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文章信息
- 于欣水, 曾钰, 李洁, 张明明, 白凤武, 赵心清
- YU Xin-Shui, ZENG Yu, LI Jie, ZHANG Ming-Ming, BAI Feng-Wu, ZHAO Xin-Qing
- MHF组蛋白折叠复合体组分编码基因MHF1过表达对重组酿酒酵母纤维素酶生产的影响
- Effects of overexpression of the MHF histone fold complex component encoding gene MHF1 on production of cellulase by the recombinant Saccharomyces cerevisiae
- 微生物学通报, 2019, 46(1): 75-83
- Microbiology China, 2019, 46(1): 75-83
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180204
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文章历史
- 收稿日期: 2018-03-16
- 接受日期: 2018-04-17
- 网络首发日期: 2018-06-05
2. 上海交通大学生命科学技术学院 上海 200240
2. School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有生长速度快、易于培养、可进行蛋白翻译后修饰和可将蛋白分泌到培养基等优势,其作为异源表达宿主在药用蛋白、工业酶等高附加值异源蛋白生产应用中的研究受到普遍关注[1-2]。然而,由于酿酒酵母蛋白分泌水平较低,限制了实际应用[3]。为了提高酿酒酵母异源蛋白生产水平,目前所采用的策略主要包括两大类,一是提高异源蛋白表达量,二是增强异源蛋白分泌途径。提高异源蛋白表达量可通过筛选合适来源的基因、优化异源蛋白密码子、提高基因拷贝数等方式实现[1]。异源蛋白的分泌包括蛋白的翻译后修饰、蛋白转运、内质网折叠和囊泡运输过程。对分泌途径各环节的关键基因进行过表达或敲除可以提高蛋白的分泌效率[1-2],包括优化信号肽序列[4]、激活未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)[5]、过表达蛋白质折叠相关的二硫键异构酶Pdi1p等[2]。但目前对酿酒酵母分泌生产异源蛋白的调控机制了解相对较少。
酿酒酵母异源蛋白生产导致的底物竞争会直接影响胞内的相关代谢过程,或者间接地影响其他代谢过程。因此,代谢网络的全局平衡调控可以有效提高异源蛋白的生产。例如,紫外诱变获得的α-淀粉酶高分泌菌株在全基因组转录水平的分析表明,通过改变能量代谢结构、平衡氨基酸生物合成和减弱硫胺素合成等手段可提高蛋白分泌性能[6]。异源蛋白的大量合成和折叠分泌等可能对细胞代谢造成一定负担,产生代谢胁迫。南非学者的研究表明,超氧化物歧化酶基因SOD1过表达可提高重组酿酒酵母纤维素酶的生产[7]。此外,有研究显示,与细胞胁迫相关的热激响应(Heat shock response,HSR)的激活能够提高酿酒酵母异源α-淀粉酶的生产[8]。因此,研究与环境胁迫响应相关基因对蛋白分泌的影响,有利于从全局水平提高异源蛋白生产效率。但目前通过调控全局代谢网络来提高重组酵母分泌蛋白生产的研究还很少。对影响酿酒酵母蛋白生产的新基因进行挖掘,不仅有利于发现异源蛋白生产的调控机理,还有助于开发更有效的策略提高异源蛋白的分泌生产。
在酿酒酵母中,MHF组蛋白折叠复合体组分Mhf1p与FANCM直系同源物在相同的途径中发挥作用,修复由DNA损伤剂甲磺酸甲酯(MMS)引起的DNA损伤,并在阻断的复制叉中促进基因转换,保护基因组的完整性[9]。此外,其与Mhf2p形成一个类似组蛋白(H3-H4)2异四聚体结构的MHF复合物,这种四聚体的结构在发挥生物学功能中扮演着十分重要的作用[10]。MHF1编码产物维护基因组完整性表明其对细胞全局代谢具有一定调控作用,有可能对重组酵母蛋白生产也有一定影响。研究MHF1过表达对重组酵母异源蛋白生产的影响,并进一步探讨其提高产酶的分子机理,可为深入研究酿酒酵母异源蛋白表达的调控机理和提高异源蛋白产量提供借鉴。
