2018, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 曾奇, 仲伟茂, 向瑶, 陈夏雨, 田新朋, 张偲, 王发左
- ZENG Qi, ZHONG Wei-Mao, XIANG Yao, CHEN Xia-Yu, TIAN Xin-Peng, ZHANG Si, WANG Fa-Zuo
- 南海深海沉积物中52株真菌的初步分离鉴定及其代谢产物活性
- Isolation, identification and evaluation of 52 fungi from the deep-sea sediments of South China Sea
- 微生物学通报, 2018, 45(9): 1904-1915
- Microbiology China, 2018, 45(9): 1904-1915
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180090
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文章历史
- 收稿日期: 2018-01-30
- 接受日期: 2018-04-18
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2018-08-02
2. 中国科学院大学 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
深海作为海洋环境中的极端区域，约占海洋总体积的75%，具有低温(部分区域，如热液口为高温)、无光、高压、厌氧、寡营养等特点，拥有集化学物质和微生物于一体的特殊生态环境。特殊的环境决定了孕育于其中的微生物具有一些特异的遗传背景和代谢能力，进而表现在其代谢产物化学结构的多样性、新颖性和生物活性的显著性。研究表明，76%的深海微生物来源天然产物拥有生物活性，50%以上对人类肿瘤细胞株表现出显著的细胞毒活性[1-4]。
真菌作为深海环境中重要微生物类群之一，因其代谢产物结构和活性多样、创新指数高、成药性强、产量大等特点，近年来倍受研究者关注，已成为海洋天然产物研究的焦点[5-6]。早在1964年，Roth等[7]就从4 450 m深大西洋海底沉积物中分离报道了深海真菌的存在。此后，随着深海采样和微生物分离培养技术的进步，不同深海海域来源真菌的报道不断出现，如南海沉积物[8-9]、马里亚纳海沟[10]、太平洋沉积物[11-12]、印度中部盆地[13-14]等。然而，相比细菌、古菌和放线菌，对深海来源真菌研究的报道仍然较少，并且研究多集中在分离培养、多样性调查、功能基因鉴定和适应机制等方面[15]，关于活性次级代谢产物相关研究起步晚，报道更少。2004年，Gautschi等[16]首次报道了深海沉积物来源真菌Penicillium corylophilum的次级代谢产物。随后，一系列结构新颖、具有良好生物活性的深海来源真菌次级代谢产物被逐步发现报道。据统计，2009年底报道的深海来源真菌的新次级代谢产物为36个[17]，2017年底也仅累积达到240个左右[18-20]，深海活性真菌筛选及其次级代谢产物研究潜力巨大。
南海作为我国面积最大、最深、地貌最复杂的边缘海，其微生物数量丰富，是研究海洋真菌最理想区域之一[21]。然而目前国内外对该海域真菌多样性及其特性缺乏了解，仅有少数文献对其进行报道[8-9, 22-23]。近年，南海深海来源真菌次级代谢产物报道持续增加，截至2017年底，共计报道新次级代谢产物68个，约占已报道深海真菌新次级代谢产物总数的28.3%，数量远远高于其他海域[18-20]，并且其结构多样性丰富，出新率高，活性相对较好，涉及结构类型主要包括聚酮类[24-25]、生物碱类[26-27]和萜类等[28-29]，活性主要集中在抗肿瘤[26-27]、抗菌[28-29]、抗病毒[25]和抗污损[24-25]等。由此可见，南海深海沉积物真菌是潜在新颖活性物质的重要生产源，具有巨大的开发利用前景。
在前期工作中，我们已从南海及印度洋深海沉积物环境分离筛选到100多株活性真菌资源，并对其中部分重要活性菌株进行了深入的代谢产物化学多样性及活性研究，从中分离报道了一系列结构新颖、生物活性显著的代谢产物[27, 30-31]。作为该项工作的延续，本研究通过对南海深海沉积物环境来源真菌的初步分离鉴定及其次级代谢产物活性初步研究，调查这些菌株次级代谢和活性潜能，旨在筛选和发现潜在的药源真菌，为南海深海真菌资源的进一步开发利用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌株、活性检测指示菌和卤虫本研究于2016年10月，搭乘中国科学院南海海洋研究所“实验1号”综合科学考察船，从南海不同海域利用抓斗式采泥器采集深海沉积物样品13个(表 1)。从上述样品中共分离鉴定得到52株深海真菌，保存于中国科学院海洋微生物研究中心。
| 海域 Sea area |
样品编号 Sample No. |
经度 Longitude |
