微生物学通报  2019, Vol. 46 Issue (1): 29−41

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胡泽瑞, 刘媛, 彭长连, 李淑彬
HU Ze-Rui, LIU Yuan, PENG Chang-Lian, LI Shu-Bin
三叶鬼针草内生细菌群体多样性及重金属耐受和吲哚乙酸产生潜力
Diversity, heavy-metal tolerance and indoleacetic acid production of bacterial endophytes in Bidens pilosa
微生物学通报, 2019, 46(1): 29-41
Microbiology China, 2019, 46(1): 29-41
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180314

文章历史

收稿日期: 2018-04-20
接受日期: 2018-07-05
网络首发日期: 2018-09-17
三叶鬼针草内生细菌群体多样性及重金属耐受和吲哚乙酸产生潜力
胡泽瑞 , 刘媛 , 彭长连 , 李淑彬     
华南师范大学生命科学学院    广东 广州    510631
摘要【背景】 定殖于植物的多样内生细菌与宿主生长和抗逆能力密切相关。三叶鬼针草(Bidens pilosa L.)极具入侵性且抗逆性强,但目前该植物内生细菌相关研究报道极少。【目的】 探究三叶鬼针草内生细菌群体多样性,筛选获得兼具重金属耐受性及吲哚乙酸(Indoleacetic acid,IAA)产生潜力的内生细菌菌株。【方法】 采用MiSeq高通量方法分析三叶鬼针草内生细菌群体多样性,可培养方法测定内生细菌菌株对重金属Pb、Cd、Ni、Hg的耐受能力及产生IAA的潜力。【结果】 从三叶鬼针草内生细菌群体中共测得4 031个操作分类单元(OTU),可归属于25个门51个纲76个目182个科及536个属。属级水平上,三叶鬼针草根、茎、叶和种子中分别以肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)及假单胞菌属(Pseudomonas)丰度最高,伯克氏菌属(Burkholderia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属、泛菌属(Pantoea)次之;从三叶鬼针草分离得到34株内生细菌,所有菌株均至少对1种测试的重金属具有耐受性。其中,GF-1、GF-8、YF-1、YF-2、JF-1、GF-2和JF-8这7个菌株能够产生IAA,其产率为57.48-312.22 μg/mL;基于16S rRNA基因序列分析,初步鉴定菌株GF-1、GF-8、YF-1、YF-2、JF-1为芽孢杆菌(Bacillus spp.),菌株GF-2为假单胞菌(Pseudomonas sp.),菌株JF-8为伯克氏菌(Burkholderia sp.)。【结论】 三叶鬼针草内生细菌群体具有丰富的种群多样性。三叶鬼针草内生细菌菌株GF-1、GF-8、YF-1、YF-2、JF-1、GF-2和JF-8兼具多重金属耐受性及高产IAA潜力,是重金属复合污染土壤生物修复的优良候选菌株。
关键词三叶鬼针草     内生细菌     种群多样性     重金属耐受     IAA产生    
Diversity, heavy-metal tolerance and indoleacetic acid production of bacterial endophytes in Bidens pilosa
HU Ze-Rui, LIU Yuan, PENG Chang-Lian, LI Shu-Bin     
College of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou, Guangdong 510631, China
Received: 20-04-2018; Accepted: 05-07-2018; Published online: 17-09-2018
Foundation item: National Key Research and Development Program of China (2017YFC1200105)
*Corresponding author: LI Shu-Bin, Tel: 020-61022290; E-mail: shuli_1990@126.com.
Abstract: [Background] Plants are inhabited by diverse bacterial endophytes that are closely related to the growth and stress tolerance of their hosts. Bidens pilisa L. is a highly invasive plant species with strong stress tolerance. However, up to date, there is limited literature reporting the research involving the bacterial endophytes of the plant species. [Objective] To investigate and characterize the diversity of bacterial endophytes community of B. pilisa, and to obtain the bacterial isolates from the plant species with both potential of heavy metal-tolerance and indoleacetic acid (IAA) production. [Methods] The diversity of bacterial endophytes community was analyzed by using MiSeq high-throughput sequencing method. The tolerance ability to heavy metals Pb, Cd, Ni, and Hg, as well as the IAA-producing ability of bacterial endophytes were evaluated by using culture-dependent method. [Results] We recovered a total of 4 031 distinct operational taxonomic units from the total bacterial endophytes community of B. pilosa, which could be affiliated with 25 distinct bacterial phyla, 51 distinct bacterial classes, 76 distinct bacterial orders, 182 distinct bacterial families, and 536 distinct bacterial genera. At the genus level, the most dominant bacterial genera detected from the root, stem, leaf, and seed of B. pilosam were Enterobacter, Acinetobacter, Sphingomonas, and Pseudomonas, respectively, followed by Burkholderia, Methylobacterium, Pseudomonas, and Pantoea. Using culture-dependent method, we obtained 34 bacterial isolates from the internal tissues of B. pilisa and all obtained strains showed the tolerance at least to one tested heavy metal. Seven strains (numbered GF-1, GF-8, YF-1, YF-2, JF-1, GF-2, JF-8, respectively) could produce IAA with IAA yields varying in the ranging from 57.48-312.22 μg/mL. Based on 16S rRNA gene sequence analysis, the 7 IAA-producing strains were identified, and strains GF-1, GF-8, YF-1, YF-2, JF-1 as Bacillus spp., strain GF-2 as Pseudomonas sp., strain JF-8 as Burkholderia sp. [Conclusion] The bacterial endophytes community of B. pilosa has high population diversity. Bacterial endophytes strains GF-1, GF-8, YF-1, YF-2, JF-1, GF-2, and JF-8 obtained from B. pilosa show not only multi-heavy metals tolerance also high IAA production, being good candidates used as bio-inoculation agent for bioremediation of heavy metal-contaminated soil.
Keywords: Bidens pilisa L.     Bacterial endophytes     Population diversity     Heavy metal tolerance     IAA production    

