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文章信息
- 胡建颖, 吴佳婧, 王昕怡, 黄婕, 孙倩, 胡露露, 易正芳, 常忠义, 高红亮, 牛延宁
- HU Jian-Ying, WU Jia-Jing, WANG Xin-Yi, HUANG Jie, SUN Qian, HU Lu-Lu, YI Zheng-Fang, CHANG Zhong-Yi, GAO Hong-Liang, NIU Yan-Ning
- 产纤维素菌株的分离鉴定及产量相关性
- Isolation, identification and yield correlation of cellulose-producing strains
- 微生物学通报, 2019, 46(1): 93-102
- Microbiology China, 2019, 46(1): 93-102
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180416
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文章历史
- 收稿日期: 2018-05-28
- 接受日期: 2018-09-04
- 网络首发日期: 2018-09-15
细菌纤维素(Bacterial cellulose)是由细菌合成的水不溶性胞外多糖,它由葡萄糖分子以β-1, 4-糖苷键聚合而形成线性长链,这些葡萄糖链通过分子内和分子间的氢键形成网状结构。植物源纤维素由于被木质素、半纤维素等杂质包裹,生产纯的纤维素过程较为复杂。而细菌纤维素则多以纯纤维素的形式存在,纤维素直径在几纳米到几十纳米之间[1],在结晶度、化学纯度、抗张强度、弹性模量、吸水性和生物相容性等方面均优于植物纤维素,被认为是一种性能优异的新型天然生物纳米材料[2-4]。
近年来,细菌纤维素的研究成为微生物合成材料领域的热点之一,并在生物医药、组织工程支架材料、声学器材、食品、化妆品、造纸等领域的应用展现出巨大的潜力[5-7]。然而,由于目前发酵产量普遍低、生产成本高,细菌纤维素尚未得到大规模生产与应用。为了得到更高产纤维素的菌株,从源头降低生产成本,从自然界中获得纤维素产量高、遗传代谢稳定的菌株是一个行之有效的方法。
从自然界的腐烂水果中容易富集到产纤维素的菌株[8]。Toyosaki等[9]收集了547份不同来源的样品,分离到2 096株产纤维素的菌株,其中水果中筛选效率最高。Park等[10]从腐烂的苹果中分离到一株产纤维素的菌株Gluconacetobacter hansenii。Son等[11]从水果和醋中分离到了57株产纤维素菌株。本研究以腐烂水果作为实验材料,筛选得到134株产纤维素菌株,大大丰富了菌种资源库。
在自然选育过程中,菌落形态和水果来源与产纤维素的关系还未见详细报道。本文从不同种类的腐烂水果中自然选育纤维素生产菌株,并根据菌落形态进行分类,尝试找出菌落形态与纤维素产量的关系并对不同腐烂水果来源的菌株进行产量分析,以期找到更容易获得高产纤维素菌株的菌落形态和腐烂水果源,为今后的筛菌工作提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料腐烂水果:苹果、梨、芒果、葡萄等,上海市闵行区水果市场;对照菌株木驹形杆菌(Komagataeibacter xylinum) BCC529,本实验室保藏;细菌基因组提取试剂盒,天根生化科技有限公司;PCR所用试剂,宝生物工程(大连)有限公司;引物,金斯瑞生物技术有限公司。
1.1.2 培养基(1) HS富集培养基(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨5.0,酵母粉5.0,磷酸氢二钠2.7,柠檬酸1.15;用乙酸调节pH为4.0;0.1 MPa灭菌20 min后加入无水乙醇使其终浓度为3%。
(2) HS琼脂培养基(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨5.0,酵母粉5.0,磷酸氢二钠2.7,柠檬酸1.15,琼脂18.0;用乙酸调节pH为6.0;0.1 MPa灭菌20 min。
(3) HS斜面培养基(g/L):葡萄糖100.0,酵母粉10.0,碳酸钙20.0,琼脂18.0;用乙酸调节pH为6.8;0.1 MPa灭菌20 min。
(4) 种子培养基(g/L):葡萄糖20.0,玉米浆10.0,蛋白胨5.0,酵母粉5.0,磷酸氢二钠2.7,柠檬酸1.15;用乙酸调节pH为6.0;0.1 MPa灭菌20 min。
(5) 发酵培养基(g/L):葡萄糖40.0,蛋白胨5.0,酵母粉5.0,磷酸氢二钠2.7,柠檬酸1.15;用乙酸调节pH为6.0;0.1 MPa灭菌20 min。
