岩藻多糖主要来源于褐藻^[1]和一些海洋无脊椎动物^[2-3]，由L-岩藻糖和硫酸基团组成，还含有少量的半乳糖、甘露糖、木糖和糖醛酸等，是一种化学组成和结构都十分复杂的海洋多糖。不同来源、不同季节收获的岩藻多糖，其结构和组成也存在差异^[4]。例如，水云目(Ectocarpales)和海带目(Laminariales)的褐藻产生的岩藻多糖主要是由α-L-岩藻糖通过1→3糖苷键连接而成；墨角藻目(Fucales)的褐藻产生的岩藻多糖主链主要是1→3和1→4糖苷键交替连接的α-L-岩藻糖^[5-6]。对1946年采集的克氏海带(Laminaria cloustoni)、阔叶巨藻(Laminaria saccharina)、掌状海带(Laminaria digitata)、齿缘墨角藻(Fucus serratus)、墨角藻(Fucus vesiculosus)分析发现，无论是在柄和叶中，岩藻多糖的组成和含量都有着显著的季节性变化^[7]。研究发现，岩藻多糖具有抗凝血^[8]、抗血栓^[9]、抗癌^[10]、抗炎症和免疫调节^[11]等多种生物学功能，这些生物学活性与岩藻糖的结构有关^[12]。研究发现，与天然岩藻多糖相比，在正常柠檬酸化人血浆的凝血酶原时间加倍时，硫酸化的岩藻多糖显示出高4倍的抗凝血活性^[13]。岩藻多糖降解酶是岩藻多糖的结构研究及其寡聚物的制备不可或缺的工具。

岩藻多糖降解酶来源广泛，已报道从海水、海泥、海藻表面以及以海藻为食的海洋生物消化道中均筛选出岩藻多糖降解酶^{[1, 14-15]}，但主要还是来源于海洋微生物。目前，关于岩藻多糖降解酶的分离和表征只进行了少量研究，对岩藻多糖降解酶结构、底物特异性、裂解糖苷键的类型、催化活性与底物硫酸化程度之间的关系等研究结果较少。本文主要概述了近年来国内外海洋微生物来源的岩藻多糖降解酶的研究。

1 岩藻多糖降解酶的来源

岩藻多糖降解酶主要来源于海洋生物，大部分发现于海洋细菌，如弧菌(Vibrio sp.)^[16-17]、交替单胞菌科细菌(Alteromonadaceae)^[18]、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)^[19]和黄杆菌科细菌(Flavobacteriaceae)^[1]等。少量无脊椎动物^[20]和真菌^[15]也能降解岩藻多糖。

早在1959年，Yaphe等^[21]就发现了可以产生岩藻多糖降解酶的海洋细菌P. atlantica和P. carrageenovora。由于海洋特殊生长环境的影响，在之后的几十年里此类微生物都没有受到研究者关注。直到90年代后，研究者才相继开展了产岩藻多糖降解酶的海洋微生物的筛选工作。Bakunina等报道了具有高效岩藻多糖降解酶活性的海藻细菌，该研究从枯墨角藻(Fucus evanescens)和绳藻(Chorda filum)中筛选出25株附生海洋细菌，从海参(Apostichopus japonicus)中筛选出53株细菌^[22]。表 1概述了部分岩藻多糖降解酶的来源及其天然底物。

2 岩藻多糖降解酶的活性检测

由于岩藻多糖结构较为复杂，单一的检测手段往往不能有效反映酶解情况。因此，在以往的研究中，根据总糖量或还原糖含量的变化、酶解产物分子量和电荷差异等，建立了多种岩藻多糖降解酶活性检测的方法。以下介绍几种常用的酶活性检测方法。

