α-淀粉酶可催化淀粉内部α-1, 4糖苷键的水解^[1-3]，是目前用途最广泛、需求量最大的工业用酶之一，在食品、纺织、饲料等领域都有大量应用^[4-5]。α-淀粉酶的热稳定性与其空间结构具有重要关系^{[2, 6]}，主要受氢键、疏水相互作用、静电相互作用等影响^[7]，金属离子等填充物也是重要的影响因素^[8-10]。对Bacillus amyloliquefaciens的α-淀粉酶研究发现，Asp233结合Ca²⁺可影响酶的热稳定性，为α-淀粉酶热稳定性改造提供了思路^[11]。在研究最为透彻的B. licheniformis的α-淀粉酶中，结构域A、B之间嵌入的Ca²⁺也对其稳定性和活性起到重要作用^[12-13]。然而，对低温α-淀粉酶在此方面的研究却较为欠缺。α-淀粉酶的热稳定性是影响其应用的重要因素，目前使用较广泛的中高温α-淀粉酶难以用于低温处理的加工环节，较低的热稳定性又是低温α-淀粉酶在工业应用中的瓶颈^[14]。而开发温度耐受范围较宽的α-淀粉酶，则可在具有温度变化的生产过程中，节省转换酶类的成本和时间，宽松加工条件，具有较好的应用前景。

当前绝大多数的α-淀粉酶来源于陆地生物^[15-17]，海洋来源的α-淀粉酶则处于高度未开发状态。本实验的深渊藤黄单胞菌XH031 (Luteimonas abyssi XH031)是从深海分离到的一株细菌^[18]，在前期研究中已经完成了该菌株的全基因组测序，克隆表达了一个α-淀粉酶基因，纯化了α-淀粉酶LamA，并对其酶学特性进行了初步研究。LamA蛋白序列较新颖，其比活力可达到8 881 U/mg，在同类α-淀粉酶中比活力较高，且在低温环境下仍能保持较高酶活力^[19]。本课题拟在前期研究的基础上，寻找提升低温α-淀粉酶LamA热稳定性的途径，开发其在较高温度下的应用价值，使其具有更宽的温度耐受范围；并初步明确影响这一特性的关键氨基酸位点，为更多α-淀粉酶向宽温度耐受方向改造提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

用于实验的菌株和质粒如表 1所示。

1.1.2 LB培养基(g/L)

酵母膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0；调节pH至7.0，固体培养基需加入2%琼脂，1×10⁵ Pa灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂和仪器

Prime STAR GXL DNA Polymerase，TaKaRa公司；质粒提取试剂盒，北京博迈德基因技术有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技有限公司。高速冷冻离心机，Thermo公司；PCR仪，Applied Biosystems公司；酶标仪，Fecan公司。

1.2 方法

1.2.1 金属离子对LamA热稳定性的影响测定

在等浓度的LamA中分别加入终浓度1 mmol/L和5 mmol/L的Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺，并设置空白对照。吸取10 μL酶液，加入90 μL用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)配制的1%可溶性淀粉溶液，于65 ℃反应10 min。加入100 μL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却，定容至1 mL。吸取150 μL反应液，用酶标仪测定其OD₅₄₀。参考麦芽糖标准曲线，计算待测蛋白的酶活力^[19]。再于LamA中分别加入浓度逐渐升高的Ca²⁺，与空白对照一同于30、55和65 ℃温浴30 min，测定剩余酶活力。

1.2.2 LamA关键位点预测及突变

对LamA的蛋白序列进行BLASTp和CD-Search分析，并将其与相似性较高且经过实验验证的α-淀粉酶序列P22630 [Aeromonas hydrophila]、O18420 [Drosophila subobscura]、O18408 [Drosophila melanogaster]、P22998 [Streptomyces violaceus]、P27350 [Streptomyces thermoviolaceus]进行多序列比对，参考研究最为透彻的B. licheniformis的α-淀粉酶(UniProtKB:Q208A7)的钙结合区域关键位点^[20]，预测可能影响LamA热稳定性及Ca²⁺结合的氨基酸位点。

以pET-24a/LamA为模板，以突变位点为中心设计表 2所示引物，使Asn120、Gln185、Asp200、His233、Met234和Thr224突变为性质相反的氨基酸。以pET-24a/LamA为模板，将含有突变位点的引物作为扩增引物，PCR扩增体系(50 μL)：5×Prime STAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4 μL，Primer 1 (20 μmol/L) 1 μL，Primer 2 (20 μmol/L) 1 μL，Template 0.5 μL，Prime STAR GXL DNA polymerase 2 μL，ddH₂O 31.5 μL。PCR反应条件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 10 s/1 kb，共30个循环；72 ℃ 2 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并将目的片段切胶回收纯化，得到含有突变位点的线性片段；5′-磷酸化处理使其自连为环状质粒，转化进感受态细胞BL21中；挑取阳性克隆，提取质粒，进行酶切和测序验证。

