2018, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 姜薇, 蒋航成, 韦歆, 徐家俊, 单体壮, 潘英
- JIANG Wei, JIANG Hang-Cheng, WEI Xin, XU Jia-Jun, SHAN Ti-Zhuang, PAN Ying
- 海洋真菌Aspergillus niger XJJ-3中萘并吡喃酮类化合物结构及生物活性
- Structures and activities of naphthopyrones from marine fungus Aspergillus niger XJJ-3
- 微生物学通报, 2018, 45(9): 1897-1903
- Microbiology China, 2018, 45(9): 1897-1903
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180148
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文章历史
- 收稿日期: 2018-02-27
- 接受日期: 2018-06-15
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2018-08-02
2. 江苏省肿瘤医院 江苏省肿瘤防治研究所 南京医科大学附属肿瘤医院 江苏 南京 210009;
3. 温州医科大学药学院 浙江 温州 325035
2. Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing, Jiangsu 210009, China;
3. School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325035, China
黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属真菌中的常见种，分布广泛，是食品工业中重要的发酵菌种。关于黑曲霉次生代谢产物研究方面，主要发现有生物碱[1-3]、聚酮[1]、混源萜[4]和萘并吡喃酮类化合物[3, 5-7]，其中萘并吡喃酮类化合物研究报道较多，是黑曲霉特征性代谢产物。萘并吡喃酮类化合物在陆源和海源的植物和微生物中均有发现，其中真菌来源较多，是一类真菌毒素[8]。该类化合物呈黄色粉末样，由1个萘环和1个吡喃酮环构成，根据3个环是否在一条直线上分为线型和角型，吡喃酮中酮羰基与氧原子相对位置的不同可分为α型(邻位)、β型(间位)和γ型(对位)，母核经还原、氧化、环化以及聚合可形成一系列衍生物。萘并吡喃酮类化合物生物活性多样，具有抗菌[9-11]、抗肿瘤[6, 12-14]、抗氧化活性[13]，对Taq DNA聚合酶[5]、酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶等多种酶也具有抑制活性[14]。
卤虫致死试验是一种测定杀死实验室培养的丰年虾幼虫能力的实验，用于测定真菌毒素、藻类毒素、植物毒素、重金属、杀虫剂和牙科材料的毒性，是初步评估毒性大小的有效手段[15]。本课题组对江苏如东近海滩涂未受生活垃圾污染的新鲜泥样进行了真菌分离，从中筛选出一株次生代谢产物丰富的海洋真菌A. niger XJJ-3，发现系列萘并吡喃酮单体和其二聚体化合物，其中有些化合物具有抗菌和抗卤虫活性。本文对该菌株的发酵、化合物提取分离、结构鉴定及生物活性测试等工作进行报道。
1 材料与方法 1.1 菌株海洋真菌XJJ-3分离自江苏如东近海新鲜滩涂泥样(采样时间为2015年10月)，经缪莉鉴定为黑曲霉Aspergillus niger，标本现存放于扬州大学海洋科学与技术研究所。
1.2 主要试剂和仪器分析级和色谱级的甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚，国药集团化学试剂有限公司。硅胶200-300目，阿拉丁公司；ODS 50 μm，YMC公司。核磁共振仪，Bruker公司；液相色谱仪，日立公司；Apollo RP-18 (5 μm，4.6 mm×250 mm)，Alltech公司；高效液相色谱仪，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；半制备色谱柱Kromasil RP-18 (10 mm×250 mm)，AkzoNobel公司；318-MC高速双波长酶标仪，上海新科公司。