植物内生细菌(Bacterial endophytes)是指能够定殖于植物体内,对宿主无明显不利影响的细菌。大量研究显示内生细菌可通过固氮作用、分泌生长素、产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、铁载体、抗生素等多种方式促进植物生长,提高其对生物及非生物胁迫的抗性[1-4]。外来植物入侵威胁入侵地生态系统物种多样性及服务功能,影响农林牧业生产[5-6]。目前外来入侵植物内生细菌多样性及其功能也日渐被关注。White等报道芦苇种子内生细菌能提高入侵植物幼苗生长和病原抗性,增加其与其他植物的竞争能力[7]。李虎等对互花米草内生细菌群体的免培养分析显示其根内细菌极其丰富,其中许多具有促进植物对C/N/S的利用、减轻有机污染物对植物毒害等潜力[8]。Aires等报道南西贝利亚岛高度入侵植物Asparagopsis spp.内生细菌定居多样化的具有活性氧清除、重金属抗性及有机物矿化等潜力的内生细菌[9]。可见,内生细菌在外来植物迅速适应环境并成功入侵中也起着关键作用。

三叶鬼针草(Bidens pilisa L.)为菊科(Compositae)鬼针草属(Bidens)一年生草本植物,原产美洲热带,该植物极具入侵性,目前已入侵我国大部分地区,对农田、园艺生产,以及生物多样性和生态系统安全构成了严重危害[10-11]。三叶鬼针草不仅繁殖迅速,而且生态适应性强,尤其能够耐受和富集镉(Cd)、铅(Pb)等多种重金属[12-13]。目前,三叶鬼针草内生细菌群体多样性尚未系统研究,本论文通过高通量测序技术分析了该入侵植物内生细菌群体多样性,同时通过传统分离培养技术分析了三叶鬼针草优势内生细菌的重金属耐受性和IAA产生潜力,以期为揭示内生细菌群体在该入侵植物成功入侵中的潜在作用提供参考,并为该植物内生细菌资源的有效利用,特别是在微生物-植物联合修复重金属污染中的应用提供依据和候选菌株。

