微生物学通报  2019, Vol. 46 Issue (1): 42−53

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文章信息

姚灵丹, 鞠笑, Timothy Y James, 刘小勇, 邱君志
YAO Ling-Dan, JU Xiao, Timothy Y James, LIU Xiao-Yong, QIU Jun-Zhi
少根根霉多样化的生长动力学模型
Diversity of growth kinetic models for Rhizopus arrhizus
微生物学通报, 2019, 46(1): 42-53
Microbiology China, 2019, 46(1): 42-53
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180314

文章历史

收稿日期: 2018-06-28
接受日期: 2018-08-28
网络首发日期: 2018-09-14
少根根霉多样化的生长动力学模型
姚灵丹1,2 , 鞠笑2 , Timothy Y James3 , 刘小勇2 , 邱君志1     
1. 福建农林大学生命科学学院    福建 福州    350002;
2. 中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室    北京    100101;
3. Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109-1048, USA
摘要【背景】 少根根霉物种内菌株间生理生化指标存在差异,相应的遗传背景不明,不利于少根根霉生产发酵的进一步应用。【目的】 探究不同少根根霉菌株温度-生长动力学模型间的差异,为其群体遗传研究奠定基础,为生产菌株的筛选提供依据。【方法】 选取来自欧亚各地的纯种少根根霉为实验材料,通过形态学鉴定,以及ITS和IGS rDNA分子系统发育重建进行分子鉴定,采用培养基平板培养直接测量法进行温度-生长动力学分析。【结果】 少根根霉温度-生长动力学模型呈现丰富的多样性,与各形态和分子系统发育变种基本不具有相关性。菌株间温度-生长速度曲线具有显著性差异。少根根霉生长抑制低温范围、最适生长温度范围、生长抑制高温范围和致死高温范围分别为4-9、30-37、40-49和40-52 ℃。菌株XY00454和XY00469具有良好的高温适应性和较快的生长速度,有开发成为工业发酵菌的潜力。【结论】 少根根霉物种仍然处于剧烈的演化之中,种内形态、分子和生理分化较为活跃,但尚未形成任何独立的种群。根据温度适应性的数据可以筛选出发酵生产潜力菌株。
关键词米根霉     生理特征     最适生长温度     抑制生长温度     致死温度    
Diversity of growth kinetic models for Rhizopus arrhizus
YAO Ling-Dan1,2, JU Xiao2, Timothy Y James3, LIU Xiao-Yong2, QIU Jun-Zhi1     
1. College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;
2. State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
3. Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109-1048, USA
Received: 28-06-2018; Accepted: 28-08-2018; Published online: 14-09-2018
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (31670019, 31470156, 31670026); Key Project from Fujian Provincial Department of Science and Technology (2016I0003)
*Corresponding author: LIU Xiao-Yong, E-mail: liuxiaoyong@im.ac.cn; QIU Jun-Zhi, E-mail: junzhiqiu@126.com.
Abstract: [Background] Strains of Rhizopus arrhizus vary in physiological and biochemical indicators, but relative genetic background is unclear, hindering their further applications in fermentation. [Objective] This study explored temperature-growth kinetic models among strains of R. arrhizus in order to lay a foundation for investigating population genetics and for screening materials potential in production. [Methods] R. arrhizus isolated from Asia and Europe were first identified by morphology and then by molecular phylogeny reconstructed with ITS and IGS rDNA. Finally, their temperature-growth kinetics was analyzed by directly measuring colonial diameters on medium plates. [Results] The temperature-growth kinetic models of R. arrhizus were diverse, and the curves significantly differ, with less relatedness to morphological and phylogenetic varieties. Lower restraining growth, optimum growth, higher restraining growth, and fatal temperatures were 4-9, 30-37, 40-49, and 40-52 ℃, respectively. Strains XY00454 and XY00469 grew rapidly and adapted well to higher temperatures and therefore were potential for industrial production. [Conclusion] R. arrhizus is still evolving violently and diverging actively in morphology, molecular and physiology, while not developing any independent populations. It is feasible to screen fermentation potential isolates based on thermal adaptability.
Keywords: Rhizopus oryzae     Physiological characteristics     Optimum growth temperature     Inhibiting growth temperature     Lethal temperature    