1.1.3 主要仪器洁净工作台,北京东联哈尔仪器制造有限公司;冷冻离心机,日立公司;PCR仪,艾本德公司;精密电子天平、精密pH计,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
1.2 实验方法 1.2.1 富集培养[12-13]取果实的腐烂部分约1 g,接入装有10 mL HS富集培养基的试管中,30 ℃静置培养5 d,管内液面上长有乳白色胶质薄膜个体为阳性。
1.2.2 菌株筛选与纯化[12-14]取阳性个体膜片,剪碎并置于装有10 mL HS富集培养基的试管中浸泡24 h,取浸提液经梯度稀释后涂布平板,培养5 d,挑取不同菌落形态单菌落接入装有2 mL富集培养基的小试管中培养5 d,有白色胶质薄膜出现的个体即为产纤维素细菌,扩大培养保存菌种。
1.2.3 静态培养[14-16]产纤维素细菌活化后,取一环活化菌液进行平板三区划线,于30 ℃培养5 d,待长出单菌落后记录菌落形态,挑取5个单菌落于装有15 mL发酵培养基的离心管中,透气封口膜封口,30 ℃培养9 d,每组4个平行。
1.2.4 产量测定[13, 17]静置培养结束取出纤维素膜,用清水浸泡,9 000 r/min离心10 min,冲洗2次,除去膜表面培养基及杂质。用1%的NaOH溶液浸泡,100 ℃加热20 min,9 000 r/min离心10 min,弃上清,再加入1%的NaOH溶液,重复此步骤至纤维素膜呈透明或白色,去除液膜中的菌体和残留的培养基;再用与碱溶液等体积的0.5%乙酸浸泡5 min后,9 000 r/min离心10 min,弃上清;水洗离心2-3次至中性。将纤维素膜放在80 ℃的烘箱中烘干24 h,称重。
1.2.5 种属鉴定用细菌基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA。所用引物为27F (5′-GAGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3′)。PCR反应体系(50 μL):2×Mix 25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 19 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,循环30次;72 ℃ 10 min。PCR扩增产物提交上海美吉生物医药科技有限公司测序,将测定序列于NCBI核糖体DNA数据库中进行比对分析。
2 结果与分析 2.1 菌株在HS分离纯化平板上的菌落形态分类从15种腐烂水果(576份)中分离筛选得到134株产细菌纤维素菌株。按照所得菌株在HS琼脂培养基上生长的菌落形态,包括颜色、形状、粗糙与光滑程度等分为10个类别(图 1和表 1)。其中,形态5、6、7、8对应的菌株在培养期内存在形态变化,培养5 d如图 1中5A、6A、7A和8A所示,培养到7 d如图 1中5B、6B、7B和8B所示。
类型 Type |
HS形态描述 HS morphology description |
1 | 粉色、圆形、边缘整齐、表面粗糙、中间凸起、中间色深 Pink, circular, regular edge, rough surface, middle raised, middle color is darker |
2 | 淡黄色、形状不规则、表面粗糙、凸起 Canary yellow, irregular shape, rough surface, raised |
3 | 乳白色、圆形、边缘整齐、表面光滑、中间凸起 Milk white, circular, regular edge, smooth surface, middle raised |
4 | 黄色、圆形、边缘整齐、表面粗糙、凸起 Yellow, circular, regular edge, rough surface, raised |
5 | 黄色、圆形,A:表面粗糙、凸起,边缘不规则;B:表面光滑、中间凸起,边缘锯齿 Yellow, circular, A: Rough surface, raised, irregular edge; B: Smooth surface, middle raised, zigzag edge |
6 | 乳白色、圆形、边缘不规则,A:表面褶皱、凸起;B:表面光滑、中间凸起 Milk white, circular, irregular edge, A: Wrinkled surface, raised; B: Smooth surface, middle raised |
