根际微生物是一类对植物根系有直接影响的土壤范围内生长繁殖的微生物，其与植物根系相互作用、相互促进，参与并担负着根际重要的生理过程，维系着根际的生态平衡^[1]，是土壤与植物间物质交换活跃界面的重要成员^[2-3]，具有多种生物功能^[4-5]，是国内外微生物学研究的热点之一^[6-7]。盐爪爪[Kalidium foliatum (Pall.) Moq]为多年生藜科盐生植物，在我国新疆盐碱荒漠环境广泛分布^[8]。盐爪爪具有较好的耐盐特性，在其生长过程中，根际土壤中多种离子浓度显著提高^[9]，特别是对Cl^-和Na⁺具有较高的富集效果，盐分积累可在根际形成“盐岛”效应^[10-11]。在此过程中，环境微生物受根际分泌物的刺激和盐浓度影响，存在着微生物适应性和群落分布的演变。我们课题组通过传统培养方法对辐射污染区盐爪爪根际微生物进行了分析，发现盐爪爪根际存在大量耐盐微生物，且具有多种生物功能活性，但有关其根际、根区与环境土壤微生物群落分布和多样性演变的研究尚未开展，国内外也鲜有报道。

Biolog Eco微平板技术是根据环境微生物单一碳源利用活性和类型的不同分析微生物群体差异和多样性的方法^[12]，其操作简单、灵敏度高、分辨力强、测定简便，被广泛应用于土壤、水体以及活性污泥等环境微生物生态研究中^[13]。在现有利用该技术的研究中，多数研究均采用操作指南推荐的方法进行培养分析，但由于环境样品种类繁多，样品中微生物的培养条件必然存在多样性，然而目前关于相关培养因素对微生物多样性影响的研究有限。

因此，本文以盐爪爪根系及环境土壤微生物为研究对象，开展了盐爪爪根际、根区及环境样品中微生物多样性及分布特征的分析，并开展了不同盐浓度样品稀释培养对盐爪爪根际微生物代谢特征的影响，为进一步解析盐爪爪根际微生物演变奠定理论依据，也为采用Biolog Eco微平板技术开展微生物代谢多样性研究方法学的优化提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 样品的采集

采样区域位于新疆和硕地区(N42°22′9.23″，E87°26′5.74″)，该地区属于暖温带大陆性气候，干旱少雨，光照充足，风沙较多，年平均气温8.6 ℃，极端最低气温-31.6 ℃，极端最高气温39.2 ℃。

在采样区100 m×100 m的区域中，采用蛇形采样每隔20 m选一个点，共设计7个采样点，每个点采3株盐爪爪样品。盐爪爪采用垂直挖掘法，选择完整植株根部，采用抖落法抖落非根际土壤，收集作为根区土壤样品(RZS)；利用无菌细毛刷轻刷根部收集根际土壤样品(RS)；环境土壤样本选择采样周围1 m之内明显无植被覆盖区域，采用垂直挖掘法，收集地下5 cm-30 cm环境土壤样品(ES)^[14]。每个点样品分别通过去杂充分混匀作为一个样品分析，共计获得20个土壤样品，转移至无菌离心管中，于4 ℃下保存备用^[15-16]。

1.2 主要试剂和仪器

氯化钠，天津市致远化学试剂有限公司。生化培养箱，上海福玛实验设备有限公司；Biolog Eco微平板和微生物自动鉴定系统，Biolog公司。

1.3 土壤微生物群落碳源代谢利用测定

根际、根区及环境土壤微生物代谢特征分析采用Biolog Eco微平板推荐方法进行。分别称取各类土样5 g，加入到装有50 mL灭菌的生理盐水中(加有少量玻璃珠)，摇床上200 r/min振荡30 min，使土壤充分混匀后静置15 min，采用梯度稀释法将土壤悬液稀释至10^-3，备用。取上述土壤稀释液100 μL接种到生态板中，并将接种好的Biolog Eco微平板放置于28 ℃恒温培养7 d，每隔24 h用Biolog细菌鉴定系统测定吸光值，用于后续数据分析^[17]。