1 材料与方法 1.1 植物材料

三叶鬼针草根、茎、叶和成熟种子均收集于广州市郊某三叶鬼针草单优入侵群落。随机选取4−5株三叶鬼针草健壮植株(株高0.5 m以上),整株挖取后带回实验室。成熟种子收集于灭菌纸袋中。于3 d内完成总DNA抽提及优势内生细菌分离。

1.2 主要培养基

牛肉膏蛋白胨培养基(g/L):牛肉膏3.0,细菌学蛋白胨10.0,氯化钠5.0,琼脂20.0,pH 7.2;有氮培养基(g/L):蔗糖10.0,硫酸铵1.0,磷酸氢二钾2.0,七水硫酸镁0.5,氯化钠0.1,酵母膏0.5,碳酸钙0.5,pH 7.2;色氨酸-有氮培养基:向灭菌后的有氮液体培养中加入色氨酸,使色氨酸终浓度为0.5 mg/L。

1.3 主要试剂和仪器

Dzup (植物)基因组DNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;吲哚乙酸(IAA),Sigma公司;Sackowski’s显色剂:35%的高氯酸和0.5 mol/L的氯化铁按体积比50:1配置混匀,现配现用。

PCR仪,Bio-Rad公司;超微量分光光度计,Thermo Fisher Scientific公司;MISEQ03,Illumina公司。

1.4 三叶鬼针草内生细菌群体的免培养分析

1.4.1 总DNA抽提及高通量测序分析

用流水冲洗植株表面脏污,吸干水分。用无菌剪刀剪取根、茎、叶分别置于培养皿中,按照以下步骤对各组织样品及种子进行表面消毒:75%酒精浸泡30 s→无菌水冲洗3次→0.3%次氯酸钠浸泡4 min (种子和叶)或6 min (根、茎)→无菌水冲洗5次。将表面消毒后的样品移入牛肉膏蛋白胨培养基平板上,28 ℃培养24 h,检查表面消毒效果[8]。表面完全消毒的样品再次用灭菌超纯水冲洗3次以去除表面残留的微生物DNA。将样品移入无菌研钵,加入液氮充分研磨后严格按照植物DNA提取试剂盒中的说明提取总DNA,琼脂糖凝胶电泳验证后切胶回收纯化。紫外分光光度法检测其浓度和纯度后送生工生物工程(上海)股份有限公司利用MISEQ03平台进行高通量序列分析。测序靶标DNA为16S rRNA基因V3−V4可变区,所用引物为341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。

1.4.2 数据处理与操作分类单元(OTU)多样性分析

Illumina MiSeq得到的原始图像数据文件经Casava碱基识别分析转化为原始读序。利用Cutadapt去除原始读序引物和接头序列,利用Pear将成对的读序进行拼接,并去除序列长度≤200 bp的短序列及嵌合体序列,得到可进一步分析的有效序列。利用Usearch对有效序列进行聚类,相似性≥97%定义为同一操作分类单元(OTU)[14]。使用软件R统计各组织OTU数及其相对丰度、共有的和独有的OTU数;按照如下公式计算OTU覆盖率(Coverage):覆盖率=1−n1/Nn1为只含有1条序列的OTU数目,N为序列总数。根据各组织中OTU数及各OTU相对丰度,计算单样品Shannon多样性指数:Shannon多样性指数=−Σ(Pi×lnPi),式中Pi为第i个OTU在该组织中的相对丰度。

1.4.3 种群组成分析

利用BLASTn将有效OTU序列与NCBI 16S rRNA基因数据库进行比对,满足相似度 > 90%且覆盖率 > 90%的序列用于后续分类。进一步对满足上述条件的序列通过核糖体在线归类系统进行门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)各级系统分类水平的种群归类。使用Bootstrapping方法估计分类可信度。当某级水平的可信度≥80%时,视为可确定为该级归类水平,反之为该级水平不能归类(Unclassified)[15]。根据种群归类结果,分析各组织免培养内生细菌群体种群组成及其差异。使用软件R的Vegan package对所有组织内生细菌群体进行不同层级水平的非度量多维尺度分析(Non-metric multidimensional scaling,NMDS)。

