西双版纳热带季雨林自然保护区处于云南省南部，保护区因其独特的地理与气候条件特征，为此地的土壤、植物和微生物的丰富性提供了良好的条件。细菌作为生态系统中重要的组成部分，与物质循环、能量传递等都密不可分，与土壤和植物之间也存在复杂的关系网。放线菌作为细菌的一部分，广泛分布于大自然中，土壤则是放线菌及其生物活性物质的一个重要来源。植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是自由存在于土壤或植物体内，可通过分泌吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、解磷、产铁载体、产纤维素酶等能力来促进植物生长的一类有益微生物。

植物根际土壤中的放线菌能够帮助植物的根部不被病原菌感染，且其中部分根际放线菌还具有促进植物生长的能力^[1]。如产吲哚乙酸菌能分泌生长素(IAA)，一种植物生长激素，能够促进植物生长；产铁载体菌分泌铁载体到土壤中与难溶性铁结合改变铁的形态使之被植物吸收^[2]；解磷菌能将固定态植物难吸收的磷转化为可以直接利用的形式，提高磷的利用率；产纤维素酶菌通过产纤维素酶来催化降解纤维素，用于食品、造纸、或资源再利用领域等。在现有的报道中，细菌具有较好的促生长能力且研究较为普遍，而放线菌在此方面的研究尚不够完善。

目前，国外的学者对植物根际放线菌的功能性，如产IAA、产铁载体、纤维素酶等方面做了相应研究且取得一定的成果^[3-5]；国内的学者对土壤中放线菌对植物的促生作用也做出了一定的探索研究^[6-9]。但是对于西双版纳保护区植物根际土壤中细菌特别是放线菌的筛选及其促生作用的研究极少，仅对西双版纳热带雨林土样中放线菌的多样性及其活性做了相应的鉴定^[10]。

本研究从西双版纳保护区植物根际土壤中分离筛选植物促生菌，运用微生物学经典方法分离筛选得到14株菌株纯培养物，用16S rDNA序列分析进行分类学鉴定，并对菌株产IAA、铁载体、纤维素酶、淀粉酶以及是否有解磷的能力进行了测定，以期为西双版纳保护区植物根际微生物的开发利用提供菌株资源。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样品采集

植物根际土壤样品采自云南西双版纳保护区(99°56′E-101°50′E，21°08′N-22°36′N)利用五点法在保护区边缘、保护区实验区以及保护区缓冲区范围内生长良好的植物根部土壤区，去除表面的杂物以及表层约5 cm的土壤，用灭菌铲采集5 cm-10 cm深度的根际土壤15份，分别编号装于无菌自封袋中，封口带回实验室，自然风干后，于4 ℃下保存，以备后续植物根际促生菌的筛选。

1.1.2 培养基

ZSSE培养基^[11]，海藻糖-脯氨酸培养基^[12]，高氏一号培养基^[13]，几丁质琼脂培养基^[14]，淀粉酪素培养基^[12]。

1.1.3 主要试剂和仪器

3, 5-二硝基水杨酸溶液(DNS)，CMC-Na溶液，硫酸钼锑贮备液，钼锑抗显色剂，Salkowski试剂，CAS检测液等。

电热恒温培养箱，上海-恒科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 土壤样品的处理

将风干后的土样充分混匀称取10 g，放于90 mL带玻璃珠的灭菌蒸馏水中，振荡30 min使之混合均匀，吸取1 mL悬浮液于9 mL灭菌水中，制成浓度为10^-1的土壤悬浮液，再用灭菌水依次进行浓度梯度稀释，取不同浓度梯度的悬浮液适量分别涂布平板，每个处理3次重复，倒置存放于28 ℃恒温培养7 d。