纬度 Latitude |
水深 Depth (m) |
| 南海北部 Northern of South China Sea |
A | 115°59′54′′ | 21°00′20′′ | 323.0 |
| B | 116°30′07′′ | 20°30′15′′ | 460.0 | |
| C | 116°42′01′′ | 20°17′12′′ | 596.1 | |
| D | 116°38′32′′ | 20°26′56′′ | 610.7 | |
| E | 116°38′02′′ | 20°18′38′′ | 654.5 | |
| F | 117°03′43′′ | 20°04′38′′ | 1 781.0 | |
| 南海中南部 South Central of South China Sea |
G | 113°58′50′′ | 10°17′19′′ | 933.0 |
| H | 117°56′02′′ | 10°01′23′′ | 1 102.0 | |
| I | 117°30′06′′ | 11°38′44′′ | 1 684.0 | |
| J | 114°38′21′′ | 13°08′40′′ | 3 448.0 | |
| K | 116°30′26′′ | 17°58′47′′ | 3 937.0 | |
| L | 118°48′01′′ | 18°17′37′′ | 4 000.0 | |
| M | 114°21′10′′ | 13°30′37′′ | 4 280.0 |
抗菌活性指示菌株为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)，来源于中国科学院海洋微生物研究中心；卤虫卵(Brine shrimp eggs)购于天津丰年水产养殖有限公司。
1.1.2 主要试剂和仪器ITS基因的PCR扩增采用通用引物ITS1 (5′-T CCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′)，由深圳华大基因科技有限公司合成；Premix Taq酶，TaKaRa公司；二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、抗坏血酸(Vc)、氯霉素，Sigma公司；无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等，天津市大茂化学试剂厂。摇床，苏州培美实验设备有限公司；PCR仪，Bio-Rad公司；离心机，Eppendorf公司；酶标仪，TECAN公司；超低温冷冻冰箱，海尔有限公司；高速分散机，IKA公司；双筒解剖镜，奥林巴斯公司。
1.1.3 培养基海洋真菌的分离纯化使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和查氏培养基(CZA)，液体发酵培养使用真菌2号培养基，抗菌实验使用LB培养基。PDA培养基(g/L)：葡萄糖20.0，马铃薯200.0，琼脂15.0，陈海水1.0 L，pH 7.2-7.4；CZA培养基(g/L)：蔗糖20.0，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaNO3 3.0，K2HPO4 1.0，琼脂15.0，陈海水1.0 L，pH 7.4-7.6；真菌2号培养基(g/L)：麦芽糖20.0，味精10.0，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.3，葡萄糖10.0，酵母膏3.0，玉米粉1.0，甘露醇20.0，CaCO3 2.0，陈海水1.0 L，pH值调至6.5；LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，蒸馏水1.0 L，pH值调至7.0。
1.2 方法 1.2.1 海洋真菌的分离和纯化取5 g海泥，加入到45 mL无菌水中，涡旋振荡3 min制成悬浊液，取200 μL海泥悬浊液分别均匀涂布于天然海水配制的PDA和CZA培养基中；待培养基晾干，放入培养箱中，28 ℃培养3-5 d。整个分离过程严格按照无菌操作要求完成。待培养基上长出适合大小的菌落后，挑取单菌落转接于新的上述培养基中，反复转接至纯培养。经过多次转接纯化后的菌株以PDA斜面(4 ℃)、甘油管(-80 ℃，甘油浓度：30%)两种方式保藏于中国科学院海洋微生物研究中心。
1.2.2 菌株的分子生物学鉴定用无菌牙签挑取少量真菌菌丝体，置1.5 mL离心管中，微波法提取真菌基因组DNA[32]。采用真菌通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增分离菌株的rDNA ITS区。PCR反应体系(25 μL)：模板DNA 1 μL，引物(20 μmol/L)各0.5 μL，Premix Taq引物酶12.5 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，产物委托深圳华大基因科技有限公司测序。测序结果在GenBank中进行BLAST分析，检索相似性序列，初步确定分离菌株的种类。