少根根霉(Rhizopus arrhizus A. Fisch. 1892)最常见和应用最广泛的异名为米根霉(R. oryzae Went & Prins. Geerl. 1895),其典型的形态特征为假根不发达但常分枝,孢囊梗总是直接从气生菌丝或者匍匐菌丝上产生,长达15 mm,孢子囊褐色、球形,直径长达140 μm–180 μm,孢囊孢子有明显可见的纹饰,配囊柄同形或者异形;生理上最高生长温度不超过42 ℃[1]。少根根霉分为3个变种,即原变种(R. arrhizus var. arrhizus)、德氏变种[R. arrhizus var. delemar (Boidin ex Wehmer & Hanzawa) J.J. Ellis 1985]和东京变种[R. arrhizus var. tonkinensis (Vuill.) R.Y. Zheng & X.Y. Liu 2007][1]。少根根霉广泛存在于自然环境,包括土壤、粪便、花卉、蘑菇、枯枝落叶、空气和人体。少根根霉能产生多种代谢产物,如L-乳酸[2-3]、富马酸[4]、L-苹果酸[5-6]、γ-亚麻酸[7-8]、淀粉酶[9]、脂肪酶[10-11]、果胶酶[12-13]、鸢尾酮[14]、薯蓣皂苷元[15]和β-葡萄糖苷[16]。这些代谢产物常被应用于食品、香料、雌激素、抗肿瘤、抗过敏、抗休克以及糖基化反应。与毛霉门其他物种相比,少根根霉显示出高应激耐受性[17]。少根根霉物种内的形态、分子和生理生化多样性丰富[18-21],但其遗传背景少有解读,缺乏必要的生物学基础支撑发酵生产菌株的可持续利用。

微生物生长动力学是运用数学模型分析微生物生长的预测微生物学,其模型可分为一级、二级和三级模型。一级模型主要用于描述环境中微生物的动态变化。温度-生长动力学模型属于描述环境变化影响一级动力学参数的二级模型之一[22]。本研究选取来自欧亚各地的纯种少根根霉作为研究对象,探究不同少根根霉菌株温度-生长动力学模型间的差异及其规律,为深入的遗传和进化研究提供基础表型数据,同时指导生产菌株的筛选和应用。

1 材料与方法 1.1 材料

供试的69株少根根霉来自中国、日本、印度、印度尼西亚、葡萄牙和俄罗斯等亚洲和欧洲国家,基物包括酒曲、空气、土壤、人体皮肤、粪便、蘑菇、面粉、面包、糖纸和植物的花、叶、茎秆、果壳、树皮及其它有机质。菌种保藏于中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室,详细信息见表 1。培养基采用PDA (200 g土豆熬成土豆汁,过滤,加入葡萄糖和琼脂粉各20 g,定容至1 L,1×105 Pa灭菌30 min)。