1.5 三叶鬼针草优势内生细菌的分离及促生潜力测定

1.5.1 三叶鬼针草优势内生细菌的分离纯化

按照1.4.1方法对三叶鬼针草各组织严格表面消毒后,取消毒研磨的样品用无菌水进行10倍稀释至10−4−10−5,取各稀释度涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板,挑选在最高稀释度长出的菌苔进行纯化,并连续传代5次以上即得可稳定传代菌株。

1.5.2 三叶鬼针草优势内生细菌对重金属的耐受性测定

按照文献[16-17]分别配制100−1 000 mg/L的Cd2+、Ni+、Pb2+溶液和10−40 mg/L的Hg2+溶液。将灭菌的圆滤纸片(直径为6 mm)轻贴于预先均匀涂布各菌株菌液的牛肉膏蛋白胨培养基平板表面,再于各滤纸片上分别滴加8 μL不同浓度的重金属溶液,30 ℃恒温培养2 d后观察结果。纸片周围无透明圈出现即为耐受。每一菌株每一测定3个重复。

1.5.3 三叶鬼针草优势内生细菌产IAA潜力测定

定性测定:于24孔板培养孔中加入0.5 mL色氨酸-有氮液体培养基,接入50 μL过夜培养的各菌株菌液,30 ℃恒温培养48 h后,加入0.5 mL现配的Sackowcki’s显色剂,避光放置30 min后观察其颜色变化,颜色变红则为阳性,表示能够分泌IAA[18]

定量测定:选取初筛阳性菌株,按1% (体积比)将其过夜培养的菌液接种于色氨酸-有氮液体培养基中,于30 ℃、180 r/min培养,待其OD600接近1.0时,将培养液于室温(25 ℃左右)、8 000×g离心10 min,取上清加入等体积现配的Sackowcki’s显色剂,避光放置30 min,测定OD530[18]。通过IAA标准曲线定量计算单位体积上清中IAA含量。每个菌株重复测定3次。

1.5.4 三叶鬼针草产IAA内生细菌菌株的初步鉴定

选取具产IAA能力的内生细菌菌株接入LB培养液中振荡培养24 h,4 000×g离心10 min收集菌体,用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA,方法参见试剂盒说明书。以提取的各DNA为模板,用细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTA CGACTT-3′)扩增菌株16S rRNA基因序列。PCR反应体系(25 μL):Premix Taq 12.5 μL,正、反向引物(10 mmol/L)各1 μL,模板DNA (约200 ng) 2 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,30个循环;72 ℃ 7 min。切胶回收目标产物(约1 500 bp)后委托深圳华大基因公司测序。所得序列在NCBI进行BLAST同源性搜索,下载相近序列,运用MEGA 5.05构建Neighbor-Joining系统树,自展数(Bootstrap)为1 000。

2 结果与分析 2.1 三叶鬼针草内生细菌群体操作分类单元的多样性分析

三叶鬼针草4个组织16S rRNA基因V3−V4可变区高通量测序后共得到36 617条长度为407±2 bp的有效序列。在97%相似度下将其聚类,共产生4 031个OTU,以根最多,种子次之,然后是茎,叶最少(表 1)。4个组织OTU覆盖率均接近或超过90% (表 1),说明研究结果能反映所测样品真实情况。根据各样品OTU数量及各OTU相对丰度计算不同组织内生细菌群体Shannon指数在1.25−5.12之间,以根最大,叶最少(表 1),可见,鬼针草根中内生细菌群体无论多样性还是丰富度都最高。每个组织均有多个独有的OTU,4个组织全部共有的OTU仅12个,表明该植物不同组织内生细菌群体组成可能不同。

