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文章信息
- 田甜, 望克英, 梁广钰, 金玉勃, 李晶, 邵萱萱, 徐仰仓
- TIAN Tian, WANG Ke-Ying, LIANG Guang-Yu, JIN Yu-Bo, LI Jing, SHAO Xuan-Xuan, XU Yang-Cang
- 固定化过程对聚球藻生理生化特性的影响
- Effects of immobilization process on physiological and biochemical characteristics of Synechococcus
- 微生物学通报, 2018, 45(9): 1972-1979
- Microbiology China, 2018, 45(9): 1972-1979
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180433
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文章历史
- 收稿日期: 2018-05-31
- 接受日期: 2018-08-01
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2018-08-07
2. 天津市海洋资源与化学重点实验室 天津 300457
2. Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry, Tianjin 300457, China
聚球藻(Synechococcus)是一类生长于海水中的单细胞蓝细菌,广泛分布于地球各大海洋中,是海洋碳循环和初级生产力的主要贡献者之一,在海洋生态系统的光合作用、碳循环及食物链中扮演着十分重要的作用[1]。聚球藻因生长迅速、生命周期短、能迅速利用环境中的营养物质且能进行光合作用,被认为是一种良好的污水净化生物,可用于废水的净化处理[2]。但聚球藻的个体大小在2 µm之下[1],净化污水后需要收集聚球藻,这增大了净化污水的成本。细胞固定化技术是利用物理或化学的方法将生物细胞固定在某一特定空间内,使其既不溶于水又能保留生物细胞固有的活性,从而能重复连续使用的生物工程技术。因此,可利用细胞固定化技术降低聚球藻净化污水的成本。已有利用固定化聚球藻净化污水的研究报道[3],但聚球藻固定化后,细胞内的生理生化变化尚未见报道。另外,陈丽萍等[4]发现小球藻、栅藻固定化后净化人工污水的能力高于游离藻,聚球藻固定化后净化污水的能力发生的变化也未见报道。本文研究聚球藻固定化后生理生化的变化以及净化污水能力的变化。
1 材料与方法 1.1 材料聚球藻7002 (Synechococcus sp. PCC 7002)是本实验室保存种。养殖废水取自天津大港某红鳍东方鲀养殖公司。
1.2 主要试剂和仪器聚乙烯醇购自Amresco公司;海藻酸钠、丙酮、磺胺、α-萘胺和氯化钙均为国产分析纯;NADH、磷酸肌酸、磷酸肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油醛脱氢酶和PMSF均购自Sigma-Aldrich公司。光照培养箱,宁波市科技园区新江南仪器有限公司;生物显微镜,麦克奥迪实业集团有限公司;紫外可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;溶解氧测定仪,北京东南仪诚实验设备有限公司;荧光分光光度计,上海天美科学仪器有限公司;酸度计,上海精密科学仪器有限公司。
1.3 聚球藻培养采用BG-11含氮培养基培养[5],接种量为5%左右(藻密度约为2×106个/mL),将聚球藻放入恒温光照培养箱中培养,培养条件:光照4 000−4 500 lx,温度25±2 ℃。
1.4 聚球藻的固定化及去固定化将含2×106个/mL聚球藻、4%海藻酸钠和2%聚乙烯醇的混合溶液1,滴入由3%硼酸溶液和2%氯化钙组成的混合液2中,室温下静置2 h,形成固定化小球。然后将固定化小球在BG-11含氮培养基、4 000−4 500 lx光照强度、25±2 ℃下培养8 d,每天取相同数量的固定化藻珠放入0.50 mol/L pH 6.50的NaH2PO4溶液中,振荡至藻珠完全溶解,检测释放的藻细胞的各项生理生化指标。
1.5 生长速率测定采用显微镜观察计数法,根据公式(1)计算藻细胞的比生长速率[6]。
(1) |
µ是比生长速率,C是对应T时间的细胞数量。