表 1 供试少根根霉菌株详细信息 Table 1 Details of Rhizopus arrhizus involved in this study
菌株
Strains
基物
Substrates
采样地
Locality
形态学变种
Morphological taxa
分子系统发育变种
Molecular phylogenetic taxa
XY00012 Pod Germany var. arrhizus var. arrhizus
XY00077 Skinscabs Hebei, China var. tonkinensis var. delemar
XY00399 Tempeh Indonesia var. delemar var. delemar
XY00406 Koji Japan var. arrhizus var. arrhizus
XY00409 Soil Japan var. tonkinensis var. tonkinensis
XY00410 Soil Japan var. tonkinensis var. tonkinensis
XY00419 Ragi Japan var. delemar var. delemar
XY00422 Brewery yeast Indonesia var. delemar var. delemar
XY00424 Koji Japan var. arrhizus var. arrhizus
XY00429 Ragi Japan var. delemar var. delemar
XY00430 Air Russia var. delemar var. delemar
XY00431 Formosan peka, a kind of Chinese yeast Taiwan, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY00434 Chinese yeast Taiwan, China var. delemar var. delemar
XY00438 Chinese yeast Zhejiang, China var. arrhizus var. tonkinensis
XY00454 Air Russia var. arrhizus var. arrhizus
XY00457 Corn flour Portugal var. arrhizus var. arrhizus
XY00469 Air Holland var. arrhizus var. arrhizus
XY00472 Ragi Indonesia var. arrhizus var. arrhizus
XY00481 Distillery yeast Taiwan, China var. delemar var. arrhizus
XY00484 Koji Taiwan, China var. arrhizus var. arrhizus
XY00485 Chinese yeast China var. arrhizus var. arrhizus
XY00495 Distillery yeast India var. delemar var. delemar
XY00503 Pork Germany var. delemar var. delemar
XY00507 Chinese yeast Zhejiang, China var. arrhizus var. arrhizus
XY00509 Koji Japan var. arrhizus var. arrhizus
XY01735 Soil Zhejiang, China var. delemar var. delemar
XY01736 Flour Hubei, China var. delemar var. arrhizus
XY01737 Flower Beijing, China var. delemar var. delemar
XY01738 Cake Guangxi, China var. delemar var. delemar
XY01739 Mud Guangxi, China var. delemar var. delemar
XY01740 Fruit Guangxi, China var. delemar var. arrhizus
XY01741 Flower Shanghai, China var. delemar var. delemar
XY01742 Residue Jiangxi, China var. delemar var. delemar
XY01745 Air Beijing, China var. delemar var. delemar
XY01765 Dung Beijing, China var. arrhizus var. arrhizus
XY01851 Skin lesion Shanghai, China var. arrhizus var. delemar
XY01853 Soil Gansu, China var. arrhizus var. arrhizus
XY01857 Flower Yunnan, China var. arrhizus var. arrhizus
XY01861 Soil Yunnan, China var. arrhizus var. delemar
XY01864 Flower Yunnan, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY01865 Wrapping Yunnan, China var. arrhizus var. delemar
XY01874 Grass Sichuan, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY01875 Wrapping Guizhou, China var. arrhizus var. delemar
XY01876 Soil Guizhou, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY01880 Soil Sichuan, China var. arrhizus var. delemar
XY01887 Twigs and leaves Shandong, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY01892 Flower Beijing, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY01904 Soil Beijing, China var. arrhizus var. delemar
XY01907 Soil Beijing, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY01909 Mushroom Hainan, China var. arrhizus var. delemar
XY01918 Bark Henan, China var. arrhizus var. arrhizus
XY01919 Plant Chongqin, China var. arrhizus var. arrhizus
XY01920 Lesion Hebei, China var. arrhizus var. delemar
XY01921 Eye socket Beijing, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY01935 Dung Beijing, China var. arrhizus var. delemar
XY01946 Chinese yeast Sichuan, China var. arrhizus var. arrhizus
XY01957 Distillery yeast Guangdong, China var. delemar var. arrhizus
XY02033 Stem Zhejiang, China var. arrhizus var. arrhizus
XY02053 Wrapping Jilin, China var. delemar var. tonkinensis
XY02059 Seeds Hubei, China var. delemar var. arrhizus
XY02064 Soil Jilin, China var. delemar var. tonkinensis
XY02069 Shell Guangxi, China var. delemar var. delemar
XY02070 Leaves Guangxi, China var. delemar var. delemar
XY02120 Shell Hebei, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY02128 Dung Tibet, China var. tonkinensis var. tonkinensis
XY02152 Bag Hubei, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY02173 Flour sauce Beijing, China var. delemar var. delemar
XY02343 Air Beijing, China var. tonkinensis var. arrhizus
XY02348 Skin Beijing, China var. tonkinensis var. arrhizus