1.3 培养基PDB培养基(g/L)：土豆200.0，葡萄糖20.0，海盐30.0。PDA培养基(g/L)：PDB培养基基础上加琼脂粉18.0。
LB培养基(g/L)：酵母膏5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂粉18.0。
1.4 菌株培养与规模化发酵从-80 ℃中取出保种的菌株，放置至室温，夹出含有菌丝的菌块贴放于PDA培养基上，28 ℃倒置培养3-5 d获得纯菌落。250 mL锥形瓶中装入100 mL的PDB液体培养基，1×105 Pa灭菌20 min，接种适量复苏好的菌落，28 ℃、120 r/min振荡培养3 d获得种子液。1 000 mL锥形瓶中装入40 g大米和3%人工海水溶液80 mL，1×105 Pa高压灭菌后，每瓶接8 mL种子液，接种100瓶，28 ℃静置培养40 d。
1.5 化合物的提取分离用含有5%丙酮的乙酸乙酯液浸泡提取3次，过滤，收集乙酸乙酯，减压浓缩得粗提物40 g。浸膏经硅胶减压柱色谱，石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，得到8个组分(Fr.A-H)，其中石油醚:乙酸乙酯为8:1 (体积比)洗脱下的Fr.B (5.3 g)经ODS减压柱，甲醇/水系统梯度洗脱，得到5个组分(Fr.B1-5），其中甲醇:水为85:15 (体积比)洗脱下来的Fr.B5 (1.8 g)经半制备HPLC纯化(流速1.5 mL/min，检测波长210 nm)，流动相为甲醇:水为85:15 (体积比)时得到化合物1 (JHC-1，100.0 mg，Rt=17′)和2 (JHC-2，100.0 mg，Rt=20′)，流动相为甲醇:水为80:20 (体积比)时得到化合物3 (JHC-3，10.0 mg，Rt=26′)、4 (JHC-4，7.0 mg，Rt=34′)、5 (JHC-5，5.0 mg，Rt=30′)和6 (JHC-9，7.0 mg，Rt=28′)。
1.6 抗菌活性测试测试菌种为Staphylococcus aureus ATCC43300、S. aureus ATCC33591、S. aureus ATCC25923、S. aureus ATCC29213、Enterococcus faecalis ATCC51299、E. faecium ATCC35667、Escherichia coli ATCC25922、Bacillus subtilis ATCC6633和Vibrio parahemolyticus ATCC17802。抗菌活性分析按微量稀释法进行[16]。将备好的细菌种子培养液(LB培养基)稀释为原来浓度的1/800。用DMSO将待测样品配成浓度8 mg/mL备用。取96孔板，在第1列的每孔中加195 μL菌液后加5 μL样品，其他孔加100 μL菌液，吸取100 μL第1列中混匀液加入第2列再混匀，依次往下加，作二倍递减浓度稀释至第7列，最后每个孔补齐200 μL，使样品的浓度从100 μg/mL梯度稀释至1.56 μg/mL。每个浓度设3个平行。设氨苄青霉素钠和万古霉素阳性对照，培养基空白对照组以及DMSO阴性对照，置28 ℃培养18-24 h，用酶标仪测600 nm吸光度，获得抑制率和最小抑菌浓度(MIC)。
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测试方法采用海水稀释法[17-18]，取100 mg卤虫(Artemia salina)虫卵置500 mL烧杯中，加入400 mL人工海水，28 ℃人工光照，充氧气孵化2 d得卤虫幼体备用。用DMSO将待测样品配成浓度8 mg/mL备用。取96孔板，第1列的每孔中加人工海水195 μL，剩余列的每孔中加人工海水100 μL。在第1列的每孔中加入待测样品5 μL，混匀，吸取100 μL到第2列，混匀，依次往下加，作二倍递减浓度稀释至第8列，最后一列取100 μL弃去。取100 μL含18–22个卤虫的人工海水加入到每孔中，使样品的浓度从100 μg/mL梯度稀释至0.78 μg/mL。每组设3个平行。设DMSO空白对照组。室温培养18 h，显微镜下计数卤虫死亡数目，计算校正死亡率和LC50。