1.2.3 重组突变蛋白的表达、纯化及活性检测

将活化的重组表达菌株和空载对照接种至LB液体培养基(卡那霉素终浓度100 μg/mL)中，37 ℃、170 r/min振荡培养；待OD₆₀₀达到0.4-0.6之间，加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG，16 ℃、170 r/min诱导表达12-20 h。于4 ℃、12 000 r/min离心10 min收集菌体，重悬于过滤除菌的Binding buffer中，置于冰上超声破碎(小探头200 V，超声5 s，间隙10 s，50次)；于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液，用0.2 μm滤器过滤，4 ℃保存备用。将上清液加入镍层析柱中上样，依次用咪唑浓度逐渐提高(10、20、50、75、250 mmol/L)的缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；0.5 mmol/L NaCl)洗涤蛋白层析柱，最后用咪唑浓度500 mmol/L的缓冲液洗脱层析柱。将收集到的蛋白液于4 ℃透析，除盐复性。配置12% (质量体积比)的分离胶，用SDS-PAGE法检测表达蛋白的纯化结果^[19]。

吸取2 μL酶液，以透析液作为空白对照，使用NanoDrop 2000/2000c测定蛋白浓度，并将酶液稀释为相同浓度。各取10 μL酶液加入可溶性淀粉平板，37 ℃过夜；使用卢戈氏碘液检验，观察是否有透明圈。利用麦芽糖标准溶液绘制的标准曲线，计算LamA和各突变蛋白的比活力。

1.2.4 温度对LamA及突变蛋白的活性和稳定性的影响测定

参照1.2.1的方法，在90 μL的1%可溶性淀粉溶液中分别加入10 μL等浓度的LamA和突变蛋白，于不同温度(4、10、16、30、37、50、60、70、80、90、100 ℃)下反应10 min，测定和计算LamA和各突变蛋白在不同反应温度下的相对酶活。再将等浓度的LamA和突变蛋白于不同温度(0、10、20、30、37、50、60、70、80、90、100 ℃)下温浴20 min，在相同反应体系下，于最适温度反应10 min，测定LamA和各突变蛋白的剩余酶活力。

1.2.5 LamA和突变蛋白在钙离子条件下的热稳定性测定

在等浓度的LamA和突变蛋白中，加入终浓度5 mmol/L的Ca²⁺，分别于37 ℃和65 ℃下温浴1 h。参照1.2.1的方法，在1%可溶性淀粉溶液中加入10 μL酶液，于最适温度(LamA和T224D为50 ℃；N120D和Q185E为37 ℃)反应10 min，测定其剩余酶活力。

1.2.6 钙离子结合位点的蛋白结构分析

对LamA的蛋白序列进行BLAST分析，在PDB数据库中选取相似度高的蛋白，利用软件PyMOL和Adobe Illustrator模拟LamA的Ca²⁺结合区域的蛋白结构。

2 结果与分析 2.1 金属离子对LamA热稳定性的影响

在LamA中分别添加不同浓度的Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺，检测其在65 ℃下的酶活力(图 1)。Na⁺、K⁺、Al³⁺对LamA在65 ℃的酶活力几乎没有影响；Fe³⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺有轻微抑制作用，但不具显著差异；Ca²⁺则明显提高了酶活力。

进一步实验发现，未添加Ca²⁺时，65 ℃处理30 min完全失活(5 min即失去90%活性)，55 ℃处理30 min相对酶活为5%；而在添加1 mmol/L和5 mmol/L的Ca²⁺后，相对酶活显著上升(表 3)。此外，当Ca²⁺浓度继续升高时(5-50 mmol/L)，相对酶活没有随之增强，说明5 mmol/L的Ca²⁺足够使LamA保持在65 ℃和55 ℃的酶活力及稳定性。根据上述结果，初步推测LamA具有影响热稳定性的Ca²⁺结合位点。

2.2 LamA生物信息学分析

α-淀粉酶LamA的基因序列全长为1 428 bp，编码510个氨基酸，预测其信号肽长度为35个氨基酸，BLASTp结果分析其为钙结合蛋白。选取与LamA相似性较高且经过实验验证的α-淀粉酶序列，与LamA的蛋白序列进行多序列比对(图 2)，并参考B. licheniformis的α-淀粉酶(UniProtKB：Q208A7)钙结合区域关键位点^[20]，预测了5个可能影响LamA耐热性及Ca²⁺结合的氨基酸位点：Asn120、Gln185、Asp200、His233和Met234。通过NCBI的CD-Search预测的Ca²⁺结合位点Thr224也于此处一并研究。

