细菌自身分泌的具有粘连作用的大分子组成，可将菌体与外部不利环境隔绝，使细菌耐药性增强^[19]。本研究中，baeSR基因缺失后生物膜形成能力显著下降，可能是导致其抗生素耐受能力降低的重要原因。此外，有研究报道鞭毛在生物膜的形成中具有复杂的作用机制，鞭毛的运动性对生物膜的形成具有促进或抑制的双重作用^[20-21]。本研究结果显示，baeSR基因缺失后鼠伤寒沙门菌运动能力显著降低，说明baeSR可调控生物膜形成能力及运动能力来影响其耐药性。

在沙门菌的9个功能性药物外排泵中，acrB是MDR形成最重要的外排泵，有研究报道acrB的存在会掩盖其他外排泵的作用^[22]。在本试验中，baeSR对多重耐药的调控可能因acrB的存在而未完全表达。因此，在后续试验中我们将对acrB进行敲除，进一步研究双组分系统BaeSR对耐药性的影响。

本研究中鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失后，氟喹诺酮类CIP、ENR、SAR，β-内酰胺类CEF，以及氨基糖苷类GEN、AMK、APR的MIC值降低；运动性和生物膜形成能力均显著下降。baeSR基因回补后，所选抗菌药物的MIC值、运动性及生物膜形成能力均有所上升，表明baeSR可通过影响鼠伤寒沙门菌的运动性及生物膜形成能力而影响其耐药性，这为深入研究双组分系统BaeSR对沙门菌耐药性提供了理论依据。