苯酚硫酸比色定糖法。在以岩藻多糖为唯一碳源的液体培养基中培养微生物，若反应体系中总糖含量下降，说明岩藻多糖被降解成低分子量的糖供微生物利用，则微生物具有降解岩藻多糖的能力，进而实现岩藻多糖降解酶的筛选^{[18, 24, 32]}。在待测样品中加入苯酚和浓硫酸后与糖反应产生橘黄色化合物，再以比色法检测490 nm处的吸光值，进而反映体系中的总糖含量。该方法简便易行、快速有效、适用于各种糖的测定。

还原糖含量测定法。多糖水解酶的活性通常是通过测量水解过程中产生的单糖和寡糖的还原糖量来确定^[33-34]。Kim等^[35]通过Somogyi-Nelson比色法^[36]筛选到产岩藻多糖降解酶的微生物，但该方法在一些研究中是不成功的^[37]，即通过电泳法检测到岩藻多糖被有效降解，但Somogyi-Nelson比色法测量的溶液还原能力接近于零，这一结果可能与水解后得到的寡糖产物的化学结构有关。

琼脂糖凝胶电泳法。Bilan等^[25]用Littorina kurila的岩藻多糖降解酶处理来自Fucus distichus的岩藻多糖，然后将酶解产物进行琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖浓度为0.6%，电极缓冲液为50 mmol/L 1, 3-丙二胺乙酸pH 9.0，110 V电泳1 h。电泳结果检测到不同分子量和不同电荷的寡糖，该方法操作快速、简单，可用于分离多糖复合物^[38]。

白蛋白浊度法。Colin等^[37]通过比浊法分析菌株的岩藻多糖降解酶活性，将菌株置于液体培养基中生长1-7 d。加入酸性牛血清白蛋白(BSA)溶液，BSA和高分子量岩藻多糖形成不溶性复合物，但与寡糖不能形成复合物，通过检测培养混合物的浊度变化来评估菌株的岩藻多糖降解酶活性。白蛋白浊度法对岩藻多糖降解酶的降解效率要求较高，在多数情况下可能并不适用。

菌落透明圈观察法。Silchenko等^[39]开发了一种用岩藻多糖琼脂糖平板和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)染色来筛选和检测岩藻多糖降解酶活性的方法。CTAB是一种阳离子去污剂，可以与岩藻多糖形成白色水不溶性盐，酶促降解的岩藻低聚糖具有低电荷密度而不会被CTAB沉淀，因此通过观察菌落出现的透明圈可以分析岩藻多糖降解酶的活性，该方法对岩藻多糖降解酶的降解效率的要求也较高。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)。碳水化合物的电泳通常称为碳水化合物聚丙烯酰胺凝胶电泳(C-PAGE)。在电泳之前通过冷冻或者加热终止酶促反应，上样缓冲液为甘油10%、酚红0.02%，浓缩胶为5% (质量体积比)丙烯酰胺，其缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，分离胶为27% (质量体积比)丙烯酰胺，其缓冲液为150 mmol/L Tris-HCl pH 8.8。染色液为邻甲苯胺蓝0.01% (质量体积比)，无水乙醇:醋酸:水=2:1:1 (体积比)；或者阿利新蓝结合银染进行染色^[40]，电泳图上的多条带对应于带负电的寡糖。该方法是鉴定岩藻多糖酶解产物最常用的方法^{[1, 41]}，但缺点是耗时。

荧光辅助糖电泳法(FACE)。该方法是对C-PAGE的调整，通过还原胺化反应，引入单一荧光团或发色团来获得还原末端衍生物，可定量估计反应混合物中的碳水化合物^[42]。各种芳香伯胺已被用于标记酶解产物，聚磺酸衍生物如8-氨基-1, 3, 6-萘三磺酸(ANTS)^[43]和8-氨基-1, 3, 6-芘三磺酸(APTS)^[44]的多重负电荷决定了它们的电泳迁移率，常被用于标记岩藻寡糖进行电泳分析。该方法的优点是极高的灵敏度和良好的分辨率，允许定量分析低分子量产物(LMWP)的含量，但缺点是昂贵且耗时。