1 材料与方法 1.1 菌种和培养基实验中使用的酿酒酵母菌株及来源见表 1。重组酿酒酵母出发菌株Y294-CBH1、Y294-EG2和Y294-BGL1分别为过表达埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)来源的外切纤维素酶CBH1、里氏木霉(Trichoderma reesei)来源的内切纤维素酶EG2和扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)来源β-葡萄糖苷酶BGL1的酿酒酵母Y294菌株,由南非西开普敦大学Riaan den Haan博士提供。
Yeast strains and plasmids | Description | Source |
Saccharomyces cerevisiae strains | ||
S288C | Model organism | Laboratory preserve |
Y294-CBH1 | CBH1 (T. emersonii CBH1) producing parental strain | From Dr. Riaan den Haan |
Y294-EG2 | EG2 (T. reesei EG2) producing parental strain | From Dr. Riaan den Haan |
Y294-BGL1 | BGL1 (S. fibuligera BGL1) producing parental strain | From Dr. Riaan den Haan |
YCMHF1 | Y294-CBH1 overexpressing MHF1 | This study |
YEMHF1 | Y294-EG2 overexpressing MHF1 | This study |
YBMHF1 | Y294-BGL1 overexpressing MHF1 | This study |
Plasmids | ||
Cas9-NAT | Nourseothyrcin, expression of Cas9 | [11] |
pRS42h_gRNA_20 | Hygromycin B, expression of gRNA in YPRCdelta 15 | [12] |
pHO | G418, integrating vector | [13] |
HPC-MHF1 | G418, overexpression of MHF1 | This study |
培养大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α使用LB液体培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母浸粉5.0,氯化钠10.0,LB固体培养基在液体培养基基础上添加20.0 g/L琼脂粉。活化酿酒酵母和进行酶活性评价使用YPD培养基(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨20.0,酵母浸粉10.0,YPD固体培养基在此基础上添加20.0 g/L琼脂粉。以上培养基均在1×105 Pa灭菌15 min。
1.2 主要试剂和仪器蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉、潮霉素B、磷酸盐缓冲液(PBS)、柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;葡萄糖、Na2CO3、柠檬酸钠、柠檬酸、异丙醇、冰醋酸、乙醇,国药集团;Xma Ⅰ、Pac Ⅰ限制性内切酶、糖苷内切酶-H (Endoglycosase H,Endo-H),New England Biolabs公司;T4 DNA连接酶、反转录试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司;诺尔丝菌素,上海前尘生物科技有限公司;4-硝基苯基-β-D-纤维二糖(4-Nitrophenyl-β-D-cellobioside,pNPC),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG)、羟甲基纤维素钠(CMCNa),Sigma公司;iQTM SYBR® Green试剂盒,Bio-Rad公司;活性氧检测试剂盒,碧云天生物技术研究所。
恒温培养箱,上海一恒科技有限公司;振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司;离心机,Eppendorf公司;PCR Thermal Cycler,Bio-Rad公司;电泳仪,北京六一仪器厂;立式压力蒸汽灭菌锅,上海博讯实业有限公司;凝胶成像仪,ProteinSimple公司。
