植物内生固氮菌是指定殖在健康植物体内，与宿主植物进行联合固氮的一类原核微生物，是植物微生态系统的天然组分^[1]。由于长期的共同进化，植物内生菌与宿主植物建立了良好的互利共生关系，内生菌相比根际、叶际附生微生物使植物宿主更为受益^[2]。内生固氮菌定殖于植物体内，生活在植物细胞内、细胞间隙、木质部导管等部位并进行固氮作用^[3-4]，不仅可满足自身生长和固氮所需的物质和能源，固定的氮可直接供给植物吸收，还能分泌生长素、铁载体、ACC脱氨酶和溶磷解钾，从而促进作物生长，提高作物抗性，是一类潜力巨大、尚待开发的微生物资源。

草本植物的茎秆木质部不发达，其木质化细胞少营养丰富，利于内生菌生长，是植物内生菌宿主的丰富来源。国内外对禾本科等植物内生菌已有很多报道^[5-7]，但是对多肉植物内生菌的研究较少。落地生根(Bryophyllum pinnatum)为景天科多年生肉质草本植物，是一种中药材，全株均可入药，具有解毒消肿活血止痛的作用，对落地生根提取物的抑菌活性成分和抗氧化研究较多，而内生菌的研究鲜有报道。

随着绿色生态农业建设的发展，长期单一施用化肥带来的对土壤和环境负面影响问题也越来越受到关注，植物内生固氮菌的研究与生物肥料和菌剂的开发利用备受重视。因此，了解植物内生菌的种群结构，充分挖掘内生菌的生物学功能，应用于生态农业，对可持续发展具有重要意义。本研究从多肉草本植物落地生根中分离纯化出26株内生固氮菌，隶属于4个属的5个菌种，具有丰富的遗传多样性和多种促生功能。扩充微生物资源库的同时，挖掘了潜在的优良促生菌。为内生菌促进植物生长和生物防治的深入研究提供理论依据及应用研究基础，具有实际价值和意义。

1 材料与方法 1.1 材料和培养基

落地生根(Bryophyllum pinnatum)采自华南农业大学校园内野生草丛。选用无氮培养基DN进行内生固氮菌的分离纯化^[8]。

DN培养基配方(g/L)：蔗糖10.0，苹果酸5.0，NaCl 0.1，K₂HPO₄·H₂O 0.1，KH₂PO₄·H₂O 0.4，MgSO₄·7H₂O 0.2，CaCl₂·H₂O 0.02，FeCl₃ 0.01，Na₂MoO₄·H₂O 0.002，pH 7.0。固体培养基加入20.0 g/L琼脂，半固体加入2.0 g/L琼脂。

King培养基配方(1 L)：蛋白胨20.0 g，K₂HPO₄ 1.725 g，丙三醇15.0 mL，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，色氨酸0.1 g，pH 7.2。比色液配方(50 mL)：0.5 mol/L FeCl₃ 1.0 mL，浓硫酸30.0 mL。

MSA-CAS培养基配方：向分开灭菌的1 L MSA基础培养基中分别加入50 mL磷酸缓冲液和50 mL CAS染液混匀。MSA基础培养基配方(g/L)：葡萄糖4.0，蛋白胨5.0，KCl 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，pH 7.0。磷酸缓冲液配方(100 g/mL)：NaH₂PO₄·2H₂O 0.590 5，Na₂HPO₄·12H₂O 2.427，NH₄Cl 0.250，KH₂PO₄·H₂O 0.075，NaCl 0.125。CAS染液配方(100 g/mL)：铬天青0.065 3，FeCl₃ 0.002 7，十六烷基三甲基溴化铵0.145 6。

PKO培养基配方(g/L)：葡萄糖10.0，(NH₄)₂SO₄ 0.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.1，MnSO₄·H₂O 0.03，FeSO₄ 0.03，Ca₃(PO₄)₂ 5.0，酵母粉0.5，琼脂20.0，pH 7.0。

钾长石培养基配方(g/L)：葡萄糖10.0，钾长石2.5，Na₂HPO₄ 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.2，NaCl 0.2，CaCO₃ 5.0，CaSO₄·7H₂O 0.1，琼脂20.0，pH 7.0。

1.2 主要试剂和仪器

Taq酶、DNA Marker、蛋白Marker，康润生物科技有限公司；3-吲哚乙酸，合肥博美生物公司；α-丁酮酸，天津市科密欧化学试剂有限公司。超净工作台，苏州净化设备有限公司；培养箱，上海一恒科技有限公司；气相色谱仪，北京北分天普仪器技术有限公司；PCR仪、凝胶成像系统，Bio-Rad公司；水平电泳槽、小型双垂直电泳槽，北京六一仪器厂；高速离心机，Thermo公司；核酸蛋白检测仪，EPP公司；可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；