1.6 叶绿素a含量取10 mL藻液过0.22 µm的膜,膜称重后用10 mL 95%丙酮洗脱膜上的藻,4 ℃提取藻中的叶绿素24 h,分别测定提取液在664、647、630 nm处的吸收值。根据公式(2)计算叶绿素a含量。
(2) |
其中,V是提取液体积(mL),n是稀释倍数,m是样品鲜重(g)。
1.7 硝酸还原酶活性测定藻液于8 000 r/min下离心5 min得沉淀,加5 mL提取液(25 mmol/L的磷酸缓冲液中含12.1%的半胱氨酸和3.7%的EDTA,pH 7.8)于沉淀中,在冰浴中研磨后4 ℃、8 000 r/min离心15 min,上清液即为酶提取液。取酶提取液1 mL加入2 mg/mL的NADH溶液1 mL和0.10 mol/L的KNO3溶液4 mL,25 ℃下保温30 min。加入1%磺胺溶液2 mL和0.20% α-萘胺溶液2 mL显色15 min,之后在4 ℃、8 000 r/min下离心15 min,上清液于520 nm处测定光吸收值。硝酸还原酶的活性定义为每小时每毫克蛋白的藻生成NO2−的量[µg NO2−/(h·mg protein)]。
1.8 净光合速率测定利用JPSJ-605F型溶解氧测定仪测定藻液中的氧气含量,聚球藻的净光合速率按公式(3)计算:
(3) |
式中,Chla是叶绿素a的浓度(mg/L),t是持续时间(h),ΔDO是一段时间内溶解氧变化的差值(mg/L)。
1.9 Rubisco活性测定参照Lilley等[7]方法略加改动。将2 g收集的聚球藻置于pH 7.8的Tris-HCl缓冲液,冰浴研磨,匀浆液于4 ℃、10 000 r/min离心20 min。弃沉淀,上清液为待测酶液。反应液总体积为3 mL,反应液中含有:90 µmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7.8),10 µmol/L MgCl2,0.36 µmol/L EDTA,0.30 µmol/L NADH,5 µmol/L ATP,7.50 µmol/L Cr-P,20 µmol/L NaHCO3,过量的磷酸肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶。取0.50 mL待测酶液,在25 ℃保温10 min,加入终浓度为3.75 µmol/L的RuBP溶液,每30 s测定一次340 nm下的吸光度,以1 min内的吸光度变化计算酶活力。
1.10 NO含量的测定采用DAN荧光分光光度计法[8],取聚球藻藻液在10 000 r/min下离心10 min得藻泥,用50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)冲洗3遍,然后加入溶液[50 mmol/L pH 7.5的Tris/HCl,1 mmol/L EDTA,2 mmol/L Dithiothreitol (DTT),0.5% (体积比) Triton X-100,1 mmol/L PMSF,10% (体积比)甘油],反复冻融后加入2 mL 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4),13 000 r/min离心15min。上清液用允许30 kD以下分子通过的滤膜超滤,取滤液1 mL,加入60 µL硝酸还原酶和NADH的混合物,25 ℃反应60 min,然后加入100 µL EDTA (0.50 mol/L)和120 µL DAN,室温反应10 min,最后加入60 µL NaOH和2 660 µL蒸馏水至4 mL。在EX 365 nm、EM 405 nm、灵敏度3、狭缝10 nm的条件下,以蒸馏水为本底测定荧光值。根据标准曲线得出NO的含量。
1.11 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。取藻提取液1 mL,加入考马斯亮蓝G250 (0.01%) 4 mL,混匀,室温静置3 min,于波长595 nm处测吸光值。以牛血清蛋白为标准蛋白制作标准曲线,根据标准曲线得出蛋白质的含量。
1.12 水质指标测定废水中总氮、总磷、氨氮、硝氮、亚硝氮、COD的测定参照《水和废水监测分析方法》[9]。
2 结果与分析 2.1 固定化过程对聚球藻生长速率的影响BG-11是聚球藻的常用培养基,如图 1所示,游离聚球藻在BG-11培养基中呈现“S”型生长趋势。培养至第5天时,培养液中藻细胞数量的增加变缓,游离聚球藻的最大比生长速率为0.74,最大藻密度为9.8×108个/mL。聚球藻固定化后,生长曲线也呈“S”型,但开始快速生长的时间比游离藻晚1 d,培养液中藻细胞数量达到最大值的时间也晚1−2 d。固定化聚球藻的最大比生长速率为0.56,最大藻密度为8.8×108个/mL。说明聚球藻固定化后生长速率、最大密度都有所降低。