7 | 黄色、圆形、边缘整齐、表面光滑,A:凸起,顶部环状凹陷;B:中间凸起 Yellow, circular, regular edge, smooth surface, A: Raised, annular depression in the top; B: Middle raised |
8 | 乳白色、形状不规则,表面光滑、凸起,A:边缘不规则、六瓣花朵状;B:边缘不规则、球状凸起 Milk white, irregular shape, smooth surface, raised, A: Irregular edge, six-petals’ shape; B: Irregular edge, spheroidal raised |
9 | 黄色、圆形、边缘不规则、表面有褶皱、凸起 Yellow, circular, irregular edge, wrinkled surface, raised |
10 | 黄色、圆形、边缘放射状、表面粗糙、中间凸起 Yellow, circular, radial edge, rough surface, middle raised |
不同形态的菌株与其产量之间的关系见图 2。木驹形杆菌BCC529是本实验室保存的一株产纤维素菌株,产量达到4.89 g/L。本文将纤维素相对产量大于100%划分为高产;50%-100%划分为中产,低于50%为低产。形态4、5和9是高产纤维素菌株较多的类别,在这几个形态组中超过一半菌株的相对产量高于100%;形态1和8属于低产形态,菌株相对产量全部低于100%;形态2、3、6、7和10是中产形态,组中有且仅有个别相对产量高于100%的菌株。因此,在筛菌过程中应尽量避免形态1和8的菌株,高产趋向选择形态4、5和9的菌株。当然,影响菌落形态的因素很多,如培养时间、培养基成分和培养条件等。上述菌落形态和产量的对应关系是在本文的实验条件下得出的,因此对高产纤维素菌株筛选的借鉴意义有一定的局限性。
按上述定义对这10种形态的菌株进行分类,每种形态对应的高产、中产及低产纤维素菌株的数量见图 3。其中,高产形态(形态4、5、9)与中产、低产形态之间存在显著性差异,并且在中产形态与低产形态之间也存在显著性差异。形态4、5和9组内菌株中高产纤维素菌株所占比率分别为66.67%、59.26%和71.42%。在形态4、5、9之间,形态9高产纤维素菌占比例最大,是自然选育菌株时的最优形态,其菌落形态为黄色、圆形、边缘不规则、表面有褶皱、凸起。其次,形态5对应的高产纤维素菌株数量最多,显著高于其他任何一个形态的高产纤维素菌株数量。如若从高产纤维素菌株的样本容量考虑,提高高产纤维素菌株的筛选数量,则可以考虑选择在形态5中占比例最大的水果种类。
2.3 菌株形态在不同水果中的分布情况10个菌株形态在15种腐烂水果中的分布情况见图 4。从水果种类、菌株形态以及产量相关性来看,苹果和梨来源的菌株形态丰富,包含了高产(形态4、5、9)、中产(形态2、6、7、10),没有低产形态;蜜瓜、杏、橘子、香蕉和芒果来源的菌株也没有低产形态,其中蜜瓜和杏中产形态(形态3、6、10)占多数,橘子、香蕉和芒果高产形态(形态4、5、9)占多数。美人指和毛桃来源的菌株形态虽不及苹果和梨来源的丰富,但包含了高产(形态5、9)、中产(形态3、6)和低产(形态8)的形态,而且3类形态的菌株分布较均匀;桂圆、冬枣、圣女果、红提、葡萄和油桃来源的菌株多数是低产形态(形态1和8),剩余部分涵盖在中产形态中(形态2、3、6)。
形态5对应的高产纤维素菌株数量最多(图 3),筛选来源有6种水果,芒果筛出的菌种数量最多,占总比44.44%,梨和苹果筛出数量次之。因此,进行产纤维素细菌的自然选育时,选择从芒果、梨和苹果中富集分离,会有更高的概率筛得高产纤维素菌株。
对筛选所得菌株进行静置培养,其中有30株菌的相对产量大于100%,即有30株高产纤维素菌株(图 2)。建立高产纤维素菌株和其水果来源的关系(图 5),结果发现:芒果来源的高产纤维素菌株在所有高产纤维素菌株中所占的比例最大,高达46.67%;其次是梨和苹果,占比例分别为23.33%和16.67%。
本研究获得的最高产纤维素的菌株是一株分离自芒果的汉氏驹形杆菌(K. hansenii),产量为11.24 g/L,高于文献[18-19]报道的菌株。
2.4 16S rRNA基因序列鉴定分析结果对这134株产纤维素菌株的16S rRNA基因序列进行测序,根据测序结果比对分析得到5个属13个种(表 2),包括醋酸杆菌属(Acetobacter)、驹形杆菌属(Komagataeibacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)。汉氏驹形杆菌(K. hansenii)的数量最多,而且对应的水果种类也最多。温驯驹形杆菌(K. oboediens)、中间驹形杆菌(K. intermedius)、蔗糖驹形杆菌(K. sucrofermentans)以及热带醋酸杆菌(A. tropicalis)对应的菌株数量和水果种类也较丰富。对30株高产菌株的种属进行分析,其中25株属于汉氏驹形杆菌(K. hansenii),5株属于中间驹形杆菌(K. intermedius)。