1.2.2 菌株的分离纯化与保存

在筛选培养基中分别挑取优势菌株，进行纯化和多次传代，每个菌株设置3个平行，在不同的纯化培养基于28 ℃恒温培养箱中倒置培养7 d后，选取纯化后的菌株在不同的活性检测培养液中于30 ℃、120 r/min振荡培养7-14 d，取适量的纯菌液与已灭菌的20%甘油混合于保藏管中-20 ℃保藏，剩下的一部分用于鉴定，一部分做活性检测实验。

1.2.3 菌株鉴定

对挑选出的菌株进行16S rRNA基因测序，PCR采用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系30 μL：2×Taq Master Mix 15 μL，10 mmol/L MgCl₂，0.2 μmol/L dNTPs，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL，无菌水补足30 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。产物经1%琼脂糖电泳检测后，交昆明硕擎生物科技有限公司测序，所得测序序列提交到NCBI作BLAST分析，用MEGA 5.2软件中Neighbor-Joining方法来构建系统发育树，分析其亲缘关系。

1.2.4 菌株的活性检测

(1) 产吲哚乙酸(IAA)的测定

标准曲线的制定，分别测定各浓度(0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μg/mL)吲哚乙酸标准液OD₅₃₀的值，绘制IAA标准曲线。用Salkowski比色法测定产吲哚乙酸(IAA)的量^[15]。将菌株接种于含有L-色氨酸的LB培养液中，28 ℃、150 r/min培养48 h，吸取50 μL菌悬液与等体积的Salkowski比色液混匀，室温避光放置30 min后观察，颜色变红者为能够分泌IAA的阳性菌株。将初步筛选到的阳性菌株培养液于11 000 r/min离心15 min，取1 mL上清液加1 mL纯水和4 mL Salkowski试剂，35 ℃避光静置30 min，测定OD₅₃₀值。代入标准曲线计算出IAA含量。

(2) 产铁载体能力的测定

取菌株培养液11 000 r/min离心15 min，取1 mL上清液和1 mL高氏一号液体培养液作空白，然后各加2 mL CAS检测液混合均匀，室温条件下静置反应60 min，测定OD₆₃₀，测试管记为A，空白管记为A_r。计算A/A_r的比值与铁载体活性单位(Siderophore unites，Su)的值表示菌株产铁载体能力，Su=[(A_r-A)/A_r]×100%。

(3) 解磷能力的测定

标准曲线的制定，分别测定各浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μg/mL)磷酸标准液OD₇₃₀的值，绘制磷酸标准曲线。采用钼锑抗显色法测定解磷的能力^[16]。取菌株培养液于11 000 r/min离心15 min，取1.25 mL上清液加入2.5 mL钼锑抗显色剂，慢慢摇动试管并加水定容至25 mL，室温静置30 min，测定OD₇₃₀值。以不接菌的培养基作为对照，通过磷酸标准曲线计算出磷酸量。

(4) 产纤维素酶活性测量

葡萄糖标准曲线的制定，分别测定不同量(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL)葡萄糖标准液OD₅₂₀的值，绘制葡萄糖标准曲线。取菌株培养液在11 000 r/min离心15 min。取0.5 mL上清液加入1.5 mL 0.5%的CMC-Na缓冲液和DNS试剂2.0 mL，沸水煮沸2 min，取出冷却后用蒸馏水补足到25 mL，测定OD₅₂₀，作为空白对照组。另取2支带有25 mL刻度的试管作平行样品管。每支样品管中加0.5 mL酶溶液，置于50 ℃水浴锅中预热30 min，然后在2支试管中分别加入1.5 mL已预热至50 ℃的CMC-Na溶液和DNS试剂2.0 mL，煮沸2 min，取出冷却后用蒸馏水补足到25 mL，测定OD₅₂₀。计算出葡萄糖数，再代入公式：酶活力(U/mL)=A×1/0.5×n×2，其中A为吸光度在标准曲线上查得的还原糖量，mg；1/0.5换算成酶液1 mL；2为时间换算系数。