由于LamA序列较新颖，与PDB数据库中其他蛋白序列相似性较低，不适合进行同源建模。选取与LamA相似度相对高且同样结合Ca²⁺的蛋白进行比对(表 4)，发现Ca²⁺活性中心比较保守，可用这些蛋白来模拟LamA的Ca²⁺结合区域(图 3)。综合模拟结果，判断Asn120、Asp200和His233为Ca²⁺结合区域的保守位点，Gln185也可能在该区域中起到关键作用。Asp具有负电性，Asn和His为极性氨基酸，均可与Ca²⁺产生相互作用。进一步推测，在未添加Ca²⁺时，区域中多个羰基氧可产生静电排斥；而当羰基氧与Ca²⁺结合后，则会使结构的稳定性增加。此外，Asn120与Asp200之间的氢键也可能对蛋白结构的稳定性起到作用。

2.3 重组突变蛋白的活性检测

对预测的关键位点进行突变，诱导表达和纯化了重组突变蛋白，并使用可溶性淀粉平板检验各突变蛋白的酶活力：D200R和H233D/M234C完全失活；N120D、Q185E、T224D出现透明圈，但活性均较LamA有所降低(图 4)。利用麦芽糖标准曲线计算比活力，突变蛋白的比活力均低于LamA (表 5)。

2.4 温度对LamA及突变蛋白的活性和稳定性的影响

于pH 8.0的反应体系中进行酶活力测定实验，结果如图 5所示，突变蛋白T224D的最适反应温度与LamA相同，均为50 ℃；而N120D与Q185E的最适反应温度为37 ℃。温度升高后，3种突变蛋白相对酶活的降低速率与LamA无显著差别。此外，对Thr224的突变影响了其低温活性。

温度稳定性实验的结果如图 6所示，LamA和3种突变蛋白在30-37 ℃之间稳定性最高，且稳定性受高温的影响程度差别不大。综合两个实验结果，初步判断Asn120、Gln185和Thr224并非直接决定热稳定性的位点，可能还需其他条件才能实现对LamA热稳定性的影响。

2.5 关键位点在钙离子条件下对LamA热稳定性的作用

在5 mmol/L的Ca²⁺条件下，测定LamA和突变蛋白在65 ℃的稳定性，发现N120D的实验结果较有意义(图 7)。常温下N120D与LamA的酶活力差别不大，说明Asn120与Ca²⁺的结合不会直接增强酶活力；但当温度升高至65 ℃时，LamA的相对酶活降为36%，而N120D的相对酶活则骤降为10%，仅为同温下LamA酶活力的27.8%。说明当Ca²⁺存在时，Asn120位点对LamA的热稳定性作用显著。

3 讨论与结论

目前已有许多研究探讨了钙结合对高温α-淀粉酶热稳定性的关键作用^{[8, 11, 21-23]}，但对低温α-淀粉酶的相关研究却较为欠缺。LamA作为低温α-淀粉酶，却可通过添加Ca²⁺来提高热稳定性，因而具有较好的研究价值。本实验初步明确了Asn120为此过程的关键位点，推测Asn120与Ca²⁺的结合不会直接增强酶活力，但能帮助LamA在较高的温度下稳定结构。此后计划将Asn120突变为更多其他氨基酸，来进一步明确其作用机制。此外，根据与B. licheniformis的α-淀粉酶的比对分析^{[13, 20]}，推测Asn120、Asp200和His233还可能是LamA中Ca-Na-Ca结构的关键位点，对钠离子结合的相关研究也将成为下一步的探讨方向。

α-淀粉酶的热稳定性影响了其在实际应用中的经济可行性^[24]。目前发现的低温酶通常具有较高的结构灵活性^[25]，表现出更低的活化焓和活化熵^[26]，因此可以在生产过程中节省能源、提高效率^[27-31]。但低温酶较弱的温度耐受性一直是其应用中的瓶颈^[32-33]。解决这一问题的思路通常是通过定点突变来改造低温酶^[34-35]，例如最近对来自Euplotes focardii的低温α-淀粉酶的突变改造^[36]。而LamA则为这一问题的解决提供了另一种方向：通过直接添加离子等方式，使低温α-淀粉酶获得更宽的温度耐受范围，可使其在食品、饲料加工等具有温度变化的生产过程中具有更好的应用前景。

本实验中的LamA在同类α-淀粉酶中比活力较高，且在低温环境下仍能保持较高酶活力^[19]，添加Ca²⁺后热稳定性的增强，则赋予了它更高的潜在应用价值。在本次研究中，已初步明确了与这一特性相关的关键位点。通过研究LamA的热稳定性与Ca²⁺的相关性，也有望为更多α-淀粉酶向宽温度耐受方向改造提供参考依据。