已鉴定菌种 Identified strains |
分离株数/高产株数 Number of isolates/High yield strains |
水果种类 Fruit species |
K. hansenii | 58/25 | 10 |
K. oboediens | 26/0 | 4 |
K. intermedius | 20/5 | 8 |
K. sucrofermentans | 9/0 | 5 |
K. swingsii | 3/0 | 2 |
K. europaeus | 2/0 | 1 |
K. maltaceti | 2/0 | 1 |
A. tropicalis | 7/0 | 4 |
A. ghanensis | 2/0 | 1 |
A. malorum | 1/0 | 1 |
G. entanii | 2/0 | 1 |
S. odorifera | 1/0 | 1 |
L. nagelii | 1/0 | 1 |
不同种类的水果来源与分离所得菌株种属关系如表 3所示。圣女果中分离所得菌株种属类别最为丰富,其中欧洲驹形杆菌(K. europaeus)、麦芽醋驹形杆菌(K. maltaceti)、圆谷葡糖醋杆菌(G. entanii)只在圣女果中分离得到。其次是冬枣和苹果中分离所得菌株种属类别较丰富,其中加纳醋酸杆菌(A. ghanensis)和气味沙雷氏菌(S. odorifera)有且只在冬枣来源中分离得到;而腐烂苹果醋酸杆菌(A. malorum)也只在苹果中分离得到。值得一提的是,一株分离自红提的菌株经鉴定后发现与少见的黑麦乳杆菌(L. nagelii)一致性达到99%。通过以上这些不常见的产纤维素细菌种属,体现了所筛得产纤维素菌株的多样性十分丰富。
水果 Fruits |
菌种 Strains |
分离株数 Number of isolates |
芒果Mango | K. hansenii | 16 |
A. tropicalis | 2 | |
冬枣Jujube | K. oboediens | 13 |
K. sucrofermentans | 4 | |
K. intermedius | 2 | |
A. tropicalis | 2 | |
A. ghanensis | 2 | |
S. odorifera | 1 | |
梨Pear | K. hansenii | 17 |
A. tropicalis | 1 | |
香蕉Banana | K. intermedius | 1 |
K. hansenii | 1 | |
橘子Orange | K. hansenii | 3 |
油桃Nectarine | K. oboediens | 3 |
K. hansenii | 2 | |
K. sucrofermentans | 1 | |
毛桃Peach | K. hansenii | 2 |
K. sucrofermentans | 1 | |
杏Apricot | K. intermedius | 7 |
美人指Manicure finger | K. intermedius | 4 |
圣女果Cherry tomato | K. oboediens | 4 |
K.intermedius | 2 | |
K. europaeus | 2 | |
K. swingsii | 2 | |
K. maltaceti | 2 | |
K. sucrofermentans | 1 | |
G. entanii | 2 | |
葡萄Grape | K. hansenii | 2 |
K. intermedius | 1 | |
苹果Apple | K. hansenii | 11 |
K. intermedius | 2 | |
K. swingsii | 1 | |
A. tropicalis | 2 | |
A. malorum | 1 | |
红提Red grape | K. oboediens | 6 |
K. sucrofermentans | 2 | |
L. nagelii | 1 | |
桂圆Longan | K. hansenii | 1 |
K. intermedius | 1 | |
蜜瓜Melon | K. hansenii | 3 |