表 1 三叶鬼针草内生细菌群体操作分类单元多样性分析 Table 1 OTU-based diversity analysis of bacterial endophytes community of B. pilisa
组织
Tissues
有效序列数目
Numbers of valid sequences
OTU数目
Numbers of OTU
Shannon指数
Shannon index
覆盖率
Coverage (%)
根Root 18 814 2 934 5.12 86.66
茎Stem 1 948 264 4.27 92.27
叶Leaf 1 183 113 1.25 92.65
种子Seed 14 672 882 2.11 95.98
2.2 三叶鬼针草内生细菌群体门和纲水平的种群组成分析

基于核糖体在线归类分析,三叶鬼针草根、茎、叶和种子4个组织16S rRNA基因V3−V4可变区OTU序列95%以上能在纲或以上水平进行归类,分属25个原核生物门,51个不同的细菌纲。以变形菌门(Proteobacteria)为绝对优势细菌门,其总丰度接近80%,其次为厚壁菌门(Firmicutes),再次为放线菌门(Actinobacteria) (图 1A)。在纲水平上,三叶鬼针草根、茎、叶、种子内生细菌群体分别分属于42、24、14、21个纲。α-变形菌纲(α-proteobacteria)是该植物根、叶、种子的优势纲,其丰度分别为46.3%、82.9%、50.9%,而茎最优势纲则为γ-变形菌纲(γ-proteobacteria),其相对丰度接近30% (图 1B)。4个组织次优势纲也不同:根为放线菌纲(Actinobacteria,13%),茎为α-变形菌纲(27.2%),叶为鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia,4.3%),种子为γ-变形菌纲(39.8%) (图 1B)。其他在1个或多个组织中丰度达到1%以上且其丰度在不同组织差异较大的细菌纲包括拟杆菌纲(Bacteroidia)、浮霉菌纲(Planctomycetacia)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)、醋杆菌纲(Acidobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、梭菌纲(Clostridia)、β-变形菌纲(β-proteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、醋杆菌纲(Acidobacteria)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、硝化螺菌纲(Nitrospira)、噬纤维菌纲(Cytophagia)等15个细菌纲(图 1B)。

图 1 三叶鬼针草内生细菌门(A)和纲(B)水平的种群组成 Figure 1 Populations composition of bacterial endophytes community of B. pilisa at the phylum (A) and class (B) levels
2.3 三叶鬼针草内生细菌群体目和科水平上的种群组成分析

三叶鬼针草各组织得到的OTU均有许多不能在目、科和属水平上进行归类。在已归类的76个细菌目中,根、茎、叶、种子内生细菌群体分别分属于72、25、14、22个目。根组织中放线菌目(Actinomycetales)丰度最高,肠杆菌目(Enterobacteriales)次之;叶组织中鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)丰度最高,芽孢杆菌目(Bacillales)次之;种子和茎组织均以假单胞菌目(Pseudomonadales)丰度最高,肠杆菌目(Enterobacteriales)次之(图 2A)。在已归类的科中,根、茎、叶、种子内生细菌群体分别分属于151、79、32、57个科,分别以肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、鞘酯单胞菌科(Sphingomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)为最优势科(图 2B)。

图 2 三叶鬼针草内生细菌目(A)和科(B)水平的种群组成 Figure 2 Populations composition of bacterial endophytes community of B. pilisa at the order (A) and family (B) levels
2.4 三叶鬼针草内生细菌群体属水平上的种群组成分析

