2018, Vol. 45扩展功能
文章信息
- 林筱钰, 刘增智, 侯路宽, 刘晶, 李花月, 朱伟明, 李文利
- LIN Xiao-Yu, LIU Zeng-Zhi, HOU Lu-Kuan, LIU Jing, LI Hua-Yue, ZHU Wei-Ming, LI Wen-Li
- 海洋来源链霉菌OUCMDZ-3434中wblA基因的功能
- Functions of the wblA gene in marine-derived Streptomyces sp. OUCMDZ-3434
- 微生物学通报, 2018, 45(9): 1889-1896
- Microbiology China, 2018, 45(9): 1889-1896
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180438
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文章历史
- 收稿日期: 2018-06-01
- 接受日期: 2018-06-08
- 网络首发日期(www.cnki.net): 2018-07-17
海洋链霉菌凭借其巨大的生物合成潜力在微生物种群中占据重要地位，其次级代谢产物具有多种生物活性，如抗菌、抗肿瘤以及抗氧化活性等[1]。Streptomyces sp. OUCMDZ-3434是一株分离自山东青岛栈桥浒苔样品的海洋链霉菌，其发酵产物中含有类型丰富的Wailupemycin类化合物，其α-糖苷酶抑制活性明显优于阿卡波糖[2]，但产量较低，影响了其进一步开发应用。
链霉菌具有复杂的发育及形态分化过程，能够产生多种次级代谢产物，为了适应生长环境中温度、pH值、营养条件等变化，链霉菌需要复杂的调控网络对外界环境变化做出反馈[3]。调控因子对基因表达的调控作用主要分为途径特异性调控以及全局性调控两种。途径特异性调控基因通常位于次级代谢产物生物合成基因簇中，对该基因簇编码产物的合成具有调控作用[4]。全局性调控基因大多位于基因簇外，能够将对外界环境反馈的信号传递给不同的途径特异性调控基因，从而调控多个代谢途径[5]。在全局性调控基因中，WhiB-like (Wbl)家族的wblA在不同的链霉菌中参与了多种次级代谢产物的生物合成以及形态分化的调控[6]。例如，在天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)中wblA是一个负调控因子，阻断wblA基因后，放线紫红素Actinorhodin的产量增多，突变株的气生菌丝变为红色，产孢能力减弱[7]；通过阻断Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66中的wblAso基因，一个Ⅲ型PKS生物合成基因簇被激活，在该突变株中分离到了具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的次级代谢产物——Violapyrone B，并且该突变株丧失了产生孢子的能力[8]。
在我们的前期研究中，通过对Streptomyces sp. OUCMDZ-3434全基因组测序及生物信息学分析，发现其基因组中含有一个wblA基因，推测该基因对OUCMDZ-3434的次级代谢产物具有调控作用。为进一步明确其功能，实验建立了Streptomyces sp. OUCMDZ-3434的遗传转化系统，并通过敲除其wblA基因，研究了wblA基因对Streptomyces sp. OUCMDZ-3434次级代谢与形态分化的影响。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒本研究所用菌株、质粒及其特性参见表 1。Streptomyces sp. OUCMDZ-3434分离自山东青岛栈桥浒苔样品[2]。大肠杆菌ET12567/pUZ8002[10]和E. coli BW25113/pIJ790[11]为常用工程菌。
| 菌株/质粒 Strain/plasmids |
相关特性 Correlation characteristics |
来源或参考文献 Reference or source |
| Streptomyces sp. OUCMDZ-3434 | 野生株 OUCMDZ-3434 wild type strain |
[2] |
| LX01 | 野生株含有pSET152质粒 OUCMDZ-3434 harboring pSET152 |
本研究This study |
| LX02 | wblA双交换阻断突变株 OUCMDZ-3434 wblA gene inactivation mutant |
本研究This study |
| DH5α | supE44, ΔlacU69 (Ψ80lacZΔM15), hsdR17, recA, endA1 | Stratagene |
| BW25113 | K12 derivative: ΔaraBAD，ΔrhaBAD | [9] |
| ET12567 | (dam- dcm- hsdM-), CmR | [9] |
| pIJ773 | aac(3)Ⅳ(AprR), oriT | [10] |
| pSET152 | aac(3)Ⅳ, int, oriT, attP | [10] |
| WB | 含有wblA DNA片段的Cosmid Cosmid harboring wblA |
本研究This study |
| WBΔwblA | WB中wblA基因被AprR取代的重组Cosmid WB with wblA replaced by AprR |
本研究This study |