1.2.3 真菌代谢产物粗浸膏的制备将活化后的菌株接种于已灭菌、包含100 mL真菌2号培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min培养7 d。取全部发酵物，超声破碎菌体细胞，按体积比加入2倍量的乙酸乙酯，静置过夜，超声(25 ℃，600 W，30 min)萃取后，25 ℃、5 000×g离心10 min取上清液，减压浓缩至干，精确称重，所得萃取物为供试样品。
1.2.4 抗菌实验采用纸片扩散法[33]，指示菌株有金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。具体步骤为：取供试样品20 mg溶解于1 mL甲醇溶液中，配制成浓度为20 mg/mL待测样品备用。将细菌接种于已灭菌的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养24 h，取1 mL菌液均匀涂布在LB固体培养基上，待菌液完全渗透后，将直径为6 mm的圆形无菌滤纸片均匀铺在平板上。每个纸片上加入5 μL待测样品，阳性对照为氯霉素，空白对照为甲醇溶液。将培养皿置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察抑菌圈大小来确定抑菌活性大小。滤纸片原始直径为6 mm，文中抑菌圈直径均为减去滤纸片之后的值。
1.2.5 卤虫致死实验采用Solis的改良方法[34-35]，利用卤虫致死活性间接来指示代谢产物的细胞毒活性。具体操作为：取供试样品2 mg溶解于1 mL甲醇溶液中，配成浓度为2 mg/mL的母液，然后依次稀释成终浓度为10、100、1 000 μg/mL等一系列浓度；称取100 mg虫卵加入灭菌的400 mL海水中，室温下由气泵缓缓充气，24 h后去除虫卵外壳及未孵化的卵，再孵化24 h备用。每个96孔细胞培养板的小孔中加入100 μL卤虫孵化液，内含卤虫数量约10-15个，制成测试培养板。空白对照组和每个浓度的样品组各设3个平行孔，空白对照组加100 μL海水，样品组加100 μL所需浓度的样品液。室温下培养24 h后用双筒解剖镜观察，计算每孔虫体死亡数和总数，卤虫致死活性用校正死亡率表示，公式如下：
校正死亡率(%)=(对照组存活率-处理组存活率)/处理组存活率×100。
将3个浓度及其对应的校正死亡率输入计算机，用SPSS软件做死亡率-浓度半对数曲线，用3次回归方程计算半致死浓度(IC50)。
1.2.6 DPPH自由基清除实验采用DPPH自由基清除能力来评价发酵产物浸膏的抗氧化活性。用无水乙醇将样品配成浓度为2 mg/mL的母液，依次稀释成终浓度为10、50、100、500和1 000 μg/mL的一系列溶液。样品对DPPH自由基清除能力根据Yen等[36]方法做了一些改良后进行试验，即：Ac=100 μL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液+100 μL乙醇；Ai=100 μL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液+100 μL样品溶液；Aj=100 μL乙醇+100 μL样品溶液。混合均匀后室温于暗处静置30 min，然后在517 nm处测定吸光度，每个样品平行测试3次，按下式计算自由基清除率(K)：
清除率K (%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100
式中，Ai为实验组(样品+DPPH)的吸光值；Aj为空白组(样品+乙醇)的吸光值；Ac为对照组(DPPH+乙醇)的吸光值；用SPSS软件做清除率-浓度半对数曲线，用3次回归方程计算半清除浓度(EC50)，阳性对照为抗坏血酸(Vc)。
2 结果与分析 2.1 海洋真菌的分子生物学鉴定结果BLAST分析52株深海来源真菌测序结果，检索相似性序列，结果表明，52株真菌分布在16个属，其中枝孢菌属(Cladosporium)比例最高，共有13株，占总数的25.00%；其次是曲霉属(Aspergillus)，共12株，占总数的23.08%；青霉属(Penicillium)有6株，占11.54%；踝节菌属(Talaromyces) 5株，占9.62%；其他属总共8株，占15.3% (图 1)。
从13个站位的13份沉积物样品中共分离出52株纯培养的真菌(图 2)，所有站位均能分离到至少1株真菌，其中A-F等6个样品采集自南海北部海域，从中一共分离得到31株深海真菌，归类于12个属，平均每个样品能分离到真菌5.17株，类属2个；G-M等7个样品采集自南海中南部海域，从中一共分离得到21株深海真菌，归类为8个属，平均每个样品能分离到3株，类属1.14个。由此初步可见，南海北部海域可培养深海真菌多样性明显高于南海中南部海域。从垂直分布角度看，在南海北部海域，随着深度的增加(样品A-F)，分离到的真菌数量和类群也有总体增加的趋势，其中E站位(654.5 m)处样品中分离到真菌属数最多，共有6个属，F站位(1 781 m)处样品中分离到的真菌数量最多，合计12株；在南海中南部海域，菌株分布与深度之间的关系没有南海北部海域明显，除G站位(933 m)外，各站位样品中分离到的菌株数量和类群基本一致，无明显差异。