综上所述，各种酶活检测方法的联合使用及开发新型的酶活检测方法，将有利于更多新型岩藻多糖降解酶的筛选和鉴定。

3 酶的作用方式和特异性

岩藻多糖的结构与组成比较复杂，根据作用方式岩藻多糖降解酶主要分为：岩藻多糖酶(Fucoidanase，EC 3.2.1.44)、α-L-岩藻糖苷酶(Fucosidase，EC 3.2.1.51)和硫酸酯酶(Sulfatase，EC 3.1.6)，在它们的协同作用下，共同完成岩藻多糖的降解。

岩藻多糖酶属于内切酶，从糖链的内部或边缘水解硫酸化或未硫酸化的岩藻糖苷键，产生不同聚合度的寡糖，大多数已知的岩藻多糖降解酶是内切酶^{[1, 25, 35, 37, 45-48]}。为了确定岩藻多糖降解酶的底物特异性，通常使用具有已知结构的各种底物。Colin等^[37]使用鹿角藻(Pelvetia canaliculata)的岩藻多糖作为底物，该底物是由重复的二糖单位构建而成的，即通过交替的α-1→3和α-1→4糖苷键连接的硫酸化岩藻糖残基构成：[3)-α-L-Fucp-(2OSO₃^-)-1→4-α-L-Fucp-(2, 3OSO₃^-)-(1→]n。通过核磁共振谱比较天然岩藻多糖和酶解产物，结果显示来自Mariniflexile fucanivorans SW5^T的岩藻多糖降解酶主要作用于[3)-α-L-Fucp-(2OSO₃^-)-1→4-α-L-Fucp-(2, 3OSO₃^-)-(1→]的α-1→4糖苷键。

岩藻糖苷酶属于外切酶，从多糖的非还原末端水解α-L-岩藻糖苷键，释放岩藻糖。来自海洋弧菌Vibrio sp. N-5的3个酶E1、E2、E3可以迅速降解来自厚叶解曼藻(Kjellmaniella crassifolia)的岩藻多糖^[16]，通过凝胶过滤和薄层层析分析，主要产物是硫酸化岩藻糖，由此说明这3种岩藻多糖降解酶均是外切酶。

硫酸酯酶主要负责岩藻多糖中硫酸基团的水解作用。硫酸酯酶的脱硫作用能极大地简化和促进像岩藻多糖这样复杂分子的结构研究。然而，关于岩藻多糖硫酸酯酶的报道较少。Furukawa等^[17]报道了来源于海洋细菌Vibrio sp. N-5的硫酸酯酶，通过形成BaSO₄的浊度测定法进行酶活检测，该酶具有广泛的底物选择性，可以降解Gagome (海带)-、Mozuku (海发菜)-和Futomozuku (海藻)-岩藻多糖释放硫酸基团。表 2概述了部分岩藻多糖降解酶的理化性质和降解底物特异性。

岩藻多糖降解酶的底物特异性不仅表现在可裂解键的类型，还与硫酸基团、乙酰基的位置有关。来自F. algae KMM 3553^T (FFA)^[47]的岩藻多糖降解酶不能降解来自Saccharina cichorioides (糖海带)的仅由α-1→3糖苷键组成的岩藻多糖，而可以降解来自F. evanescens和F. vesiculosus的由α-1→4和α-1→3糖苷键交替连接的岩藻多糖，因此，酶FFA具有α-1→4糖苷键特异性。以脱硫酸岩藻多糖作底物时，寡糖产量更低，而以脱乙酰化的岩藻多糖作底物时，寡糖产量增加，说明硫酸基团和乙酰基对FFA的活性至关重要，很可能是因为它们影响了酶和底物之间的结合。

此外，部分裂解酶也参与岩藻多糖的降解。Sakai等^[46]报道了来自海洋细菌Fucobacter marina SA-0082的胞外酶可以降解来自褐藻Kjellmaniella crassifolia的岩藻多糖链[→4-D-GlcpUAβ-1→2(L-Fucp(3-O-sulfate)α-1→3)D-Manpα1-]n中D-Manp和D-GlcpUA之间的糖苷键。