(5) 淀粉水解酶活性的测定

麦芽糖标准曲线的制定，分别取不同量(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL)的麦芽糖标准液OD₅₄₀的值，绘制麦芽糖标准曲线。取2支试管，一支对照一支测定，各加菌液0.5 mL，70 ℃准确加热15 min，取出冷却后，向对照管加2 mL 0.4 mol/L NaOH，终止酶活；测定管和对照管于40 ℃水浴15 min，均加入1 mL 40 ℃预热的淀粉，立即40 ℃水浴保温15 min，取出后迅速向测定管中加入2 mL 0.4 mol/L NaOH；取出对照管和测定管中溶液各2 mL，分别加入到刻度试管中，各加2 mL 3, 5-二硝基水杨酸，沸水浴5 min，冷却后稀释至25 mL，混匀，测定OD₅₄₀，代入标准曲线计算。

1.2.5 数据处理

利用Microsoft Excel 2013和Origin 7.0软件进行数据分析及图表制作。

2 结果与分析 2.1 菌株的筛选与鉴定

为获得更多不同种类菌株，特别是稀有放线菌菌株，采用5种不同培养基分离西双版纳保护区根际土壤样品，得到菌株120株；经过菌株形态排除重复及酶活性初步检测，得到14株菌株。对分离筛选得到的14株菌株的16S rRNA基因序列通过NCBI数据库完成分子生物学鉴定，其结果如表 1所示。

从表 1中的结果可以看到，分离得到的14株菌株与其相似菌的相似度为99%或100%，分别归属于链霉菌属(Streptomyces)、诺卡菌属(Nocardia)、杆菌属(Bacillus)、中华根瘤菌属(Ensifer)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、固氮螺菌属(Azospirillum)和狭单胞菌属(Stenotrophomonas)。用MEGA 5.2软件构建菌株的系统进化树如图 1所示，菌株B412与B433，B542与B546在同一分支上，且相似性较高，前者同属链霉菌，后者同属根瘤菌。

2.2 可培养细菌活性检测分析

2.2.1 产吲哚乙酸(IAA)能力检测

定量检测初步筛选出的14株植物根际促生菌的产IAA能力(图 2)，菌株B433分泌的IAA最多，且随培养时间的增加其分泌IAA的量随之增加，在培养12 d时达到峰值9.23 mg/L。这些菌株分泌IAA的量的范围在0.29-9.23 mg/L，且随时间的变化和分泌的量差异较大，可能是菌株在不同培养基中表现出的优势有所不同。

2.2.2 产铁载体能力检测分析

定量检测初步筛选到的14株植物根际促生菌，其能力检测结果见表 2。菌株B546、B453、B351这3株细菌产铁载体的能力较强，其Su最高可达86.67%，强度为+++++；菌株B433、B442、B542、B545这4株细菌产铁载体的能力次之，Su值在60%-80%之间，强度为++++；其余菌株的产铁载体能力相对较弱，Su < 60%。影响此能力的原因可能是菌株自身特性差异或是不同培养基对菌株的影响，导致菌株分泌铁载体的量不同；也可说明菌株在复杂多变的自然环境中也能分泌一定的铁载体，确保菌株功能运行。植物根际土壤中具有良好产铁载体能力的菌株，不仅能促进植物旺盛生长，还能通过竞争铁营养达到生物防治的作用^[17]。

2.2.3 解磷能力检测分析

对初筛的14株菌株解磷能力进行定量检测(图 3)，其中菌株B541的解磷能力最强，磷酸根的浓度达到9.79 mg/L，解磷菌可将植物难以吸收的磷转化为可吸收的磷的形态，提高植物对磷的吸收量和根系活力，且可增加土壤肥力^[18]。

2.2.4 纤维素酶活的测定分析

综合分析14株菌中具有产纤维素酶能力的有13株，由图 4可知，各菌株均有产纤维素酶能力。菌株B442综合产纤维素酶能力最强，其酶活力最高达到31.86 U/mL，菌株B542次之30.62 U/mL。