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化合物1为淡黄色粉末，甲醇可溶，氯仿易溶。HR-ESI-MS给出准分子离子m/z 309.0751 [M+Na]+ (计算值为309.073 9)，确定其分子式为C16H14O5，不饱和度为10。化合物1的1H NMR谱有3组甲基信号，其中2组δH 4.00 (3H，s)和δH 3.93 (3H，s)为甲氧基上的甲基，δH 2.37 (3H，s)是连在烯碳上的甲基；低场区δH 14.96 (1H，s)提示结构中可能存在着受到去屏蔽作用的羟基；芳香区偶合常数为2.2 Hz的2个质子δH 6.40 (1H，d，J=2.2 Hz)和δH 6.59 (1H，d，J=2.2 Hz)，提示结构中可能存在间位偶合的苯环。13C NMR谱中δC 95–170有12个叔碳和季碳，δC 184.3 (s)是酮羰基碳，结合芳质子数，说明结构中至少含有2个苯环。前期文献调研发现萘并吡喃酮是黑曲霉的特征代谢产物。核磁数据符合萘并吡喃酮骨架特征，通过比对文献[10]，确定化合物1为Rubrofusarin B (图 1)。1H NMR (600 MHz，CDCl3)：δH 14.96 (1H，s，5-OH)，6.97 (1H，s，H-10)，6.59 (1H，d，J=2.2 Hz, H-9)，6.40 (1H，d，J=2.2 Hz，H-7)，6.00 (1H，s，H-3)，4.00 (3H，s，6-OCH3)，3.93 (3H，s，8-OCH3)，2.37 (3H，s，2-CH3)；13C NMR (150 MHz，CDCl3)：δC 184.3 (s，C-4)，167.4 (s，C-2)，162.7 (s，C-5)，161.5 (s，C-8)，160.7 (s，C-6)，153.3 (s，C-10a)，141.1 (s，C-9a)，108.4 (s，C-5a)，107.4 (d，C-3)，104.4 (s，C-4a)，101.1 (d，C-10)，97.8 (d，C-9)，97.3 (d，C-7)，56.1 (q，6-OCH3)，55.4 (q，8-OCH3)，20.7 (q，2-CH3)。
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| 图 1 化合物1-6的结构 Figure 1 Structures of compounds 1-6 |
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化合物2为淡黄色粉末，甲醇可溶，氯仿易溶。HR-ESI-MS给出与化合物1相同的分子式C16H14O5。化合物2和1的1H和13C NMR谱图非常相似，仅部分氢和碳的化学位移发生微小偏移，考虑化合物2可能是1的结构异构体。通过查阅文献[5]，确定化合物2为Flavasperone (图 1)。1H NMR (600MHz，CDCl3)：δH 12.80 (1H，s，5-OH)，6.87 (1H，s，H-6)，6.59 (1H，d，J=2.4 Hz，H-9)，6.40 (1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，6.28 (1H，s，H-3)，3.97 (3H，s，10-OCH3)，3.93 (3H，s，8-OCH3)，2.50 (3H，s，2-CH3)，13C NMR (150 MHz，CDCl3)：δC 182.9 (s，C-4)，166.6 (s，C-2)，161.4 (s，C-5)，159.0 (s，C-8)，156.6 (s，C-10)，155.8 (s，C-1a), 141.2 (s，C-6a)，110.4 (d，C-3)，108.8 (s，C-10a)，105.8 (d，C-6)，104.9 (s，C-4a)，97.9 (d，C-9)，97.0 (d，C-7)，55.9 (q，10-OCH3)，55.5 (q，8-OCH3)，20.5 (q，2-CH3)。