由表 2及以上综述可知，目前研究者只表征了岩藻多糖降解酶的基本理化性质和产物特异性，对其结构与功能的研究还不够深入，因此，后续还需进一步研究其催化机理。

4 酶的应用 4.1 制备岩藻寡糖

岩藻多糖具有多种生物学活性，正成为新一代天然功能保健食品、药物和化妆品开发的新宠。在医药保健品方面，国内外以岩藻多糖为原料开发上市的商品中，日本“Power Fucoidan Gold”产品对抗肿瘤效果较佳；Doctor Best公司生产的“Best Fucoidan”具有强抗氧化/增强免疫的功能；中国吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司生产的海昆肾喜胶囊，主要功效是化浊排毒，用于慢性肾功能衰竭。在化妆品领域，北京雷力联合海洋生物公司开发的海洋传奇系列保湿面膜、保湿水等化妆品，主要成分就是岩藻多糖功能活性因子。研究表明，岩藻多糖的生物学活性与其结构、硫酸根含量及其位置有关^[12]，而岩藻多糖的结构差异、高分子量和粘性等限制了其应用^{[47, 53]}，尤其是作为治疗剂的应用，具有较低分子量的生物活性低聚糖将有助于克服这些问题^{[6, 54-55]}。而岩藻多糖降解酶可以特异地降解岩藻多糖，并且酶解反应可控、反应条件温和、获得的产物均一、不会发生副反应等，因此岩藻多糖降解酶是制备特定岩藻寡糖最理想的工具。

4.2 岩藻多糖结构分析

岩藻多糖的化学组成和糖基连接方式多样，导致其结构复杂，而岩藻多糖降解酶可作用于特定的糖苷键，与红外光谱、气质联用和核磁共振等方法联合使用是推断岩藻多糖结构的有效手段。来自海洋细菌Flavobacteriaceae CZ1127的岩藻多糖降解酶^[56]，通过酶水解制备海参(A. molpadioides)岩藻多糖的寡糖产物，经液质联用(LC-MS)纯化到水解产物中的4种主要寡糖，通过核磁共振验证了寡糖的精细结构为：α-L-Fucp-1→ 3-α-L-Fucp(2, 4OSO₃(2-))-1→3-α-L-Fucp，α-L-Fucp-1→ 3-α-L-Fucp(2, 4OSO₃(2-))-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp，α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp(2, 4OSO₃(2-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp(2, 4OSO₃(2-))-1→3-α-L-Fucp和α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp (2, 4OSO₃(2-))-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp(2, 4OSO₃(2-))-1→3-α-L-Fucp- 1→3-α-L-Fucp。

因此，寻找降解岩藻多糖的新型酶已受到学术研究人员和工业界人士的广泛关注。新型岩藻多糖降解酶的发掘及作用机理的阐明，不仅可以推动岩藻多糖的结构与生物活性之间关系的研究，还可以改进低聚岩藻多糖的工业生产技术。

5 岩藻多糖降解酶的基因鉴定

到目前为止，虽然有数个关于岩藻多糖降解酶的报道，但编码岩藻多糖降解酶的基因知之甚少，而且均未见相关酶的催化机制及三维结构的报道。

岩藻多糖酶是岩藻多糖降解中的关键酶，也是当前岩藻多糖酶研究中的热点和难点。已报道的岩藻多糖酶的基因序列包括FcnA (GenBank登录号CAI47003.1)、Fda1 (GenBank登录号AAO00508.1)、Fda2 (GenBank登录号AAO00509.1)、SVI_0379 (GenBank登录号BAJ00350.1)和ffa1 (GenBank登录号WP_057784217.1)，其中基因FcnA和ffa1已经实现了体外重组表达。