三叶鬼针草根、茎、叶、种子所得OTU序列分别有约56%、75%、17%、49%可在属水平归类,分属536个不同的属,各组织所含属数目不同,依次为:根(421) > 茎(137) > 种子(119) > 叶(49)。已归类的属中,假单胞菌属(Pseudomonas)总丰度最高,该属在4个组织均有分布,尤其在种子中丰度高达20%。其次为不动杆菌属(Acinetobacter),该属主要分布于根、茎两个组织,在茎中丰度高达12%。叶组织中鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)丰度最高,茎、叶组织中甲基杆菌属(Methylobacterium)和芽孢杆菌属(Bacillus)丰度也较高。根组织中各属分布较为均匀,肠杆菌属(Enterobacter)丰度最高,伯克氏菌属(Burkholderia)次之,此外小单孢子菌属(Micromonospora)、类诺卡氏属(Nocardioides)、链霉菌属(Streptomyces)、出芽菌属(Gemmata)、芽孢杆菌属、不动杆菌属等在根中丰度也≥1%,为根优势细菌属(图 3)。泛菌属(Pantoea)、马赛菌属(Massilia)等其他15属也在1个或多个组织中丰度≥1%。一些属仅在1个或几个组织中被检出,如小单孢子菌属、类诺卡氏属、伯克氏菌属仅在根中被检出,Rosenbergiella属仅在种子中被检出,棒状杆菌属(Corynebacterium)仅在茎中被检出,说明一些细菌种群在三叶鬼针草内具有一定的组织偏好性。

图 3 三叶鬼针草内生细菌群体属水平的种群组成 Figure 3 Populations composition of bacterial endophytes community of B. pilisa at the genus level
2.5 三叶鬼针草内生细菌群体种群组成的NMDS分析

图 4显示门、纲、属3个分类学水平上三叶鬼针草所有组织内生细菌群体种群组成的NMDS分析斑点图,3个不同的分类学水平结果一致,代表该植物不同组织的斑点明显分开,说明该植物不同组织内生细菌群体种群组成存在明显差异;代表根组织的斑点与代表其他3个组织的斑点距离最远,说明根中内生细菌群落组成与其他组织差异最大。

图 4 三叶鬼针草内生细菌群体种群组成门(A)、纲(B)、属(C)水平的NMDS分析斑点图 Figure 4 NMDS plots of bacterial endophytes community of B. pilisa at the levels of phylum (A), class (B), and genus (C)
2.6 三叶鬼针草根优势内生细菌的分离和重金属耐受能力

用常规的植物内生细菌分离培养方法,从三叶鬼针草根、茎内生细菌获得34株可稳定传代的细菌菌株。34株内生细菌对Pb、Cd、Ni、Hg等4种重金属的耐受能力综合为表 2。从表 2可知,所有菌株均至少对1种测试的重金属具有不同程度的耐受能力。30个菌株能耐受≥200 mg/L Pb2+,其中5个菌株最高Pb2+耐受浓度可达1 000 mg/L;16个菌株能耐受≥100 mg/L Cd2+,其中3株最高耐受浓度达到500 mg/L;30个菌株能耐受≥100 mg/L Ni+,其中2株最高Ni+耐受达到1 000 mg/L;Hg2+对所测菌株毒害最高,仅6个菌株表现Hg2+耐受,其最高耐受浓度也仅为30 mg/L。12个菌株可同时耐受3种以上的重金属。菌株YF-1、YF-2、YF-3、JF-1-2能同时耐受4种测试重金属。

表 2 三叶鬼针草内生细菌菌株重金属耐受测定 Table 2 Detection of heavy metals tolerance of bacterial endophytes isolated from B. pilisa
菌株
Strains
最高耐受浓度
The highest tolerance concentration (mg/L)
Pb2+ Cd2+ Ni+ Hg+
GF-1 200 200 100
GF-2 200 100 100
GF-3 1 000 1 000
GF-5 100 100
GF-7 100 100
GF-8 1 000 500 200
GF-10 100 200
GF-X 100
GF-Y 500 100 100
JF-1 1 000 200 200
JF-1-2 1 000 100 200 10
JF-2 200 100 200
JF-3 500 500
JF-4 1 000 200 30
JF-5 100 200
YF-7 500 200
YF-8 500 100
JF-6 100 200
JF-8 1 000 100 200
JF-9 100 100
JF-10 100 200
JF-11 100 100
JF-12 200 200
JF-13 500 200
JF-14 200
JF-15 100 500
YF-1 1 000 500 500 30
YF-2 500 100 1 000 10
YF-3 200 100 100 10
YF-4 100
YF-5 100 100 10
YF-7 500 200
YF-10 100 200 500
YF-11 200
注:−:菌株不能耐受该重金属所测试的最低浓度(Pb2+、Cd2+、Ni+为100 mg/L,Hg2+为10 mg/L).
Note: −: Strain cannot tolerant the lowest concertrations tested (100 mg/L for Pb2+, Cd2+, and Ni2+, 10 mg/L for Hg2+).
2.7 三叶鬼针草优势内生细菌群体的IAA产生潜力测定