1.3 重组菌株构建构建酿酒酵母MHF1过表达载体HPC-MHF1:从模式酿酒酵母菌株S288C的基因组中扩增得到MHF1基因片段,再通过Xma Ⅰ和Pac Ⅰ限制性内切酶对pHO表达载体[13]进行酶切,然后采用T4 DNA连接酶将MHF1基因片段与酶切的pHO表达载体[13]连接,选取经PCR验证大小正确且送公司测序后无突变的过表达载体用于后续实验。以质粒HPC-MHF1为模板,用引物20_Ppgk1-F和20_Tcyc1-R[12]扩增得到用于同源重组的线性化片段,整合位点选用酿酒酵母S288C第XVI染色体上的YPRCdelta 15[14]。利用醋酸锂转化法[15]将Cas9表达载体Cas9-NAT转入酿酒酵母Y294-CBH1、Y294-EG2和Y294-BGL1后,用100 mg/L诺尔丝菌素筛选得到转化子。再将YPRCdelta 15位点的gRNA表达载体pRS42h_ gRNA_20和含有MHF1基因的PCR产物以相同的转化方法转入含有Cas9表达载体的转化子中;用100 mg/L诺尔丝菌素和300 mg/L潮霉素B筛选转化子。从Y294-CBH1、Y294-EG2和Y294-BGL1这3个宿主的转化子中各随机挑选3个单克隆转化子分别命名为YCMHF1、YEMHF1和YBMHF1,提取基因组分别用Ppgk1-F (5′-AGGCATTTGCAA GAATTACTCGTG-3′)和MHF1-R (5′-CCTTAATTAATTATTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGG-3′)、MHF1-F (5′-TCCCCCCGGGATGAATGACG ATGAAGATAG-3′)和Tcyc1-R (5′-GCAAATTAAA GCCTTCGAGC-3′)两对验证引物通过PCR扩增转化元件并测序,验证获得正确的转化子。将获得的转化子在无抗性YPD液体培养基中连续转接5次(每18-24 h转接一次),丢失Cas9和gRNA的游离表达载体[11]。采用实时定量PCR检测转化子中MHF1基因的表达量,进一步验证获得转化子的准确性。
1.4 菌株酶活性评价经二次活化后的酿酒酵母菌株接种于含100 mL YPD培养基的250 mL锥形瓶中,30 ℃、150 r/min培养过夜至对数期,4 ℃、3 000 r/min离心3 min收集菌体,以初始OD600为1.0接种于100 mL YPD培养基中,于30 ℃、150 r/min培养,每组实验设3个重复。每隔24 h取1 mL发酵液,稀释至OD600在0.2-0.8之间时测定OD600。随后将剩余菌液6 000 r/min离心5 min,上清4 ℃保存用于后续酶活性测定。
酶活性测定方法:CBH酶活性测定以pNPC为反应底物,用0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 5.0)将发酵液上清稀释10倍后,加入10 mmol/L pNPC,在50 ℃水浴锅中反应60 min后,加入10% Na2CO3终止反应,充分混匀后在405 nm下测定光吸收值。用0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 5.0)配制0.02 g/L pNP (p-Nitrophenyl)溶液并梯度稀释(具体稀释浓度为0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012、0.015、0.018、0.02 g/L),根据其在405 nm下的吸光值绘制标准曲线。将测得的样品吸光值根据标准曲线换算,得到相应的酶活性。酶活性单位定义为每分钟生成1 μmol pNP所需的酶量。BGL1酶活性测定方法与CBH1相似,只是将水解底物替换为pNPG。EG2酶活性测定以2% CMCNa为水解底物,将10 μL的酶液与90 μL 2%的CMCNa混合后于50 ℃水浴30 min,加入150 μL DNS煮沸10 min后,再加入750 μL ddH2O,混匀后测定OD540,酶活性单位定义为每分钟生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。发酵液上清的酶活性以每克细胞干重计量。
细胞干重测定方法:菌株30 ℃、150 r/min培养过夜,待菌液长至对数期后室温6 000 r/min离心5 min收集适量的菌体细胞。ddH2O洗菌体2次,再用ddH2O重悬细胞至不同浓度并测定OD600。分别取12 mL细胞悬液,室温6 000 r/min离心5 min去除上清,于50 ℃烘干至恒重称重。根据得到的数据绘制相应OD600-干重标准曲线。