2006年，Colin等^[37]描述了来自海洋细菌M. fucanivorans SW5^T的岩藻多糖降解酶FcnA的基因。通过硫酸铵沉淀、离子交换、凝胶过滤和SDS-PAGE获得该蛋白，并通过Edman降解法获得其氨基酸序列，然后克隆FcnA的基因并测序，通过大肠杆菌原核表达获得具有较高活性的重组蛋白，该酶显示为内切型α-L-岩藻多糖降解酶，是新的GH家族GH107的第一种酶。

对海洋细菌F. algae KMM 3553^T (GeneBank登录号PRJNA 299442)基因组的分析，已发现岩藻多糖降解酶基因序列的存在^[41]。通过RAST服务器使用pBLAST对F. algae蛋白数据库进行岩藻多糖降解酶基因的预测，与FcnA (GenBank登录号CAI47003.1)、Fda1 (GenBank登录号AAO00508.1)、Fda2 (GenBank登录号AAO00509.1)和SVI_0379 (GenBank登录号BAJ00350.1)的基因序列比对，在海洋细菌F. algae KMM 3553^T的基因组中鉴定了岩藻多糖降解酶的基因ffa1 (GenBank登录号WP_057784217.1)，序列分析显示岩藻多糖降解酶FFA1属于GH107家族。此外，该研究团队于2018年1月分析了具有岩藻多糖降解酶活性的海洋细菌F. algae KMM 8021^T (GeneBank登录号PRJNA224116)的基因组。

近几年，组学技术得到了快速发展，并已成功地应用于其他海洋多糖降解酶的发掘。如基于组学技术，建立了海洋菌株Alg07的褐藻降解模型^[57]。该研究对分离鉴定的海洋菌株芽孢杆菌Bacillus weihaiensis Alg07的基因组进行从头测序，基因注释和碳水化合物活性酶的分析结果表明，该菌株含有可完全降解褐藻胶和昆布多糖的酶，还发现了利用甘露醇的蛋白编码基因。为了解B. weihaiensis Alg07分解褐藻的过程，进行了RNA-Seq转录组分析和qRT-PCR。参与褐藻胶代谢的基因在褐藻降解的初始阶段都被上调表达，这表明菌株Alg07首先降解褐藻胶以破坏细胞壁，使得昆布多糖和甘露醇释放并随后分解，并因此发现了新的褐藻胶裂解酶和昆布多糖酶。

随着高通量DNA测序技术的快速发展，越来越多的物种完成了基因组测序和基因功能注释。与传统的蛋白质提取相比，组学研究可以更精确地发现新型岩藻多糖降解酶。

6 结论和展望

岩藻多糖是海洋环境中特有的一类多糖，具有多种生物学活性，在医药卫生、食品保健等领域具有广阔的应用前景。岩藻多糖降解酶是深入开发岩藻多糖资源必不可少的工具。目前，岩藻多糖降解酶的研究较少，在国内外市场上岩藻多糖降解酶的酶制剂严重缺乏。而且，研究者只表征了岩藻多糖降解酶的基本生化性质，对其具体催化机理，结构与功能的关系研究还不够深入，阻碍了岩藻多糖活性物质的开发和应用。因此，继续发掘新型岩藻多糖降解酶，仍是今后的一个研究方向。

随着基因组测序技术的快速发展，获得了越来越多的微生物基因组信息，为新型岩藻多糖酶的发掘提供了基础。此外，结合结构生物学技术(晶体学与NMR)，可从分子水平上阐明酶的作用机制。X-射线晶体学技术应用最广泛，可用于研究酶与底物的复合物结构，分析酶与底物的结合口袋中参与底物结合及催化的关键氨基酸；结合定点突变技术，可以研究关键氨基酸对酶活及底物结合特异性的影响。研究酶结构与功能之间的关系，揭示酶的作用机理，有助于进一步挖掘岩藻多糖和岩藻多糖降解酶的应用潜力。