样品土壤的理化信息：pH 8.8±1.4，全氮1.26±0.08 mg/kg，有机质12.3±0.15 g/kg，全盐4.8±0.1 g/kg，有效磷29.4±1.04 mg/kg，速效钾417±16.3 mg/kg，电导率1 610±42.1 μs/cm。

进行不同盐浓度对盐爪爪根际微生物活性及代谢多样性分析研究，确定不同的NaCl浓度，Biolog的标准方法一般使用0.85%的NaCl溶液。根据耐盐微生物的分类，一般认为0-5%是轻度耐盐，5%-10%中度耐盐，10%-15%是高度耐盐，因此确定0.85%、5%、10%和15%的NaCl溶液浓度进行土壤样品的稀释，进而加样，其它方法同上。

1.4 数据处理

实验按Biolog Eco微平板上31种碳源的分子结构分为6大类，即碳水化合物类(Carbohydrates) 12种、氨基酸类(Amino acids) 6种、酸类(Acids) 5种、酚类(Phenols) 2种、多聚化合物类(Polymers) 4种、胺类(Amines) 2种，以此分析土壤微生物对不同类型碳源的利用情况^[18]。在590 nm波长下测定反应的OD₅₉₀值和菌体浓度的OD₅₉₀值，在750 nm测定菌体浓度的OD₇₅₀值，用590 nm与750 nm下吸光度的差值来表征代谢活性^[19]，去除了微生物菌体自身的影响，当数值小于0时修正为0。

微生物代谢总活性采用微平板孔中溶液吸光值平均颜色变化率(Average well color development，AWCD)进行分析，计算公式^[20]为：

式中，C_i为各反应孔OD₅₉₀与OD₇₅₀的差值；R为Eco微平板对照孔A1的OD₅₉₀与OD₇₅₀的差值。C_i-R小于零的孔，计算时记为零，即：C_i-R≥0。

微生物群落多样性指数采用Simpson、Shannon和McIntosh指数来表征土壤微生物群落功能多样性。上述相关数据的处理和分析均采用DPS 9.50进行。

2 结果与分析 2.1 盐爪爪根部土壤微生物分布特征

2.1.1 不同样品的AWCD分析

分别对盐爪爪根际、根区和环境土壤样品进行Biolog Eco微平板实验，并计算各时间点的AWCD值，绘制平均颜色变化率的时间曲线，如图 1所示。由图 1可知，各样品的平均颜色变化率曲线均呈S形趋势，实验进入24 h后各样品微生物生长呈现快速升高的趋势，进入对数增长期；进入144 h时各样品微生物生长趋势减缓。进一步对根际、根区和环境土样微生物群落代谢活性分析发现，根际土壤微生物活性明显高于其它样品，总体呈现根际 > 根区 > 环境土壤的趋势。同时，由图 1可以看出, 在实验120 h时各样品微生物生长进入对数生长中后期，且各样品间存在明显差异，因此选用120 h时各样品微生物碳源利用情况进行代谢特征分析。

2.1.2 微生物群落碳源利用类型分析

将Biolog Eco微平板上的31种碳源分为6类，分析实验不同样品土壤微生物对其利用情况，结果如图 2所示。由图 2可知，不同样品土壤微生物对6类碳源利用差异明显，总体呈现根际微生物 > 根区 > 环境土壤。具体来说，根际土壤微生物在碳水化合物类、氨基酸类、酸类和胺类碳源利用方面均显著高于其它样品；根际与环境土壤微生物在多聚物类碳源利用方面差异不显著，但低于根区土壤；而3种样品在酚类碳源利用方面差异不显著。