24孔板-Salkowski’s显色反应对34株测试菌株的IAA产生潜力进行初筛,出现红色显色反应即为IAA产生阳性菌株,分泌能力越强则红色越深。7个菌株显示具有IAA产生潜力(图 5A)。进一步通过摇瓶培养定量测定各阳性菌株的IAA产率,结果显示,IAA产率范围为57.48−312.22 μg/mL,以菌株JF-1为最高,接着依次为YF-1 (225.69 μg/mL)和GF-8 (81.11 μg/mL) (图 5B)。

图 5 三叶鬼针草内生细菌菌株产IAA能力测定 Figure 5 Detection of IAA-producing potential of bacterial endophytes isolated from B. pilisa 注:A:定性测定;B:定量测定. Note: A: Qualitative determination; B: Quantitative determination.
2.8 三叶鬼针草产IAA内生细菌菌株的初步鉴定

扩增测序7株具IAA产生菌株的16S rRNA基因,相似性搜索显示其与NCBI已有序列最高相似性均≥99%。用Neighbor-Joining法构建系统进化树,菌株GF-1、YF-2与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)位于同一分支,菌株GF-2与硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)位于同一分支,菌株GF-8、YF-1与解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)位于同一分支,菌株JF-1与甲基营养型芽孢杆菌(B. methylotrophicus)位于同一分支,菌株JF-8与唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)位于同一分支(图 6)。

图 6 三叶鬼针草产IAA内生细菌菌株16S rRNA基因Neighbor-Joining进化树 Figure 6 Neighbor-Joining phylogenetic tree of IAA-producing bacterial endophytes isolated from B. pilisa based on the 16S rRNA genes sequences 注:分支上的数据表示自展1 000次的支持百分率;括号内为GenBank序列号;标尺参数表示进化距离. Note: Numbers at each branch point indicate the percentage supported by bootstrap values based on 1 000 replications. GenBank accession numbers are shown in the parentheses. The scale bar indicates 0.05 substitutions per nucleotide position.
3 讨论与结论

本研究利用MiSeq高通量方法HiSeq从三叶鬼针草根、茎、叶、种子4个不同组织共获得36 617条细菌16S rRNA基因V3−V4区有效序列,4 193个OTU (表 1)。虽然得到的OTU中有平均近50%不能在目、科、属水平上归类,但已归类的OTU分属76个不同的细菌目、182个不同的细菌纲和536个不同的细菌属,说明该植物内生细菌群体具有丰富的种群多样性和遗传多样性。三叶鬼针草4个组织中共有的OTU仅12个,代表各组织内生细菌群体门、纲和属水平上群体组成的NMDS斑点也明显分开(图 4),说明该植物不同组织内生细菌群落组成存在明显差异。三叶鬼针草可产生多种能抑制微生物或其他植物生长的化感物质,而且这些化感物质的种类和含量随组织而异[19-20],这可能是该植物不同组织内生细菌群体种群组成存在差异的重要原因之一。