2.2 固定化过程对聚球藻净光合速率的影响净光合速率指单位时间内植物的总光合放氧量除去呼吸消耗氧量。如图 2所示,在光照强度低于5 000 lx时,游离聚球藻的净光合速率随着光照强度的增大而增加;若再增大光照强度,则游离聚球藻的净光合速率开始下降,说明在本实验条件下,游离聚球藻的光饱和点为5 000 lx,超过此值,光合作用会发生光抑制现象;聚球藻固定化后,净光合速率也随着光照强度的增大而增加,当光照强度超过6 000 lx时,固定化聚球藻的净光合速率增长变缓,但未出现明显的光抑制现象。不论是低光照(1 000 lx)还是高光照(7 000 lx),固定化过程均降低了聚球藻的净光合速率,在5 000 lx时,降幅最大为29.10%。
2.3 固定化过程对聚球藻叶绿素含量的影响如前所述,聚球藻固定化后净光合速率降低了,固定化材料对光线的遮挡可能是导致其降低的原因之一,除此之外,我们探讨了引起光合作用变化的其它原因。首先检测了叶绿素含量的差异,如图 3所示,游离聚球藻和固定化聚球藻在叶绿素含量方面没有大的差别,接种起初,游离藻细胞中的叶绿素含量略高于固定化的藻细胞,但二者没有统计意义的差别;培养5 d后,固定化藻细胞中的叶绿素含量略高于游离藻细胞。说明净光合速率的差异与叶绿素含量的差异关系不大。
2.4 固定化过程对聚球藻Rubisco活性的影响Rubisco是光合作用暗反应的关键酶,是一种含量较高的可溶性蛋白,可催化RuBP与CO2反应,Rubisco的催化效率较低且受多种内外因子的调控。如图 4所示,固定化聚球藻的Rubisco活性仅为游离聚球藻的74.30%。如果在BG-11培养基中添加终浓度为100 µmol/L的cPTIO (一种NO的清除剂),则游离聚球藻内的Rubisco活性降为原来的57.10%,说明减少聚球藻体内的NO含量可以降低其Rubisco的活性。如果在BG-11培养基中添加终浓度为100 µmol/L的SNP (一种NO的释放剂),则固定化聚球藻体内的Rubisco活性升为原来的142.30%,这再一次说明NO具有刺激Rubisco活性的功能,这一结果与Per等[10]的结果一致。如前所述,Rubisco是一种可溶性蛋白,其活性的调控可通过两种途径:增减基因的表达量和对已有酶蛋白进行转录后修饰。为了确定NO是在哪个水平调控聚球藻Rubisco的活性,我们进行了体外试验。收集在对数生长期的聚球藻,离心提取Rubisco,之后在反应液中加入50 µmol/L的cPTIO或50 µmol/L的SNP,分别检测Rubisco的活性,结果发现cPTIO使酶活性降低51.40%,而SNP使酶活性增高48.60%,说明NO是通过蛋白的转录后修饰调节Rubisco活性的,这一结果与Abat等[11]在Kalanchoe pinnata中得到的结果一致。
Rubisco是植物体内含量最丰富的蛋白质,但是由于体内有RuBP等抑制物的存在,其活性会变得较低。植物体内的Rubisco只有经过活化之后才能催化底物发生反应。Rubisco的体外活化依赖于pH值、CO2浓度以及Mg2+等,体内活化主要通过Rubisco活化酶(Rubisco activase)。Rubisco活化酶与Rubisco结合后改变了后者的结构,使其变构为有利于同底物结合的结构形式[12]。由此可见,体内Rubisco的活性受控于Rubisco活化酶。Khairy等[13]以烟草为对象研究了Rubisco和Rubisco活化酶的活性与NO的关系,当烟草受到重金属Cu和Cd胁迫的时候,体内的Rubisco和Rubisco活化酶活性均降低了,但用SNP处理时发现Rubisco和Rubisco活化酶活性均提高了。说明烟草体内的Rubisco和Rubisco活化酶活性均受NO的正调节。
2.5 固定化过程对聚球藻NO含量的影响如前所述,NO可以调控聚球藻体内Rubisco的活性。为此,检测了聚球藻固定化后体内NO含量的变化。如图 5所示,固定化使聚球藻体内的NO含量降低了31.20%。
Sakihama等[14]研究了一氧化氮合酶(NOS)是否参与藻体中NO的合成,无论向藻液中加入NOS的底物还是抑制剂,均未发现NO的产生,推测微藻体内不存在类似动物体中NOS催化合成NO的途径。在黑暗条件下,当向藻液中加入NO2−时会有NO的产生,而且产生的NO浓度与加入的NO2−浓度成正比;当加入氰化钾(NR的抑制剂)后,藻液中观察不到NO的产生;另外用绿藻的NR缺失变异体代替原有的绿藻进行实验也没有发现NO产生,因此推测NR是绿藻产生NO的唯一途径。由于固定化聚球藻的NO含量低于游离聚球藻,推测固定化过程可能影响了硝酸还原酶的活性。