进一步分析各样品微生物对6类碳源的利用情况，结果如图 3所示。由图 3可知，各样品中微生物群落分布明显不同，并存在一定变化趋势。随着与根的距离增加，样品中利用氨基酸、胺类碳源微生物的活性明显降低，而利用多聚物类碳源微生物的活性明显增加。根际土壤中利用酸类、碳水化合物类碳源微生物的活性高于其它样品，根际与根区土壤中利用氨基酸类碳源微生物的活性相当，但高于环境样品；3种样品利用酚类微生物的活性差异不明显。

2.1.3 微生物群落代谢多样性分析

分别采用Shannon指数(H)评估物种的丰富度，Simpson指数(D)评估某些最常见种的优势度，McIntosh指数(U)评估群落物种均匀度，以反映各样品土壤微生物群落功能多样性。结果如表 1所示，各样品间McIntosh指数(U)和Simpson指数(D)差异均不显著，而随着与根的距离增加，Shannon指数(H)随着降低，存在明显差异。表明土壤样品的微生物中优势种群变化和均匀度变化差异不显著，而微生物的多样性变化随着与根距离的增加而降低。

2.1.4 不同土样微生物群落主成分分析

对所有根际、根区和环境土壤微生物31种碳源的利用情况进行主成分分析，所得结果如图 4所示，PC1 (主成分1)和PC2 (主成分2)分别解释变量方差的37.5%和24.1%，PC1和PC2的累计贡献率为61.6%，可以解释分异的大部分信息。不同土壤样品在PC轴上出现了明显的分化，根际多分布于第一、四象限，根区分布于第一、三和四象限，而环境土壤分布于第二、三象限，从整体上看，根际、根区和环境土壤微生物群落在坐标体系中的分布有着明显的差异。

进一步将主成分得分系数与不同碳源AWCD值进行相关分析，结果如表 2所示，31种碳源中，与PC1相关性强的有16种，它们分别属于碳水化合物类的D-木糖、D-半乳糖醛酸、α-D-葡萄糖-1-磷酸、α-D-乳糖和D, L-α-磷酸甘油，氨基酸类的L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-苯基丙氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸，酸类的γ-羟丁酸、衣康酸和D-苹果酸，酚类的2-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸，多聚物类的肝糖，以及胺类的腐胺，说明这些碳源使不同的土壤微生物群落代谢功能多样性在PC1上差异显著，决定PC1的分异。与PC2相关强的有5种，分别属于碳水化合物类的N-乙酰-D-葡萄糖胺和α-D-葡萄糖-1-磷酸，氨基酸类的L-苏氨酸，酸类的α-丁酮酸，以及胺类的苯乙胺，说明这些碳源使不同的土壤微生物群落代谢功能多样性在PC2上差异显著，决定PC2的分异。

2.2 不同盐浓度对微生物代谢多样性分析的影响

2.2.1 不同盐浓度稀释上样对盐爪爪根际微生物代谢活性的影响

实验对采集根际样品中微生物在不同NaCl浓度下的代谢活性进行了分析，结果如图 5所示。由图 5可知，盐爪爪根际微生物在不同NaCl浓度下的AWCD值变化存在明显不同，其中5% NaCl浓度下根际微生物碳源代谢活性最高，高于使用传统生理盐水，而过高的NaCl浓度会抑制根际微生物的代谢，其中15% NaCl浓度几乎完全抑制了根际微生物对碳源的利用。

2.2.2 盐浓度对盐爪爪根际碳源利用微生物分布的影响

实验对根际样品中微生物在不同NaCl浓度下的不同类别碳源利用情况进行了分析，结果如图 6所示。由图 6可知，不同NaCl浓度下，样品对6类碳源利用差异明显。总体利用活性呈现为5% NaCl > 0.85% NaCl > 10% NaCl > 15% NaCl，其中5% NaCl浓度下根际微生物对碳水化合物类、氨基酸类和胺类碳源的利用显著高于其它浓度，0.85% NaCl浓度下根际微生物对酸类、酚类和多聚物类碳源的利用明显高于其它浓度。