1.5 SDS-PAGE分析经YPD在30 ℃、150 r/min培养96 h后,取2 mL发酵液上清即粗酶液,冷冻干燥浓缩处理24 h,加200 μL ddH2O溶解,取20 μL浓缩酶液分别添加或不添加Endo-H在37 ℃反应1 h后,用5%浓缩胶和10%分离胶进行SDS-PAGE。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色液[考马斯亮蓝R-250 0.1% (质量体积比),异丙醇25% (体积比),冰醋酸10% (体积比)]染色,经脱色液[冰醋酸10% (体积比),乙醇5% (体积比)]脱色完全后,观察条带并用凝胶成像仪拍照,获得的胶图采用ImageJ软件进行灰度分析。
1.6 RNA提取及实时定量PCR (Real-time PCR)分析分别在24 h和48 h取4 mL发酵液,10 000 r/min离心2 min收集菌体,ddH2O洗2遍后液氮冻存于-80 ℃用于RNA提取。采用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒提取酵母菌株RNA,用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA后,再用iQTM SYBR® Green试剂盒进行Real-time PCR反应,以ALG9为内参基因,以2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量[16]。实验中使用的实时定量引物见表 2。统计分析采用t检验法,P < 0.05为差异有统计学意义。
Genes name | Primers name | Primers sequence (5′→3′) |
ALG9 | RT-ALG9-F | ATCGTGAAATTGCAGGCAGCTTGG |
RT-ALG9-R | CATGGCAACGGCAGAAGGCAATAA | |
MHF1 | RT-MHF1-F | CTGTGGATCCGTGTGGAAGA |
RT-MHF1-R | TCGCTCTTATTGACCACACCTC | |
CBH1 | RT-CBH1-F | GTCCACGACGTCAACGGTTA |
RT-CBH1-R | CGTAGTCAGCACCGTCCAAG | |
SSO2 | RT-SSO2-F | CGAAGACGCTCAGCAAGATG |
RT-SSO2-R | CAACCACAACGACAACAACAATAG | |
SEC22 | RT-SEC22-F | CCAAGCCTACCGTAAGACCA |
RT-SEC22-R | TTGCTTGACACCTACAAGCTCT | |
YPT32 | RT-YPT32-F | GCCATCACGTCTGCGTACTA |
RT-YPT32-R | CACGTTGTCATCTGCGTTCT | |
ERV29 | RT-ERV29-F | ATCTGAATAAGTGGAAGCATTACC |
RT-ERV29-R | GAGAAATAACGCAAGCACATAAC |
分别在24、48、72和96 h取OD600约为1.0的发酵液,室温条件下3 000 r/min离心3 min收集菌体,用1 mol/L的PBS洗涤细胞2次后,采用活性氧检测试剂盒检测细胞胞内活性氧的水平。
2 结果与分析 2.1 MHF1过表达转化子验证及其对重组酵母菌株酶活性的影响提取转化子基因组DNA验证MHF1的整合,PCR产物电泳和测序结果显示,挑取的所有转化子均正确。实时定量分析结果显示,MHF1在3个产酶菌株中表达都上调,24 h和48 h转录水平都为对照菌株的5-40倍,说明MHF1过表达转化子构建成功。
选取正确的转化子进行后续酶活性评价,如图 1A所示,MHF1过表达突变体的生长与出发菌株基本一致,在异源表达EG2和BGL1的菌株中过表达MHF1同样不影响宿主菌株的生长。与对照菌株相比,YCMHF1菌株纤维二糖水解酶CBH的活性显著高于出发菌株,发酵96 h时的酶活性是出发菌株的1.38倍(图 1B)。然而,MHF1过表达对内切酶和β-葡萄糖苷酶酶活性的影响有限(图 1C、D),表明不同蛋白合成和分泌的限制因素不同,与文献[17]报道的结果类似。