1.3 菌株的分离纯化

将宿主植物的茎和叶分别剪成4 cm左右的小段，依次用75%酒精和0.1%升汞浸泡5 min和3 min，浸泡中用镊子搅拌。表面消毒后，无菌蒸馏水清洗7次，每次5 min。取最后一次洗涤蒸馏水涂于LB固体培养基作为对照，以确定宿主植物表面消毒是否彻底^[9]。把经过表面消毒的根、茎、叶小段两端各去掉1 cm，分别用无菌剪刀剪碎或者用无菌研钵捣碎，将植物组织碎块穿刺接种于半固体DN培养基中，28 ℃培养3 d后用乙炔还原法测定固氮酶活性，采用平板稀释涂布法和平板划线法对具有固氮酶活性的菌株进行分离，直到获得纯化菌株。

1.4 固氮活性测定

采用乙炔还原法进行固氮酶活性测定。在10 mm×100 mm试管中装入5 mL半固体无氮培养基，接种后反口胶塞密封。培养12 h后向小试管内注射1/10体积10%乙炔气体(使其终浓度为1%)，同样条件下再次培养24 h，从小试管内用1 mL一次性无菌注射器抽取0.5 mL气相样品注入SP-2100气相色谱仪的样品注入口，测定样品乙烯的峰面积。标准乙烯的浓度是508 μL/L。气相色谱的工作条件设置为：柱温70 ℃，进样口120 ℃，检测器温度180 ℃。气体流量分别为：氮气30 mL/L，氢气30 mL/L，干燥空气60 mL/L。按下式计算固氮酶活性^[10]，单位：μmol C₂H₄/(mL·h)。

nifH固氮基因扩增：正向引物Zehrf (5′-TGYGAY CCNAARGCNGA-3′)和反向引物Zehrr (5′-NDGC CATCATYTCNCC-3′)。D：A、G或T；N：A、C、G或T；Y：C或T；R：A或G^[11]。PCR反应体系(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，50 μmol/L Zehrf 0.5 μL，50 μmol/L Zehrr 0.5 μL，模板DNA (40 ng/μL) 0.5 μL，双蒸水20.0 μL。PCR反应条件：97 ℃ 3 min；97 ℃ 60 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 35 s，32个循环；72 ℃ 5 min。

1.5 菌株的聚类分析

1.5.1 SDS-PAGE全细胞蛋白电泳聚类

菌株全细胞可溶性蛋白提取参照谭志远等^[12]方法。采用DYCZ-24D双垂直电泳槽，聚丙烯酰胺凝胶(下层10%分离胶，上层5%浓缩胶)进行电泳，配方及具体操作参照参考文献[8]。

1.5.2 IS-PCR插入序列指纹图谱聚类

采用Insertion sequence-based PCR (IS-PCR)指纹图谱方法^[13]。参照毕江涛等^[14]方法，采用溶菌酶破壁提取细菌总DNA。选用单引物J3 (5′-GCTC AGGTCAGGTGGCCTGG-3′)进行PCR扩增，PCR反应体系(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，50 μmol/L J3 1.0 μL，模板DNA (40 ng/μL) 0.5 μL，双蒸水20.0 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。采用双垂直电泳槽，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳图谱聚类分析参照原红娟等^[15]方法。

1.6 16S rRNA基因系统发育分析

16S rRNA基因扩增：正向引物25f [5'-AACT (G/T)AAGAGTTTGATCCTGGCTC-3']和反向引物1492r [5'-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3']^[8]。PCR反应体系(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，50 μmol/L 25f 0.5 μL，50 μmol/L 1492r 0.5 μL，模板DNA (40 ng/μL) 0.5 μL，双蒸水20.0 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，32个循环；72 ℃ 5 min。扩增16S rRNA基因片段约为1 500 bp，将PCR产物交北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

16S rRNA基因序列拼接采用软件SeqMan完成。将测序结果在GenBank和EzBioCloud数据库中进行序列比对，寻找16S rRNA基因序列相似性最高的参比菌株，获得参比菌株的16S rRNA基因序列。通过MEGA 7.0软件采用邻接(Neighbor- Joining)法构建系统发育树。