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| 图 2 各样品中真菌的多样性和分布 Figure 2 The distribution and comparison of fungi diversity in different sample |
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对4种敏感指示菌的抑菌实验表明，32株真菌发酵液具有抑制至少1种指示菌的活性，其中8株对所有指示菌均有抑制作用，分别是FZQ001、FZQ014、FZQ025、FZQ028、FZQ031、FZQ032、FZQ045和FZQ052。阳性对照氯霉素对金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌等4株指示菌的抑菌圈直径分别为10.46、7.87、11.53和6.44 mm (表 2)。
| 菌株Strains | 金黄色葡萄球菌SA | 苏云金芽孢杆菌BM | 枯草芽孢杆菌BS | 大肠杆菌EC |
| FZQ001 | +++ | +++ | + | + |
| FZQ002 | - | - | - | - |
| FZQ003 | - | - | + | - |
| FZQ004 | + | - | - | - |
| FZQ005 | - | - | - | - |
| FZQ006 | - | - | - | - |
| FZQ007 | - | - | - | - |
| FZQ008 | + | + | - | + |
| FZQ009 | + | - | - | - |
| FZQ010 | - | - | - | - |
| FZQ011 | - | - | + | - |
| FZQ012 | - | - | + | - |
| FZQ013 | - | - | - | - |
| FZQ014 | ++ | +++ | ++ | + |
| FZQ015 | - | - | - | + |
| FZQ016 | +++ | - | - | - |
| FZQ017 | - | - | - | - |
| FZQ018 | - | - | - | - |
| FZQ019 | - | - | - | - |
| FZQ020 | + | - | + | - |
| FZQ021 | + | - | - | - |
| FZQ022 | - | - | - | - |
| FZQ023 | - | - | + | - |
| FZQ024 | + | + | + | - |
| FZQ025 | +++ | +++ | ++ | ++ |
| FZQ026 | ++ | ++ | - | - |
| FZQ027 | - | - | - | + |
| FZQ028 | +++ | +++ | +++ | ++ |
| FZQ029 | - | - | - | + |
| FZQ030 | - | + | - | - |
| FZQ031 | +++ | ++ | + | + |
| FZQ032 | + | + | + | + |
| FZQ033 | - | - | - | - |
| FZQ034 | - | - | - | - |
| FZQ035 | + | - | - | - |
| FZQ036 | - | - | - | + |
| FZQ037 | - | - | - | - |
| FZQ038 | - | - | + | + |
| FZQ039 | - | - | - | - |
| FZQ040 | + | - | + | - |
| FZQ041 | - | - | - | - |
| FZQ042 | - | - | + | - |
| FZQ043 | - | - | - | - |
| FZQ044 | - | - | - | - |
| FZQ045 | ++ | + | + | + |
| FZQ046 | - | - | - | + |
| FZQ047 | - | - | - | - |
| FZQ048 | - | - | - | - |
| FZQ049 | - | - | - | - |
| FZQ050 | + | - | - | - |
| FZQ051 FZQ052 | - + | - + | + + | - + |
| 氯霉素Chl | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ |
| 注：-：无抑制作用；+：抑菌圈为1-2 mm；++：抑菌圈为2-4 mm；+++：抑菌圈为4-6 mm；++++：抑菌圈≥6 mm. Note: -: No inhibition; +: Inhibition zone was 1-2 mm; ++: Inhibition zone was 2-4 mm; +++: Inhibition zone was 4-6 mm; ++++: Inhibition zone was ≥6 mm. | ||||
通过卤虫致死活性实验判断各真菌代谢产物粗提物的细胞毒活性。结果表明，23株菌的发酵产物呈现出一定强度的卤虫致死活性(IC50 < 500 μg/mL)，占供试菌株的44.23%，其中有2株活性较显著，分别为FZQ025和FZQ028，IC50为68.59 μg/mL和78.83 μg/mL (表 3)。
| 菌株 Strains |
活性评价Activity evaluation (μg/mL) | |
| 卤虫致死活性 BSL IC50 |
DPPH自由基清除活性 ABTS EC50 |
|
| FZQ001 | 262.49 | 15.24 |
| FZQ002 | > 500.00 | 134.51 |
| FZQ003 | > 500.00 | 101.27 |
| FZQ004 | > 500.00 | 189.47 |
| FZQ005 | > 500.00 | 195.90 |
| FZQ006 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ007 | > 500.00 | 212.33 |
| FZQ008 | 105.26 | 294.33 |
| FZQ009 | 400.36 | > 500.00 |
| FZQ010 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ011 | 226.86 | > 500.00 |
| FZQ012 | > 500.00 | 412.32 |
| FZQ013 | 479.95 | > 500.00 |
| FZQ014 | 102.44 | 75.79 |
| FZQ015 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ016 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ017 | 206.03 | 421.52 |
| FZQ018 | > 500.00 | 202.67 |
| FZQ019 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ020 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ021 | 335.72 | 446.13 |
| FZQ022 | 159.36 | 310.34 |
| FZQ023 | > 500.00 | 141.96 |
| FZQ024 | 169.05 | 66.57 |
| FZQ025 | 68.59 | 71.44 |
| FZQ026 | 262.52 | 348.76 |
| FZQ027 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ028 | 78.83 | 18.22 |
| FZQ029 | 450.36 | > 500.00 |
| FZQ030 | 238.30 | 476.82 |
| FZQ031 | > 500.00 | 37.90 |
| FZQ032 | > 500.00 | 29.85 |
| FZQ033 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ034 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ035 | 117.61 | 410.87 |
| FZQ036 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ037 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ038 | > 500.00 | 268.25 |
| FZQ039 | > 500.00 | 355.99 |
| FZQ040 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ041 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ042 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ043 | 160.12 | 323.55 |
| FZQ044 | 323.83 | 324.71 |
| FZQ045 | 207.19 | 50.07 |
| FZQ046 | 255.15 | > 500.00 |