细菌纤维素作为一种具有广泛用途的生物纳米材料,具有很好的商业前景,但由于其生产效率低、成本较高,极大地限制了它的工业化推广应用。因此,相关研究人员一直在致力于提高细菌纤维素的产量,其中选育高产纤维素菌株[18-19]、开展发酵条件优化[20]、改进发酵方式[21-22]等都是非常活跃的研究方向。
腐烂水果是细菌纤维素产生菌的良好来源,Toyosaki等[9]收集了547份不同来源的样品,包括353份水果、28份坚果、124份糖蜜、36份花和6份土壤,一共分离了2 096株产纤维素的菌株,其中水果中筛选效率最高,筛选率达到31.7%,而土壤中则完全没有筛到。Son等[23]从75份材料中分离到8株产纤维素的细菌,其中从腐烂苹果中分离到1株,从腐烂梨中分离到1株,从腐烂葡萄中分离到2株,从醋中分离到4株,从土壤中没有分离到。曹海鹏等[24]从40多种残次水果、酸菜、咸菜、酸米酒糟及醋和酱油等原料中筛选产细菌纤维素菌株,仅从青李中分离到产细菌纤维素菌株。朱宏阳等[25]采集的50份土壤和水果样品中,仅3份采集于残次水果中产生了纤维素。刘娅等[26]以土壤、残次野苹果、散醪糟、泡菜、残次蟠桃、杏和瓶装醋等为材料,仅从杏中分离出一株产纤维素的菌株APR72。因此目前的筛选效率较低。本文以腐烂水果作为实验材料,首先列出了高产纤维素菌株可能的菌落特征,并进一步尝试分析高产纤维素菌株和腐烂水果来源的相关性,结果表明芒果来源的高产纤维素菌株在所有高产纤维素菌株中占比最大,高达46.67%。其次是梨和苹果,占比分别为23.33%和16.67%。分析所得菌株产量与菌落形态、水果来源之间的关系可以为今后纤维素生产菌株的筛选工作提供参考,进而提高筛选效率。当然,菌株形态、水果来源和纤维素合成能力之间只是可能存在某种关联,而不能过于绝对,因此对高产纤维素菌株筛选的借鉴意义有一定的局限性。
自然选育的菌株产量一般都不高。如Hungund等[27]从腐烂苹果中分离到一株产纤维素菌株Enterobacter amnigenus GH-1,产量为4.1 g/L。Rani等[28]从腐败的葡萄酒中筛选出一株Gluconacetobacter hansenii UAC09,产量为1.5 g/L。Kim等[29]从传统的发酵醋工业中分离到一株Gluconacetobacter sp. RKY5,并对它的发酵培养基进行优化,产量为4.59 g/L。Nguyen等[30]从红茶菌中分离出一株Gluconacetobacter xylinus,分析其产纤维素的特性,并比较了红茶和绿茶对该菌株发酵产纤维素量的影响,产量最高为3.34 g/L。本研究获得的最高产量纤维素菌株是一株分离自芒果的汉氏驹形杆菌(K. hansenii),产量为11.24 g/L,高于文献[18-19]报道的菌株,该菌株有一定的工业化应用前景。
许多微生物被报道能产细菌纤维素,主要涉及醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、无色杆菌属(Achromobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)等17个属[31-33]。其中,关于醋杆菌属和葡糖醋杆菌属的报道较多。刘娅等[26]以某些常见食品及新疆7月份盛产的水果为原料,经静态培养和反复筛选,从杏中分离出了一株纤维素生产能力强、产量稳定的菌株,初步鉴定为醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)。咸赫等[34]通过初步活化和分步富集的方法获得细菌纤维素生产菌株,经过16S rRNA基因序列及形态学鉴定后,确定为木葡糖酸醋杆菌,命名为G. xylinus 5-2。近年来,随着产纤维素菌株的研究不断深入,种属之间不断地进行重新分类。驹形氏杆菌属(Komagataeibacter)是从葡糖醋杆菌属中划分出来的一个新的属[35],同样地,醋杆菌属中的某些类别也被分类于葡糖醋杆菌属和驹形氏杆菌属。目前,驹形氏杆菌属的报道最多也最深入[35-36],已报道该属中有纤维素合成能力的菌种共有14个[37],如K. xylinus、K. hansenii、K. europaeus、K. swingsii、K. nataicola、K. rhaeticus等[38-39]。本研究获得的134株菌涵盖5个属13个种,其中驹形杆菌属的菌株最多。同时,还筛选得到了文献中极少报道的产纤维素细菌,如气味沙雷氏菌(S. odorifera)、腐烂苹果醋酸杆菌(A. malorum)和黑麦乳杆菌(L. nagelii),这表明所筛菌株的多样性十分丰富。这些菌株丰富了我国的菌种资源,并为细菌纤维素的大规模生产提供了新的原始菌种。
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