2.6 固定化过程对聚球藻硝酸还原酶活性的影响硝酸还原酶(NR)是植物氮代谢的关键酶和限速酶[15]。如图 6所示,聚球藻固定化后,NR活性降低了40%,说明固定化过程抑制了NR的活性。NR是一种诱导酶,多种因素如光、硝酸盐、金属离子等都能影响其活性[16-17]。聚球藻固定化过程中,海藻酸钠与氯化钙形成的海藻酸钙沉淀在一定程度上遮挡了光线,致使固定化小球内部的光线较弱。固定化藻株接收的光线少于游离藻,这在一定程度上降低了后者对NR的诱导能力,或许这是固定化聚球藻NR活性低于游离藻的原因之一。在生物体内硝酸还原酶催化NO3−生成NO2−,NO2−进一步在亚硝酸还原酶的作用下生成NH4+。另外NO2−还可转变为NO,NO是一种极易扩散的第二信使信号分子,参与多种酶的后修饰,在动物、植物和藻类的生理活动中发挥着重要的作用。
2.7 固定化过程对聚球藻净化养殖废水能力的影响分别将游离聚球藻和固定化聚球藻接种于红鳍东方鲀养殖废水中(最终密度为2×105个/mL),培养到第4天时,检测养殖废水的各指标。如图 7所示,游离聚球藻在清除总氮、总磷、氨氮及亚硝酸盐方面优于固定化聚球藻,后者在清除硝酸盐及COD方面与游离聚球藻相差不大。这与陈丽萍等[4]的研究结果相反。聚球藻被固定化后,外界光线不能很好地照射到聚球藻,特别是处于胶球内部的聚球藻经常处于光饥饿状态,致使光合速率降低,不能为其它代谢提供足够的能量,致使生命活动有所降低。另外,虽然通过条件优化获得了固定聚球藻的最佳条件,胶球的传质阻力达到了最低,但海藻酸钠、聚乙烯醇等化合物在一定程度上仍然阻碍着物质的自由出入,致使固定化聚球藻不能自由地与周围环境进行物质的交换。这些因素可能是游离聚球藻净化污水的能力高于固定化聚球藻的原因所在。尽管如此,固定化聚球藻对NH4+-N、TP、NO2−-N、COD的去除率仍在50%以上,分别为71%、65%、52%、60%。在一个长的时间尺度上,固定化聚球藻可以反复使用,而且极大地降低了收藻的难度,因此,固定化聚球藻在工业化净化养殖污水方面仍有光明的前景。
3 讨论与结论本试验以聚球藻7002为对象,研究了固定化过程对藻生理特性的影响。结果表明,固定化减缓了聚球藻的生长速率。为了探讨固定化过程抑制聚球藻生长的机理,我们比较了游离和固定化聚球藻的净光合速率,结果发现固定化过程抑制了光合作用,不同光照强度下抑制程度不同,最大抑制率为29.10%。说明固定化后聚球藻合成的糖类物质较少,无法为藻的快速生长提供充足的能量,从而使其生长速率降低。虽然固定化过程抑制了藻的光合速率,但却提高了耐受强光的能力,在较高的光照强度下固定化聚球藻不会发生光抑制现象。叶绿素是光合作用的基础,比较游离和固定化聚球藻的叶绿素含量时,发现二者没有明显的差异。说明固定化过程抑制光合作用的机理与叶绿素含量无关。
Rubisco是光合作用暗反应的关键酶,固定化过程使该酶的活性降低25.70%,这可能是固定化过程抑制光合作用的原因之一。Rubisco是植物体内含量最丰富的蛋白质,其体内的Rubisco只有经过活化之后才能催化底物发生反应,Khairy等[13]以烟草为对象研究了Rubisco和Rubisco活化酶的活性与NO的关系。发现NO能提高Rubisco和Rubisco活化酶的活性。本实验发现NO能提高聚球藻Rubisco的活性,而且通过转录后修饰的方式刺激Rubisco的活性。NO是生物体内的一种信号分子,参与生物的生长、发育、代谢等多项生理过程的调控[18]。比较游离和固定化聚球藻体内NO含量的差异可以发现,固定化过程减少了聚球藻NO的含量。生物体内有多条合成NO的途径,其中NR途径是光合生物合成NO的主要途径[19],本实验发现固定化过程能抑制聚球藻NR的活性。综上所述,固定化过程抑制了聚球藻NR的活性,使其产生了较少的NO,NO通过转录后修饰的方式降低了光合作用关键酶Rubisco的活性,Rubisco的活性降低使光合效率降低,合成较少的能源物质,最终使藻细胞的生长速率降低。
生物对污水的净化本质是吸收或吸附水体中的污染物,如氨氮、总磷、COD、重金属等,固定化过程使聚球藻对养殖废水中的主要污染物总氮、总磷、氨氮、亚硝氮的吸收能力降低,说明固定化过程降低了聚球藻净化养殖废水的能力,这可能与固定化过程降低聚球藻的生长速率有关。然而,固定化聚球藻不但可以反复使用且易于收集,这使固定化聚球藻在工业化净化养殖污水方面有可能优于游离聚球藻。
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