由于15% NaCl下微生物代谢活性过低，进一步分析不同盐浓度下的样品对6类碳源的代谢活性时，仅对其它样品进行分析，结果如图 7所示。由图 7可知，不同盐浓度下的样品对6类碳源的利用所占比例存在明显的差异。随着盐浓度的增加，样品中利用碳水化合物类碳源微生物活性逐渐增加，而利用酸类碳源微生物活性逐渐下降。5% NaCl浓度下，胺类、氨基酸类碳源的利用微生物活性明显高于其它浓度，而多聚物类和酚类的活性明显小于其它浓度。

3 讨论与结论

利用Biolog Eco微平板开展微生物代谢多样性研究，因其操作简单、快速，具有灵敏度高、分辨力强的特点，已成为微生物生态研究的重要方法之一。本研究采用Biolog Eco微平板技术对盐爪爪根际、根区和环境土壤微生物的多样性进行了研究。结果表明，根际土壤微生物代谢活性明显高于其它样品，且微生物活性总体呈现根际 > 根区 > 环境的趋势，这可能与根系会分泌更多的根系分泌物有关，这些分泌物会促进根部微生物的生长繁殖，达到一个互利的过程^[21]，这与此前报道的根际微生物的数量显著高于环境样品的结论一致^[22]。不同碳源利用微生物群落所占比例分析表明，随着与根际距离的增加，样品中利用氨基酸、胺类碳源微生物所占比例明显降低，而利用多聚化合物类碳源微生物所占比例明显增加，根际土壤中利用酸类、碳水化合物类碳源微生物所占比例高于其它样品，而与根区土壤中利用氨基酸类碳源微生物所占比例相当，但高于环境样品。进一步通过主成分分析及相关碳源的关系分析表明，碳水化合物、酸类、氨基酸类碳源也是主要影响微生物群落分布的主要因素。这一结果可能与植物根系分泌的主要化合物有关，一般而言，根系分泌物主要由糖类、酸类和氨基酸类物质组成，这些物质均易被微生物生长利用^[23]，但是不同植被根系分泌物可能存在不同，也会导致不同碳源利用微生物种群增加^[24]。多样性指数分析表明，随着与根的距离增加，各样品McIntosh指数(U)和Simpson指数(D)差异不显著，而Shannon指数(H)随着降低且存在明显差异，表明土壤样品的微生物中优势种群变化和均匀度变化差异不显著，而微生物的多样性变化随着与根距离的增加而降低，进一步表明根际分泌物对盐爪爪根区微生物的演变有着重要的影响。

同时，考虑到盐爪爪的离子岛效应会促进根际盐度的迁移，盐的浓度会增加，势必增加耐盐微生物的数量和种类，此前也发现盐爪爪根际存在着大量的耐盐微生物^[25]。本文开展了样品稀释和培养溶液的NaCl浓度对盐爪爪根际微生物多样性影响的研究，结果发现不同NaCl浓度培养条件下，微生物代谢活性和微生物群落组成存在着明显差异，在5% NaCl土壤稀释和Biolog Eco微平板培养液下盐爪爪根际微生物代谢活性最高，表明盐爪爪根际存在丰富的中度适盐菌。目前，国内外在使用Biolog Eco微平板时常通过产品说明书开展，很少考虑样品来源的特性及培养条件对微生物培养的影响，如酸度、离子浓度、温度等因素。党雯等^[26]研究发现不同的样品预处理方法在测定结果上存在着差异；贾夏等^[27]发现Biolog Eco微平板培养时间对环境微生物群落多样性指数、6类碳源的利用率和主成分分析等结果产生明显影响。本研究发现土壤微生物稀释和培养盐浓度对采用Biolog Eco微平板技术分析也有着重要的影响，进一步证实了不同的培养条件会对样品微生物代谢活性产生明显的影响，为进一步开展相关Biolog Eco微平板培养条件的优化提供了科学依据。