| FZQ047 | 483.42 | 195.47 |
| FZQ048 | > 500.00 | 341.75 |
| FZQ049 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ050 | 244.54 | > 500.00 |
| FZQ051 | > 500.00 | > 500.00 |
| FZQ052 | 206.60 | 34.52 |
DPPH是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，可见光区最大吸收波长为517 nm，加入抗氧化剂后，部分自由基被清除，使吸收减弱，以此来评价样品抗氧化活性强弱[37]。实验结果表明，共有30株菌的发酵产物呈现出不同程度DPPH自由基清除活性(EC50 < 500 μg/mL) (表 3)，占供试菌株的57.69%；其中有9株活性显著，EC50低于100 μg/mL，分别是FZQ001、FZQ014、FZQ024、FZQ025、FZQ028、FZQ031、FZQ032、FZQ045和FZQ052，占总数的17.31%。阳性对照抗坏血酸的EC50为5.77 μg/mL。
2.6 菌株分布及其代谢产物活性关系研究初步表明，真菌代谢产物活性与其地域分布、种属呈现一定规律的联系。1 000 m以内站位样品中分离到的真菌代谢产物活性相对较低，例如B (460 m)、D (610.7 m)、G (933 m)等站位真菌代谢产物活性极差，多数没有或者仅表现出1种活性。但也并非站位越深，分离到的真菌代谢产物活性越强。有趣的是大部分活性显著的菌株均分离自中等深度的站位(1 000-2 000 m左右)，例如F站位(1 781 m)样品中分离到的真菌不仅数量类型多，而且代谢产物活性丰富，12株真菌中有6株具有抗菌、卤虫致死、DPPH自由基清除3种活性，明显优于其他站位。Ascomycota、Ochroconis、Pseudocercospora、Neosartorya等属真菌不仅数量少，代谢产物活性也差，前2者甚至在所有活性测试中均无作用；Cladosporium、Aspergillus属数量较多，不同菌株之间代谢产物活性差异较大，既有许多具有3种活性的菌株，也有少部分菌株在测试中无任何活性(图 3)。
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| 图 3 各样品中真菌分布与代谢产物活性关系 Figure 3 The relationship between fungal distribution and metabolite activities in different samples |
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南海深海沉积物环境蕴含着丰富多样的真菌资源，国内外对此来源真菌相关研究报道虽逐年增多，但依然较少，限制了对南海沉积环境来源真菌资源的进一步开发利用。本研究从来源于南海不同深海沉积环境的13份样品中分离得到的52株真菌，其ITS序列与数据库中已有真菌序列相似度均大于97%。初步形态学鉴定和ITS序列分析表明，所有真菌均属于子囊菌门，未见其他门的真菌，研究结果进一步验证了当前深海真菌类群分布特征[38]。通过传统培养方式分离得到的深海真菌中，绝大多数属于子囊菌门，少数属于担子菌门，而其他门真菌尚未成功分离，其原因可能是当前实验室内分离、培养条件尚不能充分模拟深海原位条件，例如温度、压力、黑暗等。
南海深海沉积物中的真菌物种丰富，多样性高，归类于16个属，其中枝孢菌属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)为优势菌群，分别占25.00%、23.08%和11.54%。冯丽等[23]利用平板涂布、低温诱导和高通量筛选等方法从南海沉积物中分离出12个属的真菌，其中枝孢菌属(Cladosporium)是最优势的属，其次是链格孢属(Alternaria)；曲佳等[22]利用平板涂布法从南海沉积物中分离得到的耐(嗜)盐真菌以曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)为主，分别占全部菌株的39.0%和12.2%，二者与本研究结果略有差异但基本一致，此差异性的出现可能与取样点深度和分离筛选方法有关。孙开明[39]利用平板涂布法从黄海山东沿岸的沉积物中分离出的真菌以青霉属最为广泛，与本研究结果不同，推测可能与海域差异性有关。除了上述三大优势菌群外，本研究获得的其他9个稀有属，如Talaromyces、Exophiala、Sarocladium、Fusarium、Phialophora、Neosartorya、Aureobasidium、Ascomycota和Oidiodendron等，通过对比研究发现，均在前人的研究中被报道过，但也有4个稀有种属目前在海洋环境中未见报道，如Neurospora、Ochroconis、Lacazia和Pseudocercospora等。综上所述，南海深海沉积物中具有丰富新颖的海洋真菌资源，值得进一步深入研究。