1.7 菌株生理生化鉴定

采用10个常规理化指标检测：甲基红试验、乙酰甲基甲醇(V-P)试验、明胶液化、过氧化氢酶、吲哚试验、淀粉水解、硝酸盐还原、产氨试验、脲酶、纤维素酶。试验所用方法和试剂配方见《微生物学实验教程》^[16]。

1.8 菌株促生特性

分泌生长素能力测定采用SalKowski比色法。将供试菌株等量接种到装有King液体培养基试管中，28 ℃、120 r/min培养2 d。将菌株培养液在5 000 r/min离心3 min，取上清液1 mL加比色液1 mL在黑暗中静置30 min，在530 nm波长下测定吸光度，标准曲线采用3-IAA (3-吲哚乙酸)标准品制作。

产铁载体检测：将菌株接种至MSA-CAS液体培养基中，28 ℃、120 r/min振荡培养2 d。液体培养基从蓝色变为红色、橙黄色或紫色为阳性。

溶磷试验：将菌株接种至PKO培养基平板上，28 ℃培养3 d，菌落周围形成透明圈为阳性。

解钾试验：将菌株接种至钾长石培养基平板上，28 ℃培养3 d，菌落周围形成透明圈为阳性。

ACC脱氨酶活性测定^[17]采用2, 4-二硝基苯肼比色法，ACC脱氨酶活性计算公式：ACC脱氨酶。

2 结果与分析 2.1 内生固氮菌的分离

从落地生根的茎叶中共分离内生固氮菌26株，其中茎中分离到12株，叶中分离到14株。各菌株的分离来源和固氮酶活性详见表 1，这些菌株的固氮酶活性范围为3.25-45.97 μmol C₂H₄/(mL·h)，不同菌株的固氮酶活性差异大，筛选到一些固氮酶活性高的菌株。各类群代表菌株均能扩增出360 bp的nifH固氮基因，在DNA分子水平上验证了它们的固氮能力。L091的固氮酶活性最高，达到45.97 μmol C₂H₄/(mL·h)。

2.2 SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和IS-PCR插入序列指纹图谱聚类分析

将26株内生固氮菌进行SDS-PAGE全细胞蛋白电泳初步聚类分析，以便于菌株分类。图 1为每一类群同一群里的菌株的SDS-PAGE全细胞蛋白电泳图谱。从图 1可以看到，同一类群的菌株，其蛋白电泳带型基本一致，而不同类群的菌株蛋白电泳带型图各不相同。SDS-PAGE全细胞蛋白电泳带形图将26株菌聚为5个类群，分别为类群Ⅰ (L061、L062、L063、L064、L065、L066)，类群Ⅱ (L091、L092、L093、L094)，类群Ⅲ (L201、L202、L203、L204、L205、L206)，类群Ⅳ (L461、L462、L463、L464、L465、L466、L467)，类群Ⅴ (L504、L505、L506)。

通过IS-PCR指纹图谱分析，可以区分种类不同的细菌菌种，根据指纹图谱得到聚类树状图(图 2)，在大于90%的相似性水平上，可把该树状图分为5个类群(共26株)，聚类结果与SDS-PAGE全细胞蛋白电泳一致。

2.3 菌种鉴定

2.3.1 16S rRNA基因系统发育分析

根据SDS-PAGE全细胞蛋白电泳聚类、IS-PCR指纹图谱聚类结果，每个类群选取一株代表菌株进行16S rRNA基因序列测定和分析，在GenBank和EzBioCloud数据库中比对序列，获得相似性最高菌株。EzBioCloud数据库中的比对结果如表 2所示，16S rRNA基因系统发育树如图 3所示。类群Ⅰ与类芽孢杆菌(Paenibacillus stellifer DSM14472^T)相似性为99.65%；类群Ⅱ与巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense ATCC49958^T)相似性为99.47%；类群Ⅲ与类芽孢杆菌(Paenibacillus albidus Q4-3^T)相似性最高，为97.44%；类群Ⅳ与拜氏固氮菌(Azotobacter beijerinckii ATCC19360^T)相似性最高，为97.82%；类群Ⅴ为克雷伯氏菌亚种(Klebsiella quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae 01A030^T)，相似性为99.78%。依据国际细菌分类委员会的定义，类群Ⅲ和类群Ⅳ的16S rRNA基因序列与已知种的相似性在97%，可能为新种^[18]。

2.3.2 代表菌株生理生化鉴定

各个类群的代表菌株生理生化试验结果详见表 3，L061、L091和L504与其相似性最高的已知菌种生理生化特性一致^[19-21]，L201和L461与其相似性最高的已知菌种生理生化特性存在一定差异^[22-23]。