DNA提取试剂盒,长春市志昂生物科技有限公司。恒温培养箱,宁波海曙赛福实验仪器厂;PCR仪,MJ公司。

1.2 形态和分子鉴定

将少根根霉接种到PDA平板上,30 ℃恒温培养。挑取菌丝制作水封片,在显微镜下观察假根、匍匐菌丝、孢囊梗、孢子囊、囊轴和孢囊孢子等形态,进行形态学分类鉴定,明确形态变种[1]。挑取菌丝,提取细胞总DNA,将DNA稀释到适当浓度进行ITS和IGS rDNA的PCR扩增和测序,ITS rDNA引物为ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[23],IGS rDNA引物为NR5688F (5′-GAGTAGCCTTTGTTGCTACG-3′)和RGR-1 (5′-TTCTAGGTGATGGAC GGC-3′)[24]。PCR反应体系(25 μL):适量模板DNA (50–100 ng),正、反向引物各0.25 μmol/L,Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L,KCl 50 mmol/L,Nonidet P40 0.08%,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTPs 200 μmol/L,Taq DNA聚合酶1 U。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,33个循环;72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海美吉生物医药科技公司进行测序,测序结果通过Geneious 8.1.9分析平台[25]进行核对和装配,并构建ITS和IGS rDNA最简约(Maximum parsimony)、最大似然(Maximum likelihood)和贝叶斯(Bayesian)分子系统发育树,明确菌株的分子系统发育分支归属[26-27]

1.3 温度-生长动力学分析

采用直接测量法,将少根根霉接种到PDA平板上,在恒温培养箱中30 ℃培养7 d,除去培养基表面的菌丝和孢子,用灭菌的玻璃管切割出直径5 mm的小块,接种于150 mm的PDA平板上。为研究其最适生长温度,分别于恒温培养箱中16、23、30、37 ℃培养,每24 h沿接种点位置的十字划线测量一次生长直径。为研究其致死温度,分别置于恒温培养箱中4、9、40、43、46、49和52 ℃培养,确定致死情况。在培养箱中某温度下培养4 d未生长,视为生长停止,之后移至30 ℃培养箱中培养5 d,如果仍能生长则判定该温度为生长抑制温度,如果未生长则判定该温度为致死温度。以30 ℃培养下的生长速度(V0)为对照,计算各个温度培养下生长速度的变化率R (Ri=∣(V0Vi)/V0∣)。变化率越大,少根根霉生长速度受温度影响越大。使用R语言软件绘制少根根霉菌株的温度-生长速度曲线,计算曲线相关性矩阵,使用Excel和SPSS软件对菌株生长速度进行回归分析、方差齐性检验和显著性分析。以温度为自变量,生长速度为因变量,线性和二次项为模型,进行回归曲线估计;比较均值进行配对样本t检验,分析菌株温度-生长速度模型的差异显著性。

2 结果与分析 2.1 少根根霉温度适应性

在不同培养温度下,各少根根霉菌株表现出了不同的适应性。供试菌株的致死温度、生长抑制温度和最适生长温度的结果见表 2。培养温度为4 ℃时,所有菌株都受低温抑制停止生长,在室温下恢复生长,并未致死;9 ℃时,只有30株受到低温抑制停止生长;16、23、30和37 ℃时,所有菌株都能生长,不受任何抑制,总体平均生长速度分别为1.40、3.17、4.24和4.52 cm/d;40 ℃时,高温致死的有3株(XY02173、XY01957、XY00422),其余66株均能生长;43 ℃时,高温致死的有35株,高温抑制的有11株,正常生长的有23株;46 ℃时,高温致死的菌有60株,受到高温抑制的菌有9株,无正常生长的菌株;49 ℃时,高温致死67株,高温抑制2株;52 ℃时,最后2株菌也因高温致死。总体而言,30−37 ℃是绝大多数少根根霉的最适生长温度区间,9和40 ℃开始有菌株的生长受到抑制和致死,最高致死温度达到52 ℃;换言之,少根根霉生长抑制低温范围、最适生长温度范围、生长抑制高温范围和致死高温范围分别为4−9、30−37、40−49和40−52 ℃。