种群归类结果显示变形菌门是三叶鬼针草内生细菌群体最优势细菌门(图 2)。与本论文相似,互米花[8]等入侵植物、水稻[21]、拟南芥[22]、盐生植物盐角草[23]、超富集植物东南景天[24]等内生细菌群体优势细菌门也均为变形菌门,说明变形菌门细菌普遍存在于植物体内。放线菌不仅具有产生多样性活性物质的能力,而且在环境有机质的降解矿化、营养固定、改善环境理化参数等方面也扮演着重要角色[25-26]。本研究结果显示三叶鬼针草内生细菌群体中也含有丰富的放线菌,其中包括了类诺卡氏菌属、小单孢子菌属、短短杆菌属、出芽菌属等许多稀有放线菌属(图 3),这提示三叶鬼针草内生放线菌值得进一步研究。其他已归类的优势细菌属包括假单胞菌属、泛菌属、马赛菌属、不动杆菌属、鞘脂单胞菌属、甲基杆菌属、伯克氏菌属和芽孢杆菌属等,这些细菌属多为广泛报道的具促生抗逆或/和降解环境有毒有害物质的细菌属。如假单胞菌属、芽孢杆菌属、泛菌属、伯克氏菌属是典型的促生细菌,可以通过多种方式直接或间接促进植物生长[27]。马赛菌属的一些菌株具有降解甲苯、三氯乙烯等多种有毒有害物质和促进植物生长的潜力[28-29]。不动杆菌属细菌不仅是典型的脱氮除磷细菌,还能降解各种环境污染物[30-31]。甲基杆菌能在寡营养环境中生长,且大多具有较强的抗辐射和抗渗透压力[32-33]。鞘脂单胞菌不仅可降解多种环境污染物,还能激活植物抗病、抗氧化相关途径[33-34],提示三叶鬼针草内生细菌群体也可能潜在贡献于其宿主的环境适应性和抗病抗逆能力。值得提出的是,本研究结果显示三叶鬼针草含有丰富的不动杆菌,不动杆菌有较强的耐药性,是医院感染的重要致病菌之一[35]。最近有学者指出不动杆菌等多抗药菌以植物作为载体进行传播可能是威胁人类健康的重要因素之一[36]。在三叶鬼针草防控中应该考虑防止其中可能的内生性多抗药性菌株进入环境。

具有重金属抗性的内生细菌可通过对重金属的直接吸附、吸收和转化来降低重金属对宿主的毒害强度,被认为在协同宿主植物耐受重金属胁迫方面发挥重要的作用[4]。本研究中,34株从三叶鬼针草中得到的内生细菌菌株均对Pb、Cd、Ni、Hg 4种重金属显示出不同程度的耐受能力,其中多个菌株对多种测试重金属具有耐受能力(表 2)。这提示三叶鬼针草对镉、铅等重金属的耐受和富集能力可能与其体内定居的大量重金属抗性细菌有关。IAA不仅可直接促进植物生长,也是介导植物与环境、植物与微生物互作的重要信号分子[37]。IAA在植物抗重金属胁迫中也发挥重要作用,外源添加IAA可通过对生长、细胞结构和根系构建、活性氧状态等的调节,及对重金属的络合作用等多种方式提高受体植物重金属耐受能力,这已在多个研究中得到证实[38-41]。本研究从三叶鬼针草中分离得到的34株内生细菌中有7个菌株显示出具有产生IAA的能力,其产率为57.48−312.22 μg/mL (图 5)。在报道的产生IAA内生细菌中,不同菌株的IAA分泌水平有很大差异。例如,姜晓宇等报道水稻种子内生细菌IAA分泌量最高可达269.83 μg/mL[18]。刘琳等从春兰获得57株分泌IAA内生细菌,其IAA产率为0.5−129.68 μg/mL[42]。本研究从三叶鬼针草中分离得到的一些菌株IAA产率远高于其他文献报道菌株。研究也已显示接种具重金属抗性和产IAA的根际及内生细菌能显著提高受体植物对重金属的耐受能力和富集能力[43-44]。本研究中得到的所有IAA产生菌株至少对3种测试重金属具有耐受能力,这些菌株是微生物-植物联合修复重金属污染土壤,特别是复合污染土壤的优良候选菌株。另一方面,并非在某个部位、组织或结构中生长素含量越多,对植物生长和吸收重金属便越有利[38]。虽然从三叶鬼针草中分离到的菌株在体外培养条件下显示了高产IAA能力,这些菌株是否在其宿主或其他植物体内仍能高量分泌IAA,以及如何与宿主协调互作使其内源IAA保持在一个合适的水平有待进一步研究。

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