化合物3-6均为黄色粉末，甲醇可溶，氯仿易溶。HR-ESI-MS给出相同的分子式C32H26O10，不饱和度为20。这几个化合物的1H NMR谱图较为相似，都含有以下信号：dH 12.8-15.3间有2个极化程度很高的羟基活泼质子；δH 6.0-6.5间有4个烯质子，其中2个质子为单峰，另外2个质子构成苯环间位偶合的AX系统；δH 3.4-4.0间有4组甲氧基信号；dH 2.5附近有2组取代在双键上的甲基信号。将化合物3-6的1H NMR谱图与化合物1和2的1H NMR谱图进行比较，发现化合物3-6可能是化合物1或2的二聚体，此外化合物3-6在做1H NMR时发现只有化合物的样品量较大时方能采集到比较理想的谱图信号，预测其分子量相对较大。前期文献查阅获知萘并吡喃酮二聚体是A. niger的特征代谢产物。查阅分离自A. niger中含2个羟基、4个烯质子、4个甲氧基和2个甲基(位于双键上)的萘并吡喃酮二聚体波谱数据，通过比对文献，确定化合物3为Aurasperone A[8]，化合物4为Asperpyrones C[5]，化合物5为Asperpyrones B[5]，化合物6为Fonsecinone A[11]，结构见图 1。
Aurasperone A (3)，1H NMR (600 MHz，CDCl3)：δH 15.24 (1H，s，5′-OH)，14.83 (1H，s，5-OH)，7.15 (1H，s，H-10)，6.97 (1H，s，H-9)，6.41 (1H，d，J=2.0 Hz，H-9′)，6.21 (1H，d，J=2.0 Hz，H-7′)，6.05 (1H，s，H-3)，5.98 (1H，s，H-3′)，4.02 (3H，s，6′-OCH3)，3.78 (3H，s，8-OCH3)，3.62 (3H，s，8′-OCH3)，3.46 (3H，s，6-OCH3)，2.41 (3H，s，2-CH3)，2.12 (3H，s，2′-CH3)。
Asperpyrones C (4)，1H NMR (600 MHz，CDCl3)：δH 14.75 (1H，s，5-OH)，13.11 (1H，s，5′-OH)，7.13 (1H，s，H-10)，6.98 (1H，s，H-9)，6.42 (1H，d，J=2.0 Hz，H-9′)，6.32 (1H，s，H-3′)，6.26 (1H，d，J=2.0 Hz，H-7′)，6.03 (1H，s，H-3)，4.00 (3H，s，10′-OCH3)，3.81 (3H，s，8-OCH3)，3.64 (3H，s，6-OCH3)，3.61 (3H，s，8′-OCH3)，2.54 (3H，s，2′-CH3)，2.40 (3H，s，2-CH3)。
Asperpyrones B (5)，1H NMR (600 MHz，CDCl3)：δH 13.18 (1H，s，5′-OH)，12.81 (1H，s，5-OH)，7.04 (1H，s，H-6)，6.98 (1H，s，H-7)，6.44 (1H，d，J=2.0 Hz，H-9′)，6.33 (1H，s，H-3′)，6.31 (1H，s，H-3)，6.20 (1H，d，J=2.0 Hz，H-7′)，4.00 (3H，s，10′-OCH3)，3.80 (3H，s，8-OCH3)，3.61 (6H，s，8′-OCH3 and 10-OCH3)，2.55 (3H，s，2′-CH3)，2.48 (3H，s，2-CH3)。
Fonsecinone A (6)，1H NMR (600 MHz，CDCl3)：δH 15.24 (1H，s，5′-OH)，12.83 (1H，s，5-OH)，7.06 (1H，s，H-6)，6.97 (1H，s，H-7)，6.42 (1H，d，J=2.0 Hz，H-9′)，6.33 (1H，s，H-3)，6.17 (1H，s，H-7′)，6.00 (1H，s，H-3′)，4.03 (3H，s，6′-OCH3)，3.78 (3H，s，8-OCH3)，3.61 (3H，s，8′-OCH3)，3.42 (3H，s，10-OCH3)，2.48 (3H，s，2-CH3)，2.12 (3H，s，2′-CH3)。
2.2 抗菌活性测定结果抗菌活性按微量稀释法进行，MIC数值见表 1。由于化合物1-6对测试菌S. aureus ATCC43300、25923、B. subtilis ATCC6633、E. coli ATCC25922和E. faecalis ATCC51299的MIC数值均 > 350 μmol/L，这5株测试菌的结果未列在表 1中。化合物2、4和5对金黄色葡萄球菌S. aureus ATCC33591的最小抑制浓度分别为43.7、21.9和87.7 μmol/L；对S. aureus ATCC29213的最小抑制浓度分别为174.8、43.9和87.7 μmol/L。对于屎肠球菌E. faecium ATCC35667的最小抑制浓度，化合物1和2为87.4 μmol/L，化合物3为21.9 μmol/L，化合物4和5均为43.9 μmol/L。化合物1、2和4对副溶血性弧菌V. parahemolyticus ATCC17802最小抑制浓度分别为174.8、174.8和87.7 μmol/L。