表 2 温度实验回归分析 Table 2 Regression analysis of temperature experiments
菌株
Strains
生长抑制温度
Growth inhibition temperature (℃)
实际致死温度
Lethal temperature (℃)
理论最适温度
Theoretical optimum temperature (℃)
理论最大生长速度
Theoretical maximum growth rate (cm/d)
理论高温
Theoretical highest
实际高温
Actual highest
理论低温
Theoretical lowest
实际低温
Actual lowest
XY00012 42.3 43 4.8 4 46 30.40 4.30
XY00077 42.6 43 9.0 9 49 33.60 5.40
XY00399 42.4 43 9.2 9 46 32.40 4.50
XY00406 42.5 43 6.4 4 43 30.80 4.20
XY00409 42.7 46 6.8 4 46 32.90 4.50
XY00410 42.4 43 7.2 4 43 33.30 5.00
XY00419 42.5 43 9.3 9 43 33.00 5.60
XY00422 42.3 40 9.4 9 40 32.20 4.60
XY00424 43.4 46 6.4 4 46 32.70 5.00
XY00429 42.3 43 9.3 9 43 30.00 4.00
XY00430 42.2 43 9.2 9 43 30.20 3.80
XY00431 44.4 46 4.5 4 46 30.10 4.30
XY00434 43.0 46 9.4 9 46 30.00 3.50
XY00438 43.5 46 4.9 4 46 32.60 4.00
XY00454 42.9 46 7.1 4 46 31.60 6.00
XY00457 42.6 46 7.5 4 46 31.50 4.90
XY00469 43.3 46 4.6 4 46 33.80 5.70
XY00472 42.8 46 6.3 4 46 32.10 4.70
XY00481 42.6 43 5.2 4 43 32.10 5.40
XY00484 42.9 43 3.7 4 43 32.00 4.80
XY00485 43.1 46 6.9 4 46 33.40 5.30
XY00495 42.4 43 9.2 9 49 31.50 4.90
XY00503 42.6 43 9.1 9 43 33.00 5.00
XY00507 42.9 46 6.6 4 46 32.90 4.40
XY00509 42.5 43 8.1 4 49 31.40 4.20
XY01735 43.0 46 9.2 9 52 34.30 5.50
XY01736 42.4 43 6.2 4 43 32.20 5.80
XY01737 42.5 43 8.9 9 43 33.10 4.70
XY01738 42.5 43 9.0 9 43 33.50 4.60
XY01739 42.4 43 9.2 9 46 33.40 5.40
XY01740 43.0 46 6.1 4 46 31.60 4.80
XY01741 42.5 43 10.4 9 43 33.40 4.90
XY01742 42.7 43 9.4 9 49 32.50 5.10
XY01745 42.7 43 9.4 9 43 32.80 5.20
XY01765 43.6 46 5.6 4 46 30.30 3.60
XY01851 42.8 43 9.3 9 43 33.10 4.60
XY01853 42.7 46 3.9 4 49 31.40 4.30
XY01857 43.0 46 9.1 9 46 30.70 4.40
XY01861 42.8 43 9.1 9 46 33.60 4.80
XY01864 42.6 43 4.5 4 43 32.90 4.00
XY01865 42.7 43 9.4 9 46 33.30 4.90
XY01874 43.3 46 2.8 4 46 32.70 5.10
XY01875 42.7 43 9.3 9 46 33.20 4.90
XY01876 43.5 46 6.0 4 46 31.70 4.90
XY01880 42.8 43 9.3 9 49 33.90 4.90
XY01887 42.7 43 7.8 4 43 33.70 4.70
XY01892 42.7 43 7.2 4 43 32.30 5.30
XY01904 42.6 43 9.1 9 43 34.30 5.70
XY01907 42.8 43 4.7 4 43 33.30 4.70
XY01909 42.6 43 9.2 9 43 32.50 5.10
XY01918 42.7 43 3.8 4 43 33.90 4.90
XY01919 43.4 46 3.4 4 49 33.50 4.60
XY01920 42.8 43 6.2 4 43 33.30 5.00
XY01921 43.3 46 5.9 4 46 33.30 4.50
XY01935 42.4 43 9.3 9 43 32.40 5.00
XY01946 42.4 43 9.0 9 43 30.00 4.30
XY01957 41.1 40 9.0 9 40 30.10 3.90
XY02033 42.7 43 6.2 4 43 31.20 5.10
XY02053 42.7 43 4.4 4 43 34.10 5.50
XY02059 43.5 46 4.3 4 46 33.00 4.50
XY02064 43.0 43 3.0 4 43 34.30 4.60
XY02069 42.5 43 9.0 9 43 33.00 5.00
XY02070 42.4 43 9.1 9 43 33.30 4.70
XY02120 43.4 46 5.3 4 52 33.50 4.90
XY02128 43.3 46 2.4 4 46 32.40 4.40
XY02152 42.6 43 6.9 4 43 32.30 4.10
XY02173 42.2 40 9.2 9 40 30.30 3.60
XY02343 42.6 43 7.7 4 43 33.30 5.00
XY02348 42.4 43 8.1 4 43 33.00 5.20