2.4 菌株促生特性

对各类群代表菌株分泌生长素和产铁载体的能力以及溶磷和解钾效果进行测定(表 4)。各类群代表菌株都有分泌生长素能力，且L091和L461分泌生长素能力最强，并能产生铁载体。L061同时具有溶磷解钾能力，L504是高效解钾菌，它们的解钾效果如图 4所示。L504还具有分泌ACC脱氨酶能力，ACC脱氨酶活性为2.86±0.36 μmol/(mg·h)。说明本研究从落叶生根中分离的内生固氮菌，是性状优良的促生菌，在以后的农业生产中具有潜在的应用价值。

3 讨论

目前国内外关于禾本科植物及作物的内生固氮菌已有较多报道，多肉植物落地生根的内生菌研究鲜有报到。本文从宿主植物落地生根中分离获得26株内生固氮菌，利用SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和IS-PCR插入序列指纹图谱，对内生菌进行聚类及其遗传多样性分析，将26株菌聚为5个类群。通过16S rRNA基因系统发育分析和生理生化指标测定，对内生菌各类群代表菌株进行初步鉴定，表明所分离的内生固氮菌属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、固氮螺菌属(Azospirillum)、固氮菌属(Azotobacter)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)等不同菌种，反映了多肉植物落地生根中内生固氮菌资源多样性高。固氮螺菌属和固氮菌属能在植物体内定殖，并广泛地应用于生物肥料^[24-25]。类芽孢杆菌属在野生稻^{[7, 26]}和水稻^[27]中的分离被报道。克雷伯氏菌属曾多次从野生稻、水稻、甘蔗、玉米等植物中获得^[28-30]。说明这些属和种在植物体内生长数量多，是内生固氮菌中的优势菌群。

落地生根采集自野外干旱贫瘠的土地，且生长状况良好，植株高大叶片为深绿色有光泽，相比周围的短小杂草，表现出强大的生命力。野生植物在土壤贫瘠环境下生长旺盛，其生态竞争力与内生菌的功能多样性息息相关。野生植物的优良性状与内生菌功能有着千丝万缕的联系，丰富的内生菌群落为野生植株的生长和自然选择提供有利的竞争力。内生菌能够系统地分布于植物组织内，并占据有利的生态位，有充足的碳源，受到植物组织的保护的同时，相比根际、叶际等外部环境微生物更容易发挥生物学功能^[28]。本试验内生菌具有固氮、分泌生长素、产铁载体、产ACC脱氨酶、溶磷和解钾等促生功能，固氮螺菌L091和固氮菌L461的固氮酶活性高，分泌生长素能力强。固氮螺菌和固氮菌的固氮能力强，常作为菌肥的应用菌种。王继雯等^[31]报道的巴西固氮螺菌R5的固氮酶活性为8.2 nmol C₂H₂/(mg protein·min)，本研究的巴西固氮螺菌L091具有更高的固氮酶活性为45.97 μmol C₂H₄/(mL·h)。克雷伯氏菌L504解钾能力强，解钾圈明显。郜晨等^[32]也研究报道过该菌具有解钾能力，说明它可分泌酸性物质，并向周围的培养基扩散，从而形成透明圈。郜晨等^[32]获得的克雷伯氏菌N32的固氮酶活性为180.40 nmol C₂H₄/(mL·h)，而本研究的克雷伯氏菌L504固氮酶活性更高，为3.51 μmol C₂H₄/(mL·h)。L061是类芽孢杆菌，首次发现于包装纸板中，作为新种报道^[19]，固氮酶活性为168 nmol C₂H₂/(mg protein·h)。该菌近年来研究较少，本文研究发现该菌具有固氮酶活性[8.59 μmol C₂H₄/(mL·h)]，分泌生长素能力，以及明显的溶磷解钾效果，该菌株在农业生产中具有一定的应用前景。L201和L461是新种资源^[33]。

4 结论

从野生宿主植物中分离获得的内生菌具有丰富的遗传和功能多样性，并且存在新的微生物资源，有待开发利用。本试验从多肉植物落地生根中分离纯化出26株内生固氮菌，聚为5个类群，具有遗传多样性。各类群的代表菌株经鉴定，L061和L201为类芽孢杆菌属，L091为固氮螺菌属，L461为固氮菌属，L504为克雷伯氏菌属。L201和L461是微生物新种，且各类群代表菌株具有固氮、分泌生长素、产铁载体、产ACC脱氨酶、溶磷和解钾等促生特性，为微生物肥料生产和应用提供了菌种资源和理论基础。