| Compound | MIC | LD50 | ||||
| SA1 | SA2 | EF | VP | AS | ||
| 1 | > 350 | > 350 | 87.4 | 174.8 | 244.7 | |
| 2 | 43.7 | 174.8 | 87.4 | 174.8 | 35.0 | |
| 3 | > 175.4 | > 175.4 | 21.9 | > 175.4 | 8.8 | |
| 4 | 21.9 | 43.9 | 43.9 | 87.7 | 87.7 | |
| 5 | 87.7 | 87.7 | 43.9 | > 175.4 | 87.7 | |
| 6 | > 175.4 | > 175.4 | 43.9 | > 175.4 | 122.8 | |
| AM | 67.3 | 33.7 | < 4.0 | < 4.0 | ||
| VM | < 1.1 | < 1.1 | < 1.1 | < 1.1 | ||
| Note: SA1=S. aureus ATCC33591; SA2=S. aureus ATCC29213; EF=E. faecium ATCC35667; VP=V. parahemolyticus ATCC17802; AS=A. Salina; AM=Ampicillin sodium; VM=Vancomycin. | ||||||
卤虫致死活性按海水稀释法进行，LD50数值见表 1。化合物1–6均表现出一定的卤虫致死活性，其半数致死浓度分别为244.7、35.0、8.8、87.7、87.7和122.8 μmol/L。
3 讨论与结论DAD-HPLC、LC-MS和1H NMR均能很好地辨识萘并吡喃酮类化合物，也均可用于此类化合物的导向分离，但由于该类化合物在TLC可见光下即有成点性很好的黄色斑点，粗样中又不存在类似斑点的其它类型化合物，从操作的便捷性和实验成本等方面综合考虑，TLC是指导分离这类化合物最好的方法。TLC分析(流动相为氯仿:甲醇=20:1) Rf=0.1-0.9处密布黄色可见光斑点，说明本文中的海洋真菌A. niger能够代谢结构非常丰富的萘并吡喃酮类化合物，这与文献[3, 5-14]报道吻合。我们前期从发酵产物的较低极性段中分离出化合物1-6，更多的萘并吡喃酮类化合物分离和活性分析工作还在进行中。这类化合物由于母核上存在较多的取代位点，取代基以及氧化还原程度的不同，导致其极性分布相对较广，貌似分离难度不大，但事实是TLC上相近或者同一比移值处却存在多个结构异构的同分异构体(如本文中的化合物1和2，化合物3-6)，分离还存在一定的难度。此外这类化合物二聚体的分子量相对较大，需要较多的样品量才能采集到理想的核磁信号，因此许多微量的化合物还有待进一步积累样品量后，再确定其具体结构。
抗菌活性测试发现化合物1-6对测试菌S. aureus ATCC43300、25923、B. subtilis、E. coli ATCC25922和E. faecalis ATCC51299均无抑制活性，对S. aureus ATCC33591、29213、E. faecium ATCC35667和V. parahemolyticus表现出不同程度的抑制活性，其中化合物2和4对S. aureus ATCC33591表现出较强抑制活性，化合物3对E. faecium ATCC35667抑制活性较强。卤虫致死活性发现化合物1-6均表现出一定的卤虫致死活性，其中化合物2和3活性显著，提示化合物1-6具有不同程度的细胞毒活性。因此设计了体外肿瘤细胞毒试验，运用MTT法考察化合物1-6对Hela、Hep-2、MGC803、BGC823和AGS这5株肿瘤细胞株是否也同样具有细胞毒活性，但得出的数据不具有可重复性，具体原因还有待进一步实验和分析。
本研究从真菌A. niger中分离得到单体和二聚体的萘并吡喃酮类化合物，发现该类物质具有不同程度的抗菌和抗卤虫活性。本实验结果可为抗菌和细胞毒类药物的研发提供一定的依据和参考。
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