常用培养基LB、TSBY、MS配方参见文献[11]。发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉10.0，酵母膏10.0，葡萄糖20.0，牛肉膏3.0，玉米膏4.0，KH2PO3 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO3 2.0，海水素30.0，调节pH值至7.0。
1.3 主要试剂和仪器Taq聚合酶，TIANGEN公司；DNA胶回收试剂盒，OMEGA公司；阿普拉霉素(Apramycin，Apr)、卡那霉素(Kanamycin，Km)、萘啶酮酸(Nalidixic Acid，NA)、氯霉素(Chloramphenicol，Cm)、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)、四环素(Tetracycline，Tet)、硫链丝菌素(Thio)等，生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR引物合成和测序工作由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成，本研究所使用的引物见表 2。化合物Wailupemycin G标准品由中国海洋大学朱伟明老师实验室提供。生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；冷冻离心机，Thermo公司。
| 引物 Primer pairs |
序列 Sequence (5′→3′) |
描述 Description |
| WBSF | GACGACGAGTCCATCAACAACG | 基因文库筛选引物 Primers for gene library screening |
| WBSR | GCCGACTCCTGTTCCTACTGC | |
| APRF | GTGCAATACGAATGGCGAA | aac(3)Ⅳ验证引物 Primers for aac(3)Ⅳ confirmation |
| APRR | TCAGCCAATCGACTGGCG | |
| WBMF | GCAGCCGCGCGTAGACCTCGCGGTCGTCGGCGGTCAGTGATTCCGGGGATCCGTCGACC | wblA阻断引物 Primers for wblA gene inactivation |
| WBMR | CGAGCGCTTGTTTCCCATGAGAGGCAGCCTAATCCGTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC | |
| WBCF | ATGAGAGGCAGCCTAATCCGTC | wblA突变株验证引物 Primers for wblA mutant verification |
| WBCR | GCTCTAGACTAGCCGACGGCG |
将Apr、Km、NA、Cm、Tet等多种抗生素分别配置成储备浓度，取一定量加入到MS固体培养基中，在含有不同浓度抗生素的培养基上培养Streptomyces sp. OUCMDZ-3434，每个浓度做3个平行对照，置于30 ℃培养箱中培养3-5 d观察菌株的生长情况。
1.4.2 大肠杆菌与Streptomyces sp. OUCMDZ-3434属间接合转移方法建立属间接合转移具体操作参考文献[10]。转接ET12567/pUZ8002/pSET152菌株于添加100 μg/mL Km、25 μg/mL Cm、25 μg/mL Tet和50 μg/mL Apr的50 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min培养至OD600约为0.6，4 ℃、12 000 r/min离心10 min收集菌体，用LB液体培养基等体积洗涤2次，收集菌体悬浮于200 μL LB液体培养基中备用。刮取生长在MS固体培养基上的Streptomyces sp. OUCMDZ-3434链霉菌孢子，悬浮于1 mL TSBY液体培养基中热激，30 ℃萌发后与大肠杆菌混合涂布于MS固体培养基上，30 ℃培养12-24 h后覆盖NA 25 μg/mL和Apr 20 μg/mL，30 ℃继续培养3-5 d，通过抗生素筛选到正确的接合子后将其转接到MS固体平板上培养。接合转移效率=(接合子数×稀释倍数)/孢子数。
1.4.3 wblA基因阻断突变株的构建及验证本研究中基因阻断采用的是PCR-Targeting方法[11]。从接合转移平板上挑取接合子分别对应接种在只含有Apr的MS单抗平板和含有Apr和Km的MS双抗平板上，目的基因被成功替换的基因阻断突变株会在单抗平板上生长，在双抗平板上不生长。提取双交换基因阻断突变株的基因组DNA，进一步用基因敲除验证引物进行PCR验证，若wblA基因被成功替换则PCR产物片段大小为1.7 kb，若wblA基因未被替换则PCR产物片段大小为1.1 kb。
1.4.4 Wailupemycin G标准曲线的确立配制10 mg/mL Wailupemycin G甲醇溶液，用甲醇将其进行梯度稀释后HPLC分析，使Wailupemycin G的进样量分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μg，根据不同进样量相对应的峰面积建立标准曲线。
1.4.5 基因阻断突变株发酵高效液相色谱及质谱检测刮取适量成熟孢子接种至发酵培养基中，30 ℃、220 r/min振荡培养8 d，发酵后离心分离上清和菌体。菌体用丙酮浸泡，超声辅助裂解后低压蒸干；上清发酵液用等体积乙酸乙酯萃取2遍，低压蒸干。将2种蒸干产物混合以1.5 mL甲醇溶解，经0.22 μm滤膜过滤进行HPLC分析。HPLC系统为Agilent 1260 Infinity，检测器为1260 DAD VL，质谱仪型号为Q-TOF Ultima Global GAA076，色谱柱为YMC-PACK ODS-AQ C-18 (5 μm、12 nm、150 mm× 4.6 mm)，流动相为A相：甲醇(0.1 %甲酸)；B相：ddH2O (0.1 %甲酸)，流速为1 mL/min。HPLC程序：0-5 min，A相20%，B相80%；5 min-45 min，A相由20%梯度增加至100%，B相由80%降至0；45 min-55 min，A相100%清洗色谱柱。