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图 1 MHF1过表达菌株和对照菌株生长的比较及酶活性评价 Figure 1 Comparison of cell growth of the MHF1 overexpressing strains with that of the parental strains and evaluation of enzyme activities 注:A:菌株生长;B:CBH酶活性结果;C:EG酶活性结果;D:BGL酶活性结果.数据表示为均数±标准差(n=3);*:P < 0.05;**:P < 0.01 vs Y294-CBH1. Note: A: Cell growth analysis of the MHF1 overexpressing strains; B-D: CBH, EG and BGL activities. Columns, mean of 3 independents (n=3); Bars standard error of the mean. *: P < 0.05;**: P < 0.01 vs Y294-CBH1. |
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利用SDS-PAGE分析检测CBH1蛋白的含量,结果如图 2A所示,并与文献[18]进行比较确认。与对照菌株相比,YCMHF1菌株所产生的CBH1条带明显更亮,灰度分析结果显示比对照提高了约0.49倍(图 2B),表明分泌出来的目的蛋白含量增加,与CBH酶活性高于对照菌株相互呼应,说明过表达MHF1提高了目的蛋白的生产水平,进而提高了宿主菌株胞外分泌纤维素外切酶的活性。
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图 2 过表达MHF1菌株胞外蛋白分泌与对照菌株的比较 Figure 2 Secreted proteins of the parental strain and the MHF1 overexpressing strain producing CBH 注:A:SDS-PAGE蛋白电泳胶图结果. +:样品添加Endo-H;-:样品不添加Endo-H. B:蛋白电泳胶图灰度分析.数据表示为均数±标准差(n=3);*:P < 0.05;**:P < 0.01 vs Y294-CBH1. Note: A: SDS-PAGE analysis results. +: Sample treated with Endo-H; -: Sample treated without Endo-H. B: Grayscale analysis results of SDS-PAGE. Columns, mean of 3 independents (n=3); Bars standard error of the mean. *: P < 0.05;**:P < 0.01 vs Y294-CBH1. |
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由于在内质网中对蛋白质折叠需求的增加,异源蛋白的生产往往导致活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的过量积累,对酵母造成氧化损伤[19]。通过检测过表达菌株和出发菌株的胞内ROS水平发现,随着发酵的进行和发酵液中CBH酶活性的提高,越到发酵后期过表达菌株和出发菌株胞内ROS逐渐增加(图 3),与文献[20]报道一致。虽然过表达菌株的CBH酶活性是对照菌株的1.38倍,但其胞内活性氧的水平与对照菌株基本一致,没有显著的提升。
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图 3 MHF1过表达重组酵母菌株胞内活性氧水平与对照菌株Y294-CBH1的比较 Figure 3 Comparison of intracellular ROS level of the MHF1 overexpressing strain with that of the parental strain Y294-CBH1 |
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为了研究MHF1过表达提高酿酒酵母分泌表达CBH的机理,首先对CBH1的编码基因进行了转录水平分析,发现其在产酶中期显著上调。蛋白分泌途径与酿酒酵母异源蛋白生产的关系尤其密切,现有研究表明,对蛋白分泌途径进行改造可显著影响酿酒酵母异源蛋白的生产[3, 21-23]。本文选择产酶初期(24 h)与中期(48 h)两个时间点对过表达菌株和对照菌株细胞中与蛋白分泌途径相关基因的相对表达量进行了分析。结果如图 4所示,SEC22与ERV29参与从内质网到高尔基体之间蛋白的运输,在产酶前期(24 h)显著上调,介导高尔基体内部囊泡运输的YPT32以及参与分泌小泡和细胞膜融合的蛋白Sso2p的编码基因SSO2,在产酶中期(48 h)显著上调。以上结果表明,过表达MHF1增强了不同时间点和分泌途径相关的不同关键基因的表达量,从而有助于异源蛋白的产生。