各温度下生长速度皆快于供试菌株总体平均水平(16、23、30和37℃平均生长速度分别为1.40、3.17、4.24和4.52 cm/d)的有4株(XY00469、XY00454、XY00424、XY01874),生长速度皆慢于平均水平的有5株(XY00429、XY02173、XY00430、XY01946、XY01957)。以少根根霉各菌株30 ℃培养的生长速度为对照,绘制的生长速度变化率见图 1。受到温度变化影响最大的菌株是XY01957,受到温度变化影响最小的菌株是XY00438。

图 1 供试菌株在各培养温度下生长速度的变化率 Figure 1 Growth change rates at various temperature 注:纵坐标为菌株编号,横坐标R为以30 ℃为对照,16、23、37、43 ℃培养下,少根根霉生长速度的变化率(Ri=∣(V0Vi)/V0∣),颜色代表不同温度,    为16 ℃,    为23 ℃,    为37 ℃,    为43 ℃. Note: Y-axis is strains, and X-axis R (Ri=∣(V0Vi)/V0∣) is the change rate that growth velocity cultured in 16, 23, 37, 43 ℃ is controlled by 30 ℃. Different color shows different temperature, i.e.     ,     ,      and      represent 16, 23, 37 and 43 ℃, respectively.
2.2 少根根霉温度-生长回归分析及动态模型

当低温(≤30 ℃)和高温(> 30 ℃)分开进行回归分析时得到的方程与实际拟合度优于将所有温度作为整体的回归方程,所以少根根霉温度-生长模型采用分段函数表示。大多数菌株(56株)的温度-生长模型由两段一元二次函数组成,少数菌株(13株,如XY01918、XY02509、XY00469、XY00431)的温度-生长模型由一段一元一次函数与一段一元二次函数组成(结果未展示)。由回归方程推测出少根根霉理论上的抑制低温、最适温度、抑制高温范围分别为2.4−10.4、30.0−34.4、41.1−44.4 ℃,这些理论上的数值与实际测定获得的数值(4.0−9.0、30.0−37.0、40.0−49.0 ℃)基本相符(表 2)。

2.3 温度影响少根根霉菌株生长速度的显著性分析

将生长速度数据按照温度区间分组,多重显著性差异分析结果见表 3,除16和40 ℃之间不存在显著性差异(P > 0.05)之外,其余任意2个温度之间的少根根霉菌株生长速度存在极显著差异(P < 0.01)。