1.4.6 常规分子生物学操作大肠杆菌感受态的制备、转化和链霉菌DNA的提取参照文献[12]进行，质粒抽提采用碱裂解法。电转化条件为2.5 kV，5 ms。接合转移方法建立验证PCR条件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，25个循环；72 ℃ 5 min。wblA基因阻断突变株验证PCR条件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，25个循环；72 ℃ 5 min。
2 结果与分析 2.1 Streptomyces sp. OUCMDZ-3434遗传转化系统的建立 2.1.1 抗生素敏感性实验首先对Streptomyces sp. OUCMDZ-3434进行抗生素敏感性测定。结果显示，OUCMDZ-3434对Amp和NA不敏感，在抗生素浓度较高(30 μg/mL)的培养基上生长不受任何抑制；培养基中含有5 μg/mL Apr、Km或Tet时能够完全抑制菌体的生长；而Thio和Cm在浓度2 μg/mL时就能完全抑制生长。以上结果表明Streptomyces sp. OUCMDZ-3434对Apr、Km、Tet、Thio和Cm敏感，其相应的抗性基因可以作为遗传转化系统的标记基因。
2.1.2 接合转移条件的确立根据Streptomyces sp. OUCMDZ-3434抗生素敏感性实验结果，选取阿普拉霉素抗性基因作为遗传操作系统的选择性标记基因。针对接合转移过程中的热激温度、热激时间、复苏时间、大肠杆菌和链霉菌供受体比例、抗性覆盖时间进行条件摸索：设置40、45、50、55 ℃四个热激温度梯度，每个温度分别处理5、10、15 min，将热激处理后的孢子于30 ℃培养箱中分别复苏孵育1、2、3、4 h。保持Streptomyces sp. OUCMDZ-3434孢子量不变，分别与菌体量为孢子量1、10、100倍的ET12567/pUZ8002/pSET152混合，然后分别涂布于添加20 mmol/L MgCl2的MS及不添加MgCl2的MS固体培养基上，30 ℃分别培养12、18、24 h后覆盖25 μg/mL NA和20 μg/mL Apr，30 ℃继续培养至长出接合子。最终确定OUCMDZ-3434接合转移最佳培养基为添加20 mmol/L MgCl2的MS；孢子热激条件为50 ℃，10 min；热激后30 ℃复苏孵育3 h进行萌发；Streptomyces sp. OUCMDZ- 3434孢子量与大肠杆菌数量比例为1:10混合涂布，30 ℃培养约18 h后气生菌丝长出，覆盖25 μg/mL NA和20 μg/m Apr。继续培养2-3 d后长出接合子，接合转移效率为6.4×10-5。
2.2 wblA生物信息学分析Streptomyces sp. OUCMDZ-3434中wblA基因大小为1 029 bp，与许多链霉菌来源的Wbl家族转录调控因子具有较高的同源性。通过比对分析发现，它与Streptomyces coelicolor A3(2) (AJ239085.1)、Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66 (KU534996.1)和Streptomyces alboflavus MDJK44 (ARX85285.1)的Wbl家族转录调控因子的基因序列一致性分别为96%、89%和82%。WblA在N端具有一个高度保守且能结合“铁-硫”簇蛋白的Cys-X21-Cys-X2- Cys-X5-Cys结构域，这是Wbl家族转录调控因子典型的特征。进一步将以上4个WblA的氨基酸序列进行了同源比对(图 1)。结果表明OUCMDZ-3434中wblA基因与其他同源基因一致，都含有Cys-X21-Cys-X2-Cys-X5-Cys结构域。
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| 图 1 WblA与其同源基因序列比对 Figure 1 Alignment of WblA with its orthologues 注：红色框内为Cys残基. Note: The conserved Cys residues were labeled in red frame. |
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根据基因序列在wblA基因前后设计特异性引物WBSF/WBSR，通过PCR的方法对基因组文库进行筛选，筛选得到阳性Cosmid后进行末端测序确认其边界，阳性Cosmid WB能够完整包括wblA基因，适合进行下一步的遗传操作。
2.3.2 wblA基因敲除将包含wblA基因的阳性Cosmid WB电转入大肠杆菌BW25113/pIJ790中，获得BW25113/pIJ790/WB。采用PCR-Targeting策略，以质粒pIJ773中的aac3(Ⅳ)抗性片段作为替换目的基因的筛选标记，37 ℃培养并用Apr筛选得到重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，得到ET12567/pUZ8002/WBΔwblA。利用建立的大肠杆菌与Streptomyces sp. OUCMDZ-3434接合转移的方法将重组质粒导入Streptomyces sp. OUCMDZ-3434，通过MS/Apr和MS/Apr+Km的平板进行单双抗筛选获得接合子，进一步提取接合子基因组DNA，并以Streptomyces sp. OUCMDZ-3434野生型菌株基因组DNA作为对照，用WBCF/WBCR为引物进行PCR验证。图 2B为双交换同源重组示意图与突变株PCR验证图，结果表明野生型菌株相应的PCR扩增条带为1.1 kb，而双交换突变株相应的PCR扩增条带为1.7 kb，与预期结果一致，证明wblA基因的双交换阻断突变株构建成功，命名为LX02。