基于本研究结果，13个站位间的可培养真菌多样性存在较大差异，主要表现在水平分布和垂直分布两个方面。从水平分布上来说，南海北部海域(样品A-F)的可培养真菌多样性明显高于南海中南部海域(样品G-M)，这可能是因为南海北部靠近大陆，珠江、湄公河、湄南河等三大径流常年为其输送陆源物质，积累了大量富含营养盐的沉积物，适于真菌的生长。从垂直分布角度看，在南海北部海域(样品A-F)，分离的真菌数量类群与深度之间大体成正相关趋势，主要原因可能是站位越深，沉降积累沉积物的时间越长，营养物质也更加丰富。然而在南海中南部海域(样品G-M)，菌株数量类群与深度之间无明显关系，除G站位(933 m)外，各站位样品中分离到的菌株数量类群基本一致。Zhang等[9]对南海9个站位的深海沉积物中可培养的真菌进行了比对，同样发现各站位之间培养到的真菌多样性存在较大的差异。Rédou等[40]研究了海底表层以下，跨度达千米的沉积物中可培养真菌的组成，发现深度对真菌多样性有显著的影响。深海可培养真菌多样性和站位、深度之间的关系尚有待进一步研究。
活性评价结果表明，本研究中分离到的真菌代谢产物表现出不同强度的抑菌、细胞毒及抗氧化活性。在分离的52株真菌中，32株真菌的发酵产物具有抑制至少1种指示菌的活性，占总数的61.53%；23株具有一定强度的卤虫致死活性，占总数的44.23%；30株具有DPPH自由基清除活性，占总数的57.69%。Zhang等[9]从南海深海沉积物中分离得到27个真菌形态种，56%的菌株具有抗菌活性。熊枫等[6]从西太平洋近赤道区采集到的18个深海沉积物样品中分离得到83株海洋真菌，其中有37株菌株对至少1种指示菌有抑制作用，有29株菌株对KB或Raji肿瘤细胞具有显著的抑制活性，分别占总供测菌株的44.6%和34.9%，这与本研究结果基本吻合；张翼等[41]对44株海洋真菌(21株来自大连潮间带动植物或沉木，23株来自鲨鱼鳃部)的抗老年痴呆相关活性成分进行了筛选与追踪，发现32株菌的发酵产物具有DPPH自由基清除活性，占总数的72.73%，明显高于本研究结果，推测可能是由于深海缺氧环境导致代谢产物的差异。综合分析，本研究发现的菌株FZQ001、FZQ014、FZQ025、FZQ028、FZQ031、FZQ032、FZQ045和FZQ052等8株真菌的发酵产物在3项活性测试方面表现优异，可以作为潜在的目标活性菌株。其中，菌株FZQ025和FZQ028对4种指示菌的抑菌圈直径均大于4 mm，抗菌活性显著，卤虫致死活性IC50为68.59 μg/mL和78.83 μg/mL，DPPH自由基清除活性EC50为71.44 μg/mL和18.22 μg/mL，目前这2株真菌正在进行深入的次级代谢产物化学多样性及活性研究。
此外，本文还首次初步探讨了菌株地域分布、种属与其代谢产物活性之间的关系。研究表明，中等深度(1 000-2 000 m左右)处站位沉积物样品中的真菌代谢产物活性最为丰富，其次是底层深度(> 3 000 m)沉积物，表层(1 000 m以内)沉积物中真菌代谢产物活性最差。推测其原因可能有以下几点：(1)表层沉积物环境相对较为简单，与中底层沉积物复杂环境相比，缺乏特殊的条件来刺激诱导真菌产生丰富的生物活性；(2)底层沉积物环境受某种因素的限制，从而丧失某种特定的生物活性，比如缺氧环境可能导致深海真菌抗氧化活性较弱。真菌种属也影响其代谢产物活性，绝大部分稀有种属真菌代谢产物活性较差，例如Ascomycota、Ochroconis、Pseudocercospora、Neosartorya等。优势菌群Cladosporium、Aspergillus属的真菌代谢产物活性差异巨大，但大部分菌株活性均较为显著，仅有少量菌株在测试中未显示任何活性。目前，尚未见该类研究的报道。
4 结论本文对南海深海沉积环境中分离得到的52株真菌进行了初步鉴定，结果表明52株深海真菌分布在16个菌属，物种多样性较高，对不同站点分离的真菌进行比较，发现南海北部海域深海真菌多样性明显高于南海中南部海域，在南海北部海域随着深度的增加，可培养深海真菌数量及种类也随之增加；通过测试其发酵产物的抗菌、卤虫致死和DPPH自由基清除活性，筛选出具有抑制至少1种指示菌活性的菌株32株，其中对所有4种指示菌株均有抑制作用的菌株8株；具有一定强度卤虫致死活性的菌株23株，其中活性尤为显著的菌株2株；具有不同程度DPPH自由基清除活性的菌株30株，其中活性较强的菌株9株；最后初步探讨了菌株地域分布、种属与其代谢产物活性之间的关系，发现真菌代谢产物活性最为丰富的区域在中等深度(1 000-2 000 m左右)处的沉积物环境，类群主要集中在优势菌群Cladosporium、Aspergillus属。以上研究丰富了研究者对南海深海沉积物来源真菌多样性及其代谢产物活性的了解，为深海药源微生物发现提供资源保障，同时也为研究人员通过活性追踪方法、有目的深入开展其代谢产物化学多样性和活性研究提供指导。
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