表 3 不同培养温度下少根根霉生长速度的多重比较 Table 3 Multiple comparison for growth rate of Rhizopus arrhizus under different temperature
温度I
Temperature I (℃)
温度J
Tenperature J (℃)
均值差
Mean variance (I–J)
标准差
Standard error
显著性
Significance
95%置信区间95% confidence interval
Minimum Maximum
9 16 −0.50 0.03 0.00 −0.58 −0.42
23 −1.38 0.04 0.00 −1.50 −1.27
30 −1.92 0.04 0.00 −2.03 −1.81
37 −2.06 0.06 0.00 −2.23 −1.89
40 −0.41 0.05 0.00 −0.57 −0.26
43 0.12 0.03 0.00 0.04 0.21
16 23 −0.89 0.03 0.00 −0.98 −0.79
30 −1.42 0.03 0.00 −1.51 −1.33
37 −1.56 0.05 0.00 −1.72 −1.41
40 0.08 0.05 0.53 −0.05 0.22
43 0.62 0.02 0.00 0.56 0.68
23 30 −0.54 0.04 0.00 −0.65 −0.42
37 −0.68 0.06 0.00 −0.85 −0.51
40 0.97 0.05 0.00 0.81 1.13
43 1.51 0.03 0.00 1.41 1.61
30 37 −0.14 0.06 0.18 −0.31 0.03
40 1.51 0.05 0.00 1.35 1.66
43 2.05 0.03 0.00 1.95 2.14
37 40 1.65 0.07 0.00 1.45 1.85
43 2.19 0.05 0.00 2.03 2.34
40 43 0.54 0.05 0.00 0.40 0.68

对少根根霉的温度-生长速度曲线进行配对t检验,图 2列出了菌株曲线两两间的P值,说明许多菌株在相同温度变化条件下表现出的生长速度变化具有统计学上的差异。

图 2 少根根霉菌株间温度-生长曲线相关性矩阵 Figure 2 Correlation matrix of temperature-growth curves for Rhizopus arrhizus strains 注:×:差异不显著(P > 0.05),颜色越深表示P值越大. Note: ×: The difference is not significant (P > 0.05), darker and greater P value.
2.4 少根根霉变种间温度-生长动态显著性分析

少根根霉69株菌的形态和分子系统发育变种鉴定结果见表 1。分子系统发育鉴定结果为原变种(var. arrhizus) 35株、东京变种(var. tonkinensis) 6株、德氏变种(var. delemar) 28株;形态学鉴定结果为原变种28株、东京变种12株、德氏变种29株;其中28株菌(41%)的形态学鉴定结果与分子鉴定结果不一致。将所有菌株按照分子系统发育变种和形态变种进行温度-生长动态特性的显著性分析,结果(表 4)表明:3个形态变种的菌株在各个温度下均P > 0.05,说明少根根霉的温度-生长速度差异与其形态变种不相关。3个分子系统发育变种的菌株在23 ℃时P < 0.05,所以23 ℃时少根根霉的生长速度差异与分子系统发育变种具有一定的对应关系;对3个系统发育变种数据进行两两比较,原变种和德氏变种间P < 0.05,东京变种与原变种和德氏变种间均P > 0.05,说明23 ℃培养下少根根霉原变种和德氏变种间生长速度存在显著性差异,其余培养温度下变种间不存在显著性差异,不能作为区分3个系统发育变种的分类依据。综上所述,少根根霉菌株的温度-生长速度差异与少根根霉形态学或分子系统发育的变种分类基本无关。