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| 图 2 同源重组示意图(A)及阻断突变株PCR验证图(B) Figure 2 Construction of ΔwblA gene mutant (A) and PCR confirmation (B) 注：M：1 kb DNA标准Marker；W：野生型菌株Streptomyces sp. OUCMDZ-3434；Mutant：wblA基因的阻断突变株LX02. Note: M: 1 kb DNA standard marker; W: Streptomyces sp. OUCMDZ-3434 wild-type strain; Mutant: wblA disruption mutant LX02. |
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分别将突变株LX02和野生型菌株Streptomyces sp. OUCMDZ-3434转接至MS固体培养基上，30 ℃培养3 d，观察二者表型。结果显示野生型菌株产孢良好，而突变株不产孢子(图 3A)。进一步在光学显微镜下观察，野生型菌株产生孢子链和孢子，而突变株中只有菌丝，未观察到孢子链和孢子产生(图 3B)。该结果表明，wblA基因的敲除影响Streptomyces sp. OUCMDZ-3434的孢子形成。
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| 图 3 野生型菌株和突变株培养特征(A)及菌丝、孢子链形态观察(B) Figure 3 Phenotypes of Streptomyces sp. OUCMDZ-3434 and LX02 on MS plates (A) and their morphological graphs under optical microscope (B) |
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将野生型菌株Streptomyces sp. OUCMDZ-3434和突变株LX02在相同条件下进行发酵，对发酵产物进行HPLC分析，检测wblA基因敲除后突变株发酵产物的变化。以Wailupemycin G的质量为横坐标，以293 nm波长下的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线及峰面积计算可得野生型菌株中Wailupemycin G的产量为2.2 mg/L，基因阻断突变株中Wailupemycin G的产量为8.9 mg/L，与野生型菌株相比突变株中Wailupemycin G的产量提高了3倍(图 4 B)，推测wblA基因对Wailupemycin类化合物的合成具有负调控作用。
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| 图 4 双交换阻断突变株发酵产物HPLC结果(A)、Wailupemycin G的紫外吸收(B)及Wailupemycin G的高分辨质谱分析(C) Figure 4 HPLC traces of the fermentation broths from Streptomyces sp. OUCMDZ-3434 (A), UV spectrum of wailupemycin G (B), HRMS analysis of wailupemycin G (C) 注：Ⅰ：Wailupemycin G标准品；Ⅱ：野生型菌株Streptomyces sp. OUCMDZ-3434；Ⅲ：wblA基因的阻断突变株LX02. Note: Ⅰ: Wailupemycin G; Ⅱ: Streptomyces sp. OUCMDZ-3434 wild-type strain; Ⅲ: wblA inactivation mutant LX02. |
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Streptomyces sp. OUCMDZ-3434能够产生具有良好α-糖苷酶抑制活性的Wailupemycin类化合物，但该类化合物产量较低，限制了后续研究进展。本文成功建立了Streptomyces sp. OUCMDZ-3434的遗传转化系统。利用所建立的遗传转化系统成功敲除了调控基因wblA，wblA基因阻断突变株中Wailupemycin G的产量提高3倍，同时该突变株丧失了产孢能力。在已知的Wbl家族转录调控子中，WblA通常对菌株的次级代谢有调控作用并能够影响菌株的形态分化过程。例如在Streptomyces coelicolor A3(2)中wblA对Actinorhodin的生物合成起负调控作用[6]；wblA基因对Streptomyces ansochromogenes的形态分化有影响并且对其次级代谢产物Nikkomycins的生物合成具有正调控作用[13]。在本研究对象Streptomyces sp. OUCMDZ-3434中，wblA基因的阻断使Wailupemycin G产量提高，推测wblA对Wailupemycins生物合成途径起到负调控的作用。本研究结果为进一步进行Wailupemycin类化合物的生物合成的研究提供了基础。
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