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图 4 重组酵母菌株与对照菌株CBH1编码基因及蛋白运输相关基因转录水平的比较 Figure 4 Transcription levels of CBH1 encoding gene and genes involved in protein trafficking in the MHF1 overexpressing strain comparing with the control strain Y294-CBH1 注:数据表示为均数±标准差(n=3);*:P < 0.05;**:P < 0.01 vs Y294-CBH1. Note: Columns, mean of 3 independents (n=3); Bars standard error of the mean. *:P < 0.05;**:P < 0.01 vs Y294-CBH1. |
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异源蛋白生产影响细胞的全局代谢,酿酒酵母在表达外源纤维素酶的同时,伴随着蛋白的错误折叠和分泌增加,由此引发宿主菌株的代谢负担[24]。这种代谢负担有可能影响基因组的稳定性。此外,酵母蛋白过量外排的性状受到线粒体功能和基因组完整性的影响[25]。据推测,随着异源蛋白质负载的增加,将导致更多活性氧的释放[24]。Mhf1p与FANCM直系同源物在同一途径中发挥作用,修复由DNA损伤剂MMS引起的DNA损伤,保护基因组的完整性[9]。有研究显示,当细胞用MMS处理时会在细胞核及线粒体中积累活性氧,而且过量积累的活性氧将引起线粒体基因组的不稳定性[26],因此,过表达MHF1有可能通过降低活性氧的积累维持基因组的稳定性,从而促进外源蛋白的分泌。前期研究过表达SEC16使蛋白分泌提高,但是ROS积累未发生变化,推测因为过表达突变体具有清除过表达蛋白产生的ROS的功能[20]。本文也得到类似的结果,在异源表达外切纤维素酶的酿酒酵母中过表达MHF1后,重组酵母菌株CBH的酶活性和蛋白外泌量明显高于对照菌株,但其活性氧水平没有明显提升,提示MHF1过表达可能有助于降低胞内活性氧的积累。但对过表达MHF1的CBH生产菌株进行抗氧化酶检测,未发现超氧化物歧化酶和过氧化氢酶酶活性的变化(结果未显示)。MHF1过表达对重组菌株氧化胁迫反应和蛋白分泌途径的影响机理还有待进一步研究。
前期已经有很多相关的研究显示[3, 21-23],对蛋白分泌途径进行改造可显著影响酿酒酵母异源蛋白的产生。过表达SNC1、SSO2和BET1可显著提高在酿酒酵母中异源表达CBH1的活性[21-22];过表达SNC2、SSO1、SED5和SEC9可同时提高酿酒酵母中CBH1和BGL1的活性[3, 21-22];过表达YPT32可提高来自热纤维梭菌CelA在酿酒酵母中异源表达的活性[3]。检测一些文献中报道的与囊泡运输途径相关基因如SNC1、SNC2、SEC9、BET1等的转录水平(结果未展示)发现,这些基因表达的变化并不明显,提示过表达MHF1对不同基因具有不同的调控机制。前期研究表明,不同蛋白分泌的关键调控位点不同,同一基因的过表达对不同酶的促进作用不一样[21-22]。后续研究将继续考察MHF1过表达对其他蛋白产生性能的影响,为促进异源蛋白的产生奠定基础。研究者对囊泡运输过程的关键基因进行逐一过表达,发现一些基因的过表达可提高不同酶的产生[3, 21-23]。本研究不同之处在于,通过一个基因的过表达,可同时提高多个囊泡运输关键基因的表达,实现对不同关键蛋白的平衡表达调控。
本研究发现在酿酒酵母中过表达MHF1可提高重组酿酒酵母CBH的酶活性,并对促进产酶的机理进行了探讨,发现了该基因作用的多效性。首次揭示了与DNA损伤修复和基因组稳定性相关的基因MHF1在异源蛋白产生中的作用,提示相关过程可能与蛋白的产生和分泌有关。这些结果为深入研究酿酒酵母分泌表达异源蛋白的调控机理,以及提高重组酿酒酵母生产纤维素酶等功能蛋白的效率提供了依据和思路。
致谢: 感谢南非西开普敦大学Riaan den Haan博士提供重组酵母Y294-CBH1、Y294-EG2和Y294-BGL1宿主菌株。[1] |
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