2.2.5 淀粉水解酶活性的测定分析

初筛的14株中有9株具有产淀粉酶的能力，其酶活力如图 5所示，菌株B412淀粉酶活力最高为16.07 U/mL；菌株B547酶活力最低为4.19 U/mL。目前在工业方面大多用微生物发酵法生产淀粉酶制剂。因此将土壤中产淀粉酶的菌株分离出来用于工业，能大大提高效率与经济。

3 讨论

从植物根际土壤筛选得到的细菌能够分泌促进植物生长的激素，其能力大小与菌株自身特性或生长环境紧密相关。本研究采用纯培养的方式，筛选到的菌株经分析鉴定后发现，在筛选放线菌的同时得到了部分细菌，且生长状况及其促生能力较好，说明某些细菌也可在筛选放线菌的培养基上生长。受培养条件及其他因素的影响，不可培养菌还有一定的占比，此纯培养的结果不能完全表示本试验样本中微生物的情况，今后可采用宏基因或其它更先进的技术来完善。

从试验研究结果看来(表 3)，菌株在分泌生长激素(IAA)的方面，最高可分泌IAA的量为9.23 mg/L，与Haiyambo等^[3]从纳米比亚东部卡万戈地区的草根际分离与筛选出的菌株分泌IAA的最高值为8.98±0.46 mg/L的量几乎相符合，说明西双版纳保护区植物根际的放线菌在分泌生长激素促进植物生长方面有较大的开发价值。在具有产铁载体能力的菌株中，其Su值多数在60%以上，能较好地分泌铁载体给自身提供可利用的铁源，同时也可形成铁浓度相对高的小生境，有利于其它同铁源的植物利用^[19]，但总体上放线菌的产铁载体能力相对于细菌较低。能溶磷菌株的有效磷含量在2.97-9.79 mg/L，郭英等^[20]从野大豆根际分离得到N4 (Bacillus aryabhattai)有效磷含量为32.53 mg/L。与之相比，本试验的综合解磷能力远远小于其它解磷菌的解磷能力，这可能与菌株的产磷能力、培养基的营养差异、优化条件等有关，若改善实验的相关条件，菌株的溶磷能力可能会更高。产纤维素酶的菌株中酶活最高可达31.86 U/mL，在已有的研究中，任大明等^[21]筛选出1株链霉菌，其产纤维素酶的酶活为30.06 U/mL。由此可见，西双版纳保护区的菌有较好的产纤维素酶能力，开发研究更高效酶活性的纤维素酶在医药、食品﹑棉纺﹑环保及可再生资源利用领域的酶制剂方面都具有重要的意义。在产淀粉酶方面，所得菌株淀粉酶酶活力在4.19-16.07 U/mL，而张志强等^[22]筛选得到高产淀粉酶活性为365.12 U/mL的菌株，与本试验结果相差较大，很大可能是培养基以及培养条件的差异；苏雪莹^[23]分离土壤中的产淀粉酶菌株的最高产酶量为4.95 U/mL，与之相差的原因可能是菌株生长条件以及自身特性不同而导致的差异。相对而言本试验分离的产淀粉酶的酶活力较为一般，后续可以优化培养条件看是否有所改善。

4 结论

本研究从西双版纳保护区根际土壤中筛选出14株促生菌，其中菌株B542紫穗槐中间根瘤菌(Mesorhizobium amorphae)具有较好的产吲哚乙酸(IAA)，同时还具有较好的产铁载体和产纤维素酶的能力；菌株B433禾谷链霉菌(S. graminisoli)、B545紫穗槐中间根瘤菌(Mesorhizobium amorphae)、B221色褐链霉菌(S. chromofuscus)等菌株均有2种及以上的较好产酶能力。综上所述，西双版纳保护区植物根际土壤中存在具有促生作用的菌株，且同一种菌具有不同的促生功能。因此，开发研究西双版纳保护区植物根际细菌及其促生能力具有重要的研究价值和意义。