表 4 少根根霉变种间温度-生长动态特性显著性分析 Table 4 Significance analyses of temerature-growth kinetics for three varieties within R. arrhizus
分类
Classification
因变量
Dependent variable (℃)
Ⅲ平方和
Ⅲ quadratic sum
DF 均方
Mean square
F P
分子系统发育变种
Molecular phylogenetic varieties
16 0.17 2 0.09 2.35 0.10
23 1.84 2 0.92 4.60 0.01
30 0.13 2 0.06 0.31 0.73
37 0.43 2 0.22 0.31 0.74
40 2.56 2 1.28 2.43 0.10
形态学变种
Morphological varieties
16 0.02 2 0.01 1.02 0.37
23 0.07 2 0.03 0.60 0.55
30 0.27 2 0.14 2.88 0.06
37 0.68 2 0.34 2.04 0.14
40 0.26 2 0.13 0.89 0.41
3 讨论与结论

在根霉属专著性研究中已经对之前的最高生长温度进行过综述,认为少根根霉的最高生长温度(生长抑制高温)不超过42 ℃ [1],而本文结果显示,在69株供试菌种中,只有3株菌(XY00422、XY01957、XY02173)的生长抑制高温为40 ℃,达到43 ℃的菌有43株。如果排除接种方法、培养基和培养箱等因素的影响,本文结果基本印证了专著性研究的结果[1]。但是,另有23株菌的生长抑制高温达到46 ℃甚至49 ℃,这样的结果在以前的研究中从未提及[1]。因此,对于少根根霉来说,其最高生长温度(生长抑制高温)范围应该修订为40−49 ℃。

此前对于培养温度与少根根霉生长关系的研究主要着眼于一株或少数几株少根根霉的生长特性或发酵条件优化[28-30],未见培养温度对大量少根根霉菌株生长速度影响的系统性研究报道。本研究使用R语言分析培养温度与少根根霉生长速度间的数学关系,并建立函数模型,即少根根霉温度-生长速度曲线。该函数模型能预测不同少根根霉生长速度随培养温度变化的趋势,可以系统、全面地比较不同少根根霉菌株间温度适应能力的差异。温度-生长速度曲线间的配对t检验证明,不同的少根根霉菌株对温度变化的适应能力具有统计学意义上的差异。这种适应性差异由菌株自身特性决定,与形态学变种和分子系统发育变种都基本不具有一致性,不能作为分类依据。由此可以推测,少根根霉物种仍然处于剧烈的演化之中,种内形态、分子和生理分化较为活跃,但还未形成任何完全独立的种群。虽然如此,但在23 ℃培养下分子系统发育分类后的少根根霉原变种和德氏变种间生长速度存在显著性差异,因此可以将此特性作为区分这两个分子系统发育变种的重要参考。

本研究的菌株主要为国内的野生型菌株,经过驯化的酿酒菌和分离自病人的致病菌较少,未来的研究中应当更为广泛地收集来自国内外的驯化菌株和致病菌株,使不同来源的菌株数目更趋平衡,利用温度-生长速度曲线进一步探讨少根根霉由自然环境驯化到酿酒环境或者过渡到致病环境的适应性趋势,并在此表型研究的基础上结合比较基因组研究来解析少根根霉群体演化机制。

通过本研究的初步结果,已经能够筛选出一些在未来深入研究和开发利用中值得重点关注的少根根霉菌种材料。比如,研究不同菌株温度适应能力的差异,较好的素材有6株,包括对温度变化最不敏感的3株(XY00438、XY01921、XY01874)和最敏感的3株(XY01904、XY02053、XY01957);研究耐高温胁迫机制的良好素材有5株,最高致死温度2株(XY01735、XY02120)和最低致死温度3株(XY02173、XY01957、XY00422);作为发酵菌,具有潜力的是XY00454和XY00469,这两株菌在温度-生长速度函数模型中的理论最大速度排名也很高,在大于30 ℃的高温下都有较快的实测生长速度,容易适应生产发酵的温度。

致谢: 感谢本项目组刘红梅实验师在菌种分离和保藏方面提供的帮助,感谢北方民族大学白宇川和邓鹏程同学在实